Summary
في هذه المادة ونحن تصف الإجراء التجريبي الكامل لإعادة بناء، مع ارتفاع القرار، وتشريح الدماغ غرامة من أدمغة فئران fluorescently المسمى. ويشمل البروتوكول وصف إعداد العينات وتبادل المعلومات، وعينة تصاعد التصوير، وبعد تجهيز البيانات والتصور متعددة النطاق.
Abstract
فهم بنية الدماغ في الثدييات في القرار وحيدة الخلية هي واحدة من القضايا الرئيسية في علم الأعصاب. ومع ذلك، ورسم خرائط سوما الخلايا العصبية والتوقعات في جميع أنحاء الدماغ كله لا يزال تحديا لتقنيات التصوير وإدارة البيانات. في الواقع، تحتاج كميات العيانية من أجل إعادة بنائها مع ارتفاع القرار والتباين في فترة زمنية معقولة، وإنتاج قواعد البيانات في نطاق تيرابايت. أثبتنا في الآونة الأخيرة أسلوب البصرية (متحد البؤر المجهري ورقة ضوء، CLSM) قادرة على الحصول على إعادة الإعمار ميكرون النطاق من أدمغة فئران بأكمله المسمى مع بروتين الفلورية الخضراء المعززة (EGFP). الجمع بين الإضاءة ورقة الضوء والكشف متحد البؤر، CLSM يسمح التصوير في عمق عينات مسح العيانية مع التباين العالي والسرعة. نحن هنا وصف خط أنابيب تجريبية كاملة للحصول على صور شاملة وقابلة للقراءة الإنسان من أدمغة فئران بأكمله المسمى مع البروتينات الفلورية. المقاصة وع المتصاعدةموصوفة rocedures، جنبا إلى جنب مع خطوات لإجراء التصوير المقطعي البصري على حجمه كله من خلال الحصول على العديد من مداخن المجاورة موازية. أظهرنا استخدام المصدر المفتوح حسب الطلب أدوات البرمجيات تمكين خياطة من مداخن متعددة وبيانات الملاحة متعدد القرار. وأخيرا، فإننا يتضح بعض الأمثلة على خرائط الدماغ: المخيخ من الماوس L7-GFP المعدلة وراثيا، والتي كل الخلايا العصبية وصفت بشكل انتقائي، والدماغ كله من الماوس thy1-GFP-M، تتميز عشوائي لوضع العلامات العصبية متفرق.
Introduction
بالمقارنة مع فهمنا للآليات الجزيئية والخلوية وظيفة الدماغ الأساسية، معرفتنا التشريح العصبي غرامة يبدو لا تزال في مهدها 1. في الواقع، ونحن لا تزال تفتقر إلى خرائط شاملة للموقف somata العصبية أو من التوقعات طويلة المدى في جميع أنحاء الدماغ. في الواقع، وتكرس الكثير من الجهود لإعادة بناء التكنولوجية مخ الفأر لقرار المجهرية. وسائل بصرية على أساس باجتزاء المسلسل العينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج، والسكين الضوئي المجهري (KESM) 2، مايكرو الضوئية باجتزاء التصوير المقطعي (MOST) 3 ومضان معظم (fMOST) 4، ويمكن أن توفر الفرعية ميكرون القرار ثلاثية الأبعاد تصوير أدمغة فئران بأكمله. ومع ذلك، فإن إجمالي الوقت اللازم لإعداد والتصوير من عينة واحدة هو من أجل من عدة أسابيع، مما يحد من التطبيق العملي لمثل هذه الأساليب. أسلوب آخر يعتمد على باجتزاء المسلسل (ولكن دون الراتنج التضمين)، المسلسل من غرفتيالفوتون التصوير المقطعي (STP) 5، ويسمح عالية الدقة ثلاثية الأبعاد التصوير. ومع ذلك، فقد ثبت هذا الأسلوب في أدمغة فئران كاملة فقط مع عينة ضئيلة جدا، وجمع كل قسم 1 5 50 ميكرومتر، وعلى حد علمنا STP لم تؤد بعد إعادة بناء كامل أخذ العينات من دماغ الفئران.
