Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

Tricia H. Smith; Joy Ngwainmbi; John R. Grider; William L. Dewey; Hamid I. Akbarali

doi:10.3791/50688

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Artículo de método

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DOI:

10.3791/50688

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7 de agosto de 2013

Tricia H. Smith¹ , Joy Ngwainmbi¹ , John R. Grider² , William L. Dewey¹ , Hamid I. Akbarali¹

¹Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, ²Physiology and Biophyics, Virginia Commonwealth University

En este artículo

Resumen

Demostramos un protocolo de cultivo celular para el estudio directo de los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso entérico. Se prepara un cultivo mixto de neurona/glía en cubreobjetos a partir del plexo mientérico de un ratón adulto, lo que proporciona la capacidad de examinar la función individual de las neuronas y la glía mediante electrofisiología, inmunohistoquímica, etc.

Resumen

El sistema nervioso entérico es una vasta red de neuronas y glía que recorren la longitud del tracto gastrointestinal que funcionalmente controla la motilidad gastrointestinal. Se describe un procedimiento para el aislamiento y cultivo de una población mixta de neuronas y células gliales del plexo mientérico. Los cultivos primarios se pueden mantener durante más de 7 días, con conexiones en desarrollo entre las neuronas y la glía. La tira de músculo longitudinal con el adjunto del plexo mientérico se extrae del músculo circular subyacente del íleon o colon del ratón y se sometió a digestión enzimática. En condiciones estériles, la población de neuronas y glía aislado se conservan dentro del sedimento después de la centrifugación y se sembró en cubreobjetos. Dentro de 24 a 48 horas, neuritas se produce y las neuronas se pueden identificar por marcadores pan-neuronal. Después de dos días en cultivo, aisladas neuronas potenciales de acción del fuego como se observa en los estudios de patch clamp. Por otra parte, la glía entérico también puede ser identifdiado por tinción GFAP. Una red de neuronas y células gliales en estrecha aposición se forma dentro de 5 - 7 días. Neuronas entéricas pueden ser individualmente y estudiado directamente utilizando métodos tales como la inmunohistoquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio, y la PCR de una sola célula. Por otra parte, este procedimiento se puede realizar en animales modificados genéticamente. Esta metodología es simple de realizar y de bajo costo. En general, este protocolo expone los componentes del sistema nervioso entérico de una manera fácil de manipular por lo que podemos descubrir mejor la funcionalidad de la ENS en estados normales y de enfermedad.

Introducción

El sistema nervioso entérico (ENS) es vasta red de nervios y glía que recorre toda la longitud del tracto gastrointestinal (GI). La ENS controla funcionalmente todos los aspectos de la digestión, incluyendo el peristaltismo, la absorción / secreción de fluidos, sensación de estímulos, etc (para revisión ver ^1). Contiene más de 500 millones de neuronas, más que las encontradas en la médula espinal, y contiene todas las clases neurotransmisor encontrado en el cerebro. Por otra parte, la ENS es única, ya que puede funcionar sin reflejo de entrada desde el sistema nervioso central ^2. La comprensión de la ENS es crucial, no sólo para compren....