La detección de alteraciones genéticas somáticas en muestras de tumores por Exon de captura y secuenciación masivamente paralelo

Resumen

Se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y la posterior basada en la hibridación exón captura para la detección de mutaciones clave asociados con el cáncer en las muestras tumorales clínicos de secuenciación masiva en paralelo de "próxima generación". Targeted secuenciación exón ofrece los beneficios de alto rendimiento, bajo coste, y la cobertura de secuencia profunda, produciendo de este modo una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Resumen

Los esfuerzos para detectar e investigar las mutaciones oncogénicas clave han demostrado su utilidad para facilitar el tratamiento adecuado para los pacientes con cáncer. El establecimiento de alto rendimiento, la secuenciación masiva en paralelo "de nueva generación" ha ayudado al descubrimiento de muchas de estas mutaciones. Para aumentar la utilidad clínica y traslacional de esta tecnología, las plataformas deben ser de alto rendimiento, rentable y compatible con parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) muestras de tejido que pueden producir pequeñas cantidades de ADN degradado o dañado. Aquí se describe la preparación de bibliotecas de ADN con códigos de barras y multiplexados seguido de captura basados ​​en la hibridación de los exones específicos para la detección de mutaciones asociadas con el cáncer en los tumores congelados y frescos por FFPE secuenciación masiva en paralelo. Este método permite la identificación de mutaciones en la secuencia, copia alteraciones numéricas y seleccionar reajustes estructurales que involucran todos los genes específicos. Targeted secuenciación del exón ofrece tse beneficia de un alto rendimiento, bajo costo, y la cobertura de secuencia de profundidad, lo que confiere una alta sensibilidad para la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Introducción

La identificación de "conductor" eventos genéticos tumorales en oncogenes clave y genes supresores de tumores juega un papel esencial en el diagnóstico y el tratamiento de muchos tipos de cáncer ^1. Los esfuerzos de investigación a gran escala que utilizan la secuenciación masiva en paralelo "de nueva generación" han permitido la identificación de muchos de estos genes asociados con el cáncer en los últimos años ^2. Sin embargo, estas plataformas de secuenciación típicamente requieren grandes cantidades de ADN aisladas a partir de tejidos congelados frescos, lo que plantea una limitación importante en la caracterización y análisis de mutaciones de....

Protocolo

1. ADN y Preparación de los reactivos

Nota: Este protocolo describe el procesamiento y el análisis simultáneo de 24 muestras (por ejemplo, 12 pares normales / tumorales), pero puede ser adaptado para lotes más pequeños y más grandes. Las muestras de ADN pueden derivar de FFPE o tejido fresco congelado, especímenes citológicos, o sangre. Típicamente, tanto del tumor y el tejido normal del mismo paciente se perfilan juntos con el fin de distinguir las mutaciones somáticas de los polimorfismos heredados. El protocolo comienza inmediatamente después de la extracción de ADN.

1. Alícuota de 50-250 ng (250 ng recomendado) de ADN....

Resultados

Una piscina de 24 bibliotecas de secuencias de código de barras (12 pares-tumorales normales) fue capturado utilizando sondas correspondientes a todos los exones codificantes de proteínas de 279 genes del cáncer y se secuenció como 2 x 75 pb lee en un solo carril de una celda de flujo HiSeq 2000. El tumor y bibliotecas normales se agruparon en una proporción de 2:1. Métricas de rendimiento de la muestra para un grupo de muestras de ADN de tumores congelados se muestran en la Figura 1, incluyendo la tasa.......

Discusión

Nuestro ensayo IMPACT produce una alta tasa de alineación, la alta tasa en el blanco, la meta de cobertura alta, y alta sensibilidad para detectar mutaciones, indeles y copiar alteraciones numéricas. Hemos demostrado la capacidad de nuestro ensayo IMPACT secuencia de ADN de ambos helado en fresco y archivado muestras de FFPE de entrada de baja ADN. Mediante la realización de secuenciación dirigida exón de los genes clave asociados con el cáncer, se puede lograr una cobertura de secuencia muy profundo para los exones de .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NEBNext Módulo de reparación final	Nueva Inglaterra Biolabs	E6050L
NEBNext dA-Módulo de relaves	New England Biolabs	E6053L
NEBNext Módulo de ligadura rápida	New England Biolabs	E6056L
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter Genómica&		nbsp;
NEXTflex Códigos de barras sin PCR – 24	Bioo Scientific	514103
Kit de amplificación de biblioteca HiFi	KAPA Biosystems	KK2612
COT ADN humano, grado fluorométrico	Roche Diagnostics	05 480 647 001
NimbleGen SeqCap EZ Kit de hibridación y lavado	Roche NimbleGen	05 634 261 001
SeqCap EZ Library Cebos	Roche NimbleGen
Kit de purificación de PCR QIAquick	Qiagen	28104
Kit de ensayo de amplio rango (BR) Qubit dsDNA	Life Technologies	Q32850
Kit de ensayo de alta sensibilidad (HS) Qubit dsDNA	Life Technologies	Q32851
Kit Agilent DNA HS	Agilent Technologies	5067-4626, 4627
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
Covaris E220	Covaris
Soporte magnético-96	Ambion	AM10027
Illumina Hi-Seq 2000	Illumina