وهناك طريقة البصرية المتطورة لإعادة العينات كلها في ثلاثة أبعاد بسرعة عالية هو ضوء ورقة المجهري 6. في هذا المخطط الضوئية مضاءة العينة مع ورقة رقيقة من الضوء ويتم جمع الانبعاثات مضان على طول محور عمودي على الطائرة الإضاءة. بهذه الطريقة فقط في التركيز fluorophores متحمسون وأنه من الممكن لتحقيق باجتزاء البصرية في تكوين حقل واسع، وضمان ارتفاع معدلات الإطار. عندما يقترن لتطهير البروتوكولات القائمة على استبدال المياه مع الانكسار السائل مؤشر مطابقة 7، وقد تم تطبيق المجهري ورقة الضوء لالعينات العيانية، كما أدمغة فئران كاملة 8. ومع ذلك، العينة التي يسببها تشتت الضوء، الأمر الذي يؤثر العينات حتى تطهيرها، ويتحلل ورقة ضوء مما يؤدي إلى إثارة خارج التركيز fluorophores الذي يضيف الشاملة وضوح للصور المكتسبة.
لجمع انتقائي فقط في التركيز الفوتونات، ونحن إلى جانب مؤخرا إضاءة ضوء ورقة إلى نظام الكشف مبائر 9. في ورقة متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM)، ورفضت الخروج من التركيز والفوتونات متناثرة من قبل مرشح المكاني الخطي (شق) قبل الكشف (الشكل 1). لتحقيق عملية متحد البؤر في الهندسة المعمارية ورقة ضوء، يتم إنتاج الإضاءة عن طريق خط المسح الضوئي، ونظام دي المسح في مسار الكشف يخلق صورة ثابتة من خط المسح الإثارة في موقع الشق. وهناك نظام المسح الثالث يعيد بناء صورة ثنائية الأبعاد على مستشعر الكاميرا. CLSM يتيح لتعزيز النقيض 100٪ في الماوس تطهيرهاالعقول فيما يتعلق التقليدية المجهري ورقة خفيفة، مع المحافظة على معدل 10 إطار هرتز. مع CLSM فمن الممكن لإعادة بناء أدمغة فئران كامل مع قرار من 2 ميكرومتر في XY و 9 ميكرومتر في Z، ومع تباين كافية لتمييز الخلايا العصبية واحد fluorescently المسمى.
في هذه المادة ونحن تصف خط أنابيب التجريبية لإعادة بناء دماغ الفأر مع CLSM. العقول الثابتة ألدهيد الماوس هي المجففة في سلسلة متدرجة من خالية من بيروكسيد رباعي هيدرو الفوران وتطهيرها في وقت لاحق في خالية من بيروكسيد dibenzyl الأثير (الشكل 2)، بعد بروتوكول ضعتها بيكر وآخرون 10 عينة مسح ثم يتم تركيبه بعناية على الرؤوس لوحة وضعه في غرفة التصوير من متحد البؤر المجهر رقة ضوء مصنوعة خصيصا. العينة يمكن تركيبها مباشرة عن طريق اغراق على معلومات سرية من لوحة (الشكل 3A)؛ بدلا من ذلك يمكن لصقها على قرص من مسح agarose هلام (الشكل3B) أو وضعها في تجويف كوب مصنوع من مسح agarose هلام (الشكل 3C). ثم يتم إجراء التصوير المقطعي البصري من الدماغ بأكمله، كما يتم الحصول على العديد من مداخن المجاورة موازية لتغطية جميع حجم المخ (الشكل 4). وأخذ العينات قبل التصوير المقطعي، والذي ينتج خريطة تقريبية للموقف العينة والشكل، ويضمن أن يتم تنفيذ التصوير فقط في حجم العينة التي تحتلها. يتم لاحقا مخيط مداخن التصوير المقطعي جنبا إلى جنب مع البرامج حسب الطلب وحفظها في نظام متعدد القرار الهرمي 11. يمكن في نهاية المطاف أن تستكشف أدمغة الفأر مع نموذجي البرمجيات متعددة الدقة مثل خرائط جوجل التصور. يتم دمج كلا الصكين برامج هذه الإضافات كما في منصة مفتوحة المصدر Vaa3D 12.
