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Artículo de método

Interrogatorio funcional de adultos hipotalámica neurogénesis con focal Radiológica Inhibición

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DOI:

10.3791/50716

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14 de noviembre de 2013

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1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

En este artículo

Resumen

La función de las neuronas de mamíferos adultos nacidos sigue siendo un área activa de investigación. La radiación ionizante inhibe el nacimiento de nuevas neuronas. Usando el ordenador guiada por tomografía irradiación focal (CFIR), la orientación anatómica tridimensional de poblaciones específicas progenitoras neurales ahora se puede utilizar para evaluar el papel funcional de la neurogénesis adulta.

Resumen

La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante. Enfoques para inhibir la neurogénesis adulta a través de la entrega viral invasivo o animales transgénicos tienen potenciales factores de confusión que hacen que la interpretación de los resultados de estos estudios sean difíciles. Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno investigar de forma no invasiva la función de grupos selectos de las neuronas adultas nacidas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante focal inhibe el nacimiento y la diferenciación de neuronas nuevas, y permite la orientación de las regiones específicas progenitoras neurales. Con el fin de iluminar el papel funcional potencial que la neurogénesis adulta hipotálamo desempeña en la regulación de procesos fisiológicos, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas nacidas en la eminencia media del hipotálamo. Se describe un método para C omputer guiada por tomografíaf ocal ir radiación (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa y exacta orientación en pequeños animales. CFIR utiliza guía de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis de radiación, minimiza la exposición a la radiación de las regiones del cerebro no focalizados, y permite la distribución de la dosis de conformación de haz con límites afilados. Este protocolo permite a uno a preguntarse cuestiones relativas a la función de las neuronas adultos nacidos, sino que también abre las áreas a las preguntas en las áreas de la radiobiología, la biología del tumor, y la inmunología. Estas herramientas radiológicas facilitará la traslación de los descubrimientos en el laboratorio a la cabecera del paciente.

Introducción

Descubrimientos recientes han demostrado que el cerebro adulto de mamíferos puede someterse a un notable grado de plasticidad. Neuronas adultas nacidas se generan durante la edad adulta en nichos especializados del cerebro de los mamíferos 1. ¿Cuál es la función de estas neuronas adultas nacidas? Y más aún, es lo que desempeñan un papel en la fisiología y el comportamiento? Los estudios sobre este tema se han centrado tradicionalmente en la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular del hipocampo, sin embargo, estudios recientes han caracterizado la neurogénesis en otras regiones del cerebro tales como el hipotálamo 2 de mamífero. La neurogénesis se ha informado en el posnatal y el hipotálamo adulto 2-10, y la función de estas neuronas hipotalámicas recién nacidos sigue siendo un área activa de investigación.

La caracterización funcional de las neuronas adultas nacidas sigue siendo un reto importante para el campo de la neurociencia en general. La inhibición selectiva de especificaciónific poblaciones progenitoras neurales sigue siendo limitada por la falta de marcadores moleculares disponibles que son exclusivos de las poblaciones progenitoras neuronales individuales 11. Por lo tanto, la eliminación selectiva de las neuronas adultas nacidas de estos progenitores neurales a través de modificación genética dirigida sigue siendo difícil. Del mismo modo, la entrega viral para apuntar neuronas adultos nacidos sufre de posibles variables de confusión tales como la introducción de la lesión y la inflamación en el medio ambiente 12.

Nuevas herramientas radiológicas están surgiendo, sin embargo, que le permiten a uno evitar estos factores de confusión e investigar estas preguntas a través de la orientación anatómica exacta y precisa en pequeños animales. La radiación ionizante inhibe el nacimiento y la diferenciación de nuevas neuronas, y permite que un método no invasivo para apuntar las poblaciones progenitoras neurales 13-15. Recientemente, hemos descrito una región germinal de la eminencia media del hipotálamo de los mamíferos (ME) que hemos llamado la zona proliferativa hipotalámico (HPZ) 2 . Hemos encontrado que cuando los jóvenes ratones hembras adultas se les dio una dieta alta en grasas (HFD), los niveles de neurogénesis en ratones alimentados con HFD eran sustancialmente más alto que su pienso normal (NC) controles alimentados en esta región ME 2. Para probar si la neurogénesis adulta en el ME hipotálamo regula el metabolismo y el peso, se trató de interrumpir este proceso. La eminencia media es una pequeña estructura unilateral en la base del tercer ventrículo a partir del cual se liberan hormonas reguladoras. Con el fin de inhibir la proliferación y posterior neurogénesis sin alterar las otras funciones fisiológicas de esta región del cerebro, hemos desarrollado una técnica de irradiación focal no invasivo para inhibir selectivamente el nacimiento de neuronas adultas recién nacidos en la eminencia media del hipotálamo 2.