وتبين لنا أخيرا الصور ممثل أدمغة فئران لإثبات قدرات خط أنابيب التجريبية وصفها في دراسة الفئران neuroanatom غرامةذ.
Protocol
1. إعداد وتخزين الأنسجة
- إصلاح مخ الفأر من خلال معيار نضح transcardial 13 مع 20 مل 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل، تليها 100 مل من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني 0.01 M. ضبط درجة الحموضة بعناية كل الحلول ل7.6: قيم أقل بقليل من درجة الحموضة يشفي من مضان EGFP.
- بعد إصلاح العقول رفعه بين عشية وضحاها في بارافورمالدهيد 4٪ في 4 درجات مئوية.
- شطف مرتين (30 دقيقة لكل منهما) في 0.01 M برنامج تلفزيوني وتخزينها في 0.01 M برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
2. الجفاف والمقاصة
ملاحظة: بروتوكول لتطهير الجفاف وتتابع عن كثب واحدة وصفها بيكر وآخرون 10.
- لإزالة البيروكسيدات من المذيبات الجفاف (رباعي هيدرو الفوران، THF)، الذي يطفئ بقوة مضان XFP، فلتر الأساسية THF مع تنشيط أكسيد الألومنيوم (بروكمان النشاط الصف الأول، حوالي 250 غرام / لتر من THF) باستخدام صفاءطوبوغرافية العمود. تجنب تكسير العمود، والتي من شأنها أن تقلل إزالة بيروكسيد.
- إضافة مثبت (hydroxytoluene الأنيسول، 250 ملغم / لتر) إلى الحل النهائي، حتى لو كان استقر THF بالفعل قبل الترشيح. استقرار هو في الواقع تحتفظ بها أكسيد الألومنيوم: THF دون استقرار قد وضع كميات كبيرة من الأكاسيد الفوقية ويمكن أن تكون متفجرة وخطيرة.
- يذوى الدماغ كله الماوس في سلسلة متدرجة من THF في الماء النقي: 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 96٪، 100٪، 1 ساعة لكل منهما، ثم 100٪ بين عشية وضحاها. وضع القارورة مع عينة على عجلة دوارة. لتجنب التعرض للضوء، والتفاف قارورة مع رقائق الألومنيوم.
- تحديد المذيبات المقاصة (الأثير dibenzyl، DBE) مع أكسيد الألومنيوم (تفعيل الأساسية، والنشاط الصف بروكمان الأول، حوالي 250 غرام / لتر من DBE) باستخدام القمع التصفية.
- مسح عينة في 100٪ DBE. تغيير الحل بعد 3 و 6 ساعة.
3. عينة تصاعد
- عندما تبدو شفافة الدماغ عن طريق العين (typiساتيا 1 ساعة بعد التغيير DBE الثاني)، تركيبها على لوحة التصوير يميل بواسطة إحدى الطرق التالية:
- تصاعد المباشر - يغرق بلطف العينة على واحدة من نصائح (الشكل 3A).
- القرص الاغاروز - الغطس قرص مصنوع من 6٪ هلام الاغاروز على نصائح. إصلاح بلطف العينة على القرص الاغاروز مع الغراء الاكريليك (الشكل 3B). الانتظار حوالي 1 دقيقة لعلاج.
- دورق الاغاروز - الغطس كوب مصنوع من 3٪ agarose هلام على نصائح. وضع بلطف العينة على الجزء السفلي من الكأس (الشكل 3C).
ملاحظة 1: تصاعد في دورق الاغاروز ينبغي تفضيل عندما المهم التصوير العينة في مجملها، إلا أن جل الاغاروز المحيطة العينة يؤدي إلى تشتت الضوء الإضافية التي يمكن أن تكون ضارة لجودة الصورة. إذا كان من الممكن استبعاد جزء صغير من العينة من التصوير، فمن الأفضل لتحميل المواصفاتإيمان على القرص الاغاروز أو مباشرة على الحافة. الأسلوب السابق هو الانسب للحفاظ على الدماغ الأفقي (باستثناء من تصوير جزء بطني أو ظهري من الدماغ)، وهذا الأخير للحفاظ على الدماغ العمودي (باستثناء من تصوير جزء من بصيلات الشم أو من الحبل الشوكي).
ملاحظة 2: يجب أن تكون على استعداد هلام الاغاروز في الماء، ثم المجففة مع THF (50٪ و 100٪ 4 ساعة لكل منهما) وتطهيرها في DBE 100٪ لمدة 4 ساعة أو حتى يبدو شفافا بشكل واضح.
- بعد تركيب العينة التالية إحدى الطرق السابقة، ضع لوحة التصوير داخل غرفة العينة باستخدام الملقط. ملء الغرفة مع المقاصة الحل.
4. إعداد المقطعي
- إزالة فتحة لجمع أكبر قدر ممكن مضان.
- إلقاء الضوء على عينة مع انخفاض قوة الليزر لمنع photobleaching من.
- نقل العينة في الاتجاهات الثلاثة باستخدام يحركها البرمجيات micropositioning التنفسيم. تحديد لكل اتجاه الحد الأدنى والحد الأقصى الإحداثيات التي يضيء العينة وضمن مجال الرؤية للكاميرا (الشكل 4A).
- إدراج الإحداثيات أعلاه كمعلمات ل 'قبل التصوير المقطعي' روتين. تحديد أيضا المسافة بين أكوام المجاورة لاستخدامها في التصوير المقطعي، والخطوة أخذ العينات قبل التصوير المقطعي في اتجاه وض.
- بدء مرحلة ما قبل التصوير المقطعي، الذي يجمع الصور في كل المكدس مع ض أخذ العينات المحددة في (4.4).
ملاحظة: يتم استخدام الصور التي تم جمعها من خلال برنامج لإعداد خريطة تقريبية لشكل العينة وموقف (4B الشكل)، والذي يسمح بتقييد اقتناء التصوير المقطعي فقط لحجم المحتلة فعليا من قبل العينة، والحد من وقت التصوير، وبالتالي photobleaching من.
5. التصوير المقطعي اقتناء
- نقل العينة من خارج الميزانية ضوء باستخدام نظام micropositioning.
- المؤتمر الوطني العراقيقوة الليزر rease ووقف حركة جميع أنظمة المسح الضوئي، وذلك لإلقاء الضوء فقط على الخطوط الثابتة في مركز مجال الرؤية.
- جبل الشق ومحاذاة باستخدام إشارة تألق ذاتي من حل المقاصة. يجب أن نرى بوضوح خط فتحة في مركز مجال الرؤية.
- إعادة تفعيل نظام المسح الضوئي، وخفض قوة الليزر ونقل عينة داخل ورقة ضوء باستخدام نظام micropositioning. نلاحظ أن قوة الليزر المستخدمة مع فتحة ستكون أعلى من تلك المستخدمة دون ذلك، منذ كتل مرشح المكانية جزء لا يستهان به من ضوء.
- ضبط السعة وإزاحة أنظمة المسح الضوئي والمسح الضوئي دي مع برنامج التحكم، حتى تبدو الصور واضحة ومشرقة.
- تشغيل برنامج الحصول على التصوير المقطعي، وبعد تحديد الخطوة ض المناسبة للتجربة. سيتم تصويرها في العديد من حجم موازاة ذلك، جزئيا مداخن تداخل (الشكل 5A)، وسيتم حفظ الصور فيبنية مجلد الهرمي.
6. خياطة والتخيل
- إكمال حجم المكتسبة مع الصور بالأبيض الاصطناعية (أي الصور من نفس نوع وأبعاد تلك التي تم جمعها، ولكن مع كثافة الصفر) باستخدام البرنامج الآلي (الشكل 4C). هذه الخطوة هي إلزامية من أجل برنامج خياطة للتعامل مع حجم مكعب كاملة.
- إطلاق برنامج Vaa3D (تنزيله مجانا من http://www.vaa3d.org/ ) مع الإضافات TeraStitcher وTeraManager مثبتة.
- تحميل البرنامج المساعد TeraStitcher. حدد الدليل الذي يحتوي على حجم تصويرها، تشير التوجهات النسبية للمحاور (فيما يتعلق إشارة سلمت اليمين تنسيق النظام) وحجم فوكسل.
- إطلاق الجزء الأول من خياطة. يقوم البرنامج حساب تشريد النسبية بين الأزواج من أكوام، والعثور على placem الأمثل الشاملةوالأنف والحنجرة لجميع مداخن معا (الشكل 5B).
- حدد لحفظ حجم مخيط في قرار واحد أو في شكل متعدد القرار. تمكن هذا الأخير من أجل متعددة قرار التصور مع المساعد TeraManager. في كلتا الحالتين، إذا كانت دقة الصورة أعلى أكبر من بضعة غيغا بايت، كما حدد متعددة المكدس حفظ طريقة وتحديد حجم substacks الفردية. وهذا سيمكن الوصول الفعال إلى البيانات المخزنة.
- إطلاق الجزء الثاني من خياطة. البرنامج سوف دمج مداخن الانحياز، وحفظها إما في وضع واحد أو متعدد المكدس (أرقام 5C و 5D). في نهاية إغلاق المساعد TeraStitcher.
- تحميل البرنامج المساعد TeraManager. حدد المجلد مع القرار متعدد حجم مكدسة متعددة، وتشير إلى حجم فوكسل ومحاور التوجهات. سيتم تحميل وحدة التخزين في الحد الأدنى من القرار.
- للتكبير إلى دقة أعلى، حدد معلما باستخدام بزر الماوس الأيمن فوق modalitذ Vaa3D، ثم التكبير في استخدام الماوس التمرير. بدلا من ذلك يمكنك تحديد بشكل مباشر على العائد على الاستثمار للتكبير مع النقر بزر الماوس الأيمن، أو تحديد الإحداثيات من حجم الفائدة.
- لإعادة لانخفاض القرار، ببساطة استخدام الماوس التمرير.
Representative Results
بروتوكول وصف يمكن استخدامها لإعادة بناء لقرار إما أدمغة فئران كامل ميكرون النطاق أو أجزاء رفعه، دون الحاجة إلى باجتزاء المادية. نتيجة ممثل، في الشكل 6 يظهر المخيخ كاملة من والماوس L7-GFP (يوم ما بعد الولادة 10). في هذا الحيوان وصفت جميع الخلايا العصبية العصبية مع EGFP. إذا كنا في التكبير، ويمكن رؤية هيكل رقائقي نموذجية من القشرة المخيخ (الشكل 7). مزيد من التكبير يسمح بالتمييز بوضوح كل خلية العصبية سوما (الشكل 8). وهكذا يمكن وصف بروتوكول يمكن استخدامها لفحص التنظيم المكاني العصبية في مختلف الدراسات النمو العصبي.
نتيجة ممثل الثانية، نقدم الصور من الدماغ unsectioned شخص بالغ thy1-GFP-M الماوس. في هذا الحيوان المعدلة وراثيا يتم التعبير عن EGFP في عشوائي فرعية العصبية متفرق. ويظهر النصف الأيمن من الدماغ في في الشكل 9. ونحنالتكبير في مزيد ومزيد من (أرقام 10 و 11)، وتصبح العمليات العصبية تمييزها. يوضح هذه النتيجة أن البروتوكول يسمح صفت القرار التصوير ميكرون النطاق في كامل أدمغة فئران الكبار، وفتح إمكانية دراسة التشريح كامل الدماغ في القرار الخلوية في نماذج الماوس من مرض الاعصاب.
الشكل 1. مخطط البصرية ورقة متحد البؤر المجهر الضوئي (CLSM). (أ) أعلى نظرا الجهاز، والتي تبين مسار الإثارة. انبعاث الليزر من 488 نانومتر الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة (DPSS) الليزر، وبعد التوسع وإيزاء بواسطة تلسكوب الأولى، يدخل عامل تصفية الانضباطي صوتية البصرية (AOTF) الذي ينظم كثافة شعاع. ثم، ويوسع تلسكوب الثانية مزيد من شعاع. مرآة galvo عموديا (جنبا إلى جنب ذ) بفحص تكون صباحا، والتي تركز من خلال عدسة داخل غرفة العينة. (ب) عرض الجانبي من الجهاز، والتي تبين مسار الكشف. وdescanned ضوء جمعتها الهدف كشف عموديا بواسطة مرآة galvo وركزت من خلال عدسة، وتنتج صورة ثابتة من خط الإثارة تتحرك. في موقف من الصورة الثابتة يتم وضع مرشح المكاني الخطي (شق). بعد شق، مرآة galvo وضعت داخل نظام عدسة 4F يعيد صورة 2-dimentional على رقاقة من المسؤول عن جانب جهاز ضرب الإلكترون (EM-CCD). مضان ممر الموجة مرشح إزالة كافة ضوء الإثارة الضالة قبل الكشف. وصفت أشعة ممثل الإثارة، وكشف وتصفية ممر الموجة ضوء الكشف عن طريق الأزرق، وعلى ضوء الأشعة الزرقاء والخضراء، على التوالي. يشار إلى الاتصال أطوال من جميع العدسات المستخدمة فعلا في المجهر. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. المقاصة عينة. أدمغة فئران الثابتة فورمالديهايد، والتي يتم تخزينها في برنامج تلفزيوني 0.1 M في 4 درجات مئوية (أ)، هي المجففة في سلسلة متدرجة من رباعي هيدرو الفوران (THF، ب) وتطهيرها بعد ذلك في 100٪ الأثير dibenzyl (DBE ، ج). يسبب الجفاف الخطوة أيضا بعض انكماش الأنسجة.
الرقم 3. عينة المتصاعدة للتصوير CLSM. مسح الدماغ يمكن سقطت مباشرة على لوحة التركيب يميل (أ)، لاصق على قرص الاغاروز تطهيرها (ب)، أو إدراجها في كوب الاغاروز (ج) تطهيرها.
FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 4. اقتناء التصوير المقطعي. العينات الروتينية قبل التصوير المقطعي ومتوازي يحتوي على الدماغ (أ) لتحديد عدد وطول المداخن المجاورة بالتوازي اللازمة لصورة كل عينة (ب). بعد التصوير، يتم إنشاء الصور السوداء لإكمال حجم المكتسبة الظاهري لمتوازي (ج).
الرقم 5. حجم خياطة. مداخن صورة جمعت تتداخل جزئيا بين بعضها البعض (أ)، والسماح لهم محاذاة دقيقة مع TeraStitcher المساعد (ب). البرنامج المساعد ثم يدمج مداخن الانحياز إما في واحد مكدسة (ج) أو متعددة ستا-للو (د) متعدد القرار التمثيل.
الرقم 6. المخيخ كاملة من P10-L7 GFP الماوس، والتي وصفت جميع الخلايا العصبية العصبية مع EGFP. شريط مقياس، 1 مم.
الرقم 7. التكبير في لجزء من المخيخ هو مبين في الشكل (6)، والتي تبين هيكل رقائقي نموذجية من القشرة المخيخ. شريط مقياس، 500 ميكرون.
الرقم 8. مزيد من التكبير في لجزء من المخيخ هو مبين في الشكل (6). يمكن أن تكون الخلايا العصبية سوما بوضوح التمييزأد. شريط الحجم، 200 ميكرون.
الرقم 9. النصف الأيمن من الدماغ من الكبار thy1-GFP-M الماوس، وتتميز غير محددة لوضع العلامات العصبية EGFP متفرق. شريط مقياس، 1 مم.
الرقم 10. التكبير في لجزء من النصف الدماغ هو مبين في الشكل 9، والتي تبين جزء من قرن آمون والقشرة من. شريط مقياس، 200 ميكرون.
الرقم 11. مزيد من التكبير في لجزء من النصف الدماغ هو مبين في الشكل 9. عدة neurites التي في القشرة يمكن تمييزها بوضوح. شريط النطاق، 50 ميكرومتر.
Discussion
CLSM إلى جانب تبادل المعلومات الكيميائية تمثل أداة قوية لدراسة التشريح العصبي من أدمغة فئران بأكمله المسمى مع تحقيقات الفلورسنت، وإما البروتينات أو الأصباغ الاصطناعية. منذ الضوء المنبعث خارج البؤري يتم حظره من قبل مرشح المكانية المادية، والتصوير عالية التباين الممكن أيضا في عينات سميكة، مع الحفاظ على ارتفاع معدلات الإطار نموذجي للعمارة ورقة الخفيفة.
القضية الرئيسية للتعامل مع عند استخدام الأساليب المذكورة هو تعظيم التباين. في الواقع، يتم تقليل إشارة المتاحة سواء عن طريق العوامل الكيميائية والبصرية. من وجهة نظر كيميائية، وإجراءات تبادل المعلومات على أساس المذيبات العضوية يشفي الانبعاثات من البروتينات الفلورية والأصباغ الفلورية الأخرى 7. الترشيح للالمذيبات لإزالة البيروكسيدات، كما وصفها بيكر وآخرون 10، يسمح بالحفاظ على مستوى جيد من مضان أيضا في الأنسجة المذيبات تطهيرها. نشرإد المياه القائمة على أساليب المقاصة 14 لا تقلل كفاءة مضان، ولكن النتيجة في أكثر فقرا الشفافية عند التعامل مع أدمغة الفئران بأكمله، على الأقل مع التقنيات البصرية الخطية.
من ناحية أخرى، في هذه اللحظة لا توجد أهداف تجارية مع مسافة العمل الطويلة تصحيح للارتفاع الرقم القياسي الانكسار (ن ≈ 1.56) المقاصة الحلول المستخدمة. وبالتالي، فإن مؤشر الانكسار عدم تطابق بين المتوسطة التي تغمر العينة وتصميم واحد من الهدف يؤدي إلى الانحرافات كروية قوية. إلى جانب الحد من قرار المجهر، مثل الانحرافات يؤدي إلى انخفاض كثافة الصورة والتباين، حيث يتم نشر الضوء على مساحة أوسع. وتشمل الحلول الممكنة لهذه المسألة استخدام البصريات التكيفية 15 و / أو المصححين شبه كروي ثابت.
أي تحسن في تباين الصورة وشدة يؤثر بسهولة أيضا سرعة التصوير، لأن أقصر فيالوقت tegration في الصورة ويمكن اختيار. في لحظة يمكن CLSM تحمل سرعة التصوير من حوالي 10 ميكرومتر 6 3 / ثانية، مع زمن التعرض الكاميرا من 100 ميللي ثانية 9. في هذه السرعة يستغرق 1-3 أيام لصورة دماغ الفأر بأكمله، وهذا يتوقف على حجم العينة. على الرغم من أن أي تدهور كبير في جودة الصورة ويلاحظ طوال هذه الدورة التصوير الطويلة، ومعظمهم بسبب photobleaching من الذاتية المنخفضة ورقة إضاءة ضوء 6، وقتا طويلا اللازمة لصورة يمكن أن دماغ الفأر واحد في الممارسة لحد من انطباق CLSM. زيادة 10 أضعاف في كفاءة النظام، إلى جانب استخدام كاميرا عالية السرعة لكشف، من شأنه أن يقلل وقت التصوير لعدة ساعات، والسماح لاستخدام الروتيني للبروتوكول وصفها.
على الرغم من كل القيود المذكورة أعلاه، CLSM التصوير إلى جانب لتبادل المعلومات الكيميائية تصاريح لإعادة بناء أنسجة أدمغة فئران كامل لقرار ميكرون النطاق في أقل منالأسبوع. وسائل بصرية أخرى للتصوير الدماغ كله تحمل دقة أعلى من CLSM، ولكن بسعر إعداد أطول و / أو وقت التصوير 2-4، أو من أخذ العينات متفرق ض 5.
الطرق الموضحة في هذه المقالة يمكن استخدامها في تركيبة مع استراتيجيات مختلفة لوضع العلامات الفلورية: الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية مختارة العصبية، ترنسفكأيشن الفيروسية، وحقن صبغة intraparenchymal، الخ في الواقع كل الاستراتيجيات السابقة تلطيخ التضحية الحيوانية متوافقة مع CLSM . في الواقع، لم يثبت بعد الوفاة وضع العلامات الفلورية من أدمغة فئران كامل حتى الآن؛ على أي حال، إذا كان هذا النوع من تلطيخ سيكون من الممكن في المستقبل القريب، وعدد العينات التي يمكن بناؤها مع CLSM سوف تصبح أكبر من ذلك بكثير، يحتمل أن تكون بما في ذلك أنسجة المخ البشري.
في الختام، متحد البؤر المجهري ورقة الخفيفة المستخدمة في تركيبة مع تيسالمقاصة مقاضاة وإدارة البيانات متعددة القرار قد تسمح للباحثين لإعادة بناء وتحليل العينات العيانية مع القرار في نطاق ميكرون، مع الجهود التكنولوجية التي هي أيضا على يد معظم المختبرات. التطبيقات المحتملة من CLSM بالطبع لا تقتصر على الأعصاب، ولكن يمتد كل المجالات البحثية التي تم بالفعل استخدام المجهر الضوئي ورقة، ومرحلة التطور الجنيني و16،17 تشريح الحيوانات الصغيرة 18.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج على تمويل من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقات المنح ن. 228334 241526 و. وقد تم دعم هذا المشروع البحثي أيضا من قبل برنامج العلوم الحدودي الإنسان منحة بحثية (RGP0027/2009)، والإيطالية من قبل وزارة التعليم والجامعات والبحوث في إطار البرنامج الرئيسي المشروع Nanomax وزارة الصحة الإيطالية في إطار "الخلايا الجذعية دعوة لتقديم مقترحات". وقد تم تنفيذ هذا البحث في إطار الأنشطة البحثية التأسيس ICON بدعم من "كاسا دي Risparmio التر دي فلورنسا".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
- Lichtman, J. W., Denk, W. The big and the small: challenges of imaging the brain's circuits. Science. 334, 618-623 (2011).
- Mayerich, D., Abbott, L., McCormick, B. Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain. J. Microsc. 231, 134-143 (2008).
- Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330, 1404-1408 (2010).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
- Ragan, T., et al. Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging. Nat. Methods. 9, 255-258 (2012).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 138-143 (2012).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4, 331-336 (2007).
- Silvestri, L., Bria, A., Sacconi, L., Iannello, G., Pavone, F. S. Confocal light sheet microscopy: micron-scale neuroanatomy of the entire mouse brain. Opt. Express. 20, 20582-20598 (2012).
- Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS One. 7, e33916 (2012).
- Bria, A., Iannello, G. TeraStitcher - A Tool for Fast Automatic 3D-Stitching of Teravoxel-Sized Microscopy Images. BMC Bioinformatics. 13, 316 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28, 348-353 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Booth, M. J., Neil, M. A. A., Wilson, T. Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media. J. Microsc. 192, 90-98 (1998).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy. Front Syst. Neurosci. 4, 1 (2010).