Un número de grupos han empleado la radiación para suprimir la neurogénesis en regiones canónicas 14-28. Sin embargo, los enfoques radiológicos anteriores generalmente se han centrado en grandes áreas, o often involuntariamente también dirigido múltiples áreas del cerebro donde se ha reportado la neurogénesis, por lo que es difícil asociar de forma inequívoca los defectos de comportamiento observados con defectos en poblaciones específicas progenitoras neurales. La capacidad de irradiación más específico es proporcionado por plataformas radiológicos que combinan omputer imagen guiada por tomografía con c f ocal radiación rayos IR (CFIR) entrega para permitir anatómica precisa orientación 29-36. Rayos de la radiación tan pequeñas como de 0,5 mm de diámetro están disponibles para dirigirse a poblaciones progenitoras neurales específicas 35. Esta metodología nos permite apuntar el ME hipotálamo y detener la proliferación y el bloque de la neurogénesis en animales pequeños. Después del tratamiento radiológico en estas poblaciones progenitoras, pruebas fisiológicas y de comportamiento se pueden realizar para iluminar la función potencial de las células adultos nacidos. Focalización focal es especialmente importante para nuestra aplicación, ya que elglándula pituitaria está situada cerca de la eminencia media del hipotálamo; irradiación de la hipófisis puede afectar la función hormonal y posteriormente confundir los resultados.

La base biológica para la supresión de la neurogénesis después de la irradiación sigue siendo poco clara. Estudios de radiación previos se han basado en grandes vigas de la zona, y han llegado a la conclusión de que la supresión de la neurogénesis está mediada a través de una respuesta inflamatoria 14, 37. Como tal, no está claro si la irradiación altamente focal podría suprimir la neurogénesis, ya que no provoca una respuesta inflamatoria sustancial. Sin embargo, estudios recientes realizados por nuestro grupo de la región clásico neurogénica en el hipocampo han demostrado que la irradiación altamente focal con una dosis de 10 Gy puede suprimir la neurogénesis durante al menos 4 semanas después de la irradiación 35.

Para interrogar a la función de las neuronas hipotalámicas adultos nacidos en la eminencia media, se utiliza una radiación de precisión device capaz de entregar imágenes de TC en combinación con haces de radiación de pequeño diámetro para inhibir ME neurogénesis. El uso de un tubo de rayos X unido a un pórtico que gira sobre un rango de 360 °, ofrecemos arco de haz del haz de micro irradiación con el uso de una etapa espécimen controlado robóticamente que permite la rotación de un sujeto animal durante el tratamiento de radiación (Figura 1) . Un detector de rayos X de alta resolución se utiliza para adquirir imágenes cuando el pórtico se encuentra en la posición horizontal 33. Para este estudio, las imágenes de TC fueron reconstruidos con un tamaño de voxel isotrópico de 0,20 mm. De imágenes de a bordo CT permitió la identificación de un objetivo, mientras que el animal está en la posición de tratamiento. El objetivo fue localizado mediante el software de planificación de la dosis de navegación CT, que estaba incluido en nuestra plataforma radiológica disponible en el mercado. Después de la localización de nuestro ROI por la TC, el animal se mueve a la posición de tratamiento apropiado por la platina robótico que tiene cuatro gradosrees de libertad (X, Y, Z, θ). A través de una combinación de ángulos de pórtico y de la etapa de robot, las vigas pueden ser entregados desde casi cualquier dirección con respecto al animal, y tratamientos de arco estereotácticas son posibles 29. Para estos y todos los otros estudios de imágenes, los ratones fueron colocados en un dispositivo de inmovilización que permite el suministro de gas isoflurano anestésico mientras se restringe el movimiento. La cama inmovilización es compatible CT, y se conecta a la platina robótico 34.

Esperamos que CFIR proporcionará avances conceptuales en una serie de áreas de investigación. A pesar de que utiliza la orientación radiológica de la eminencia mediana del hipotálamo como prueba de principio de esta técnica, CFIR se puede utilizar para dirigirse a cualquier región del cuerpo de cualquier organismo modelo pequeño, en principio. En las neurociencias, por ejemplo, prevemos esta técnica podría utilizarse para evaluar la función de las poblaciones progenitoras activamente proliferativas que se ha sugerido que exist en otros órganos circumventricular, tales como el área postrema 38, 39, órgano subfornical 40, y la pituitaria 41. Controversias de larga data en cuanto al papel funcional de la neurogénesis adulta y la identificación de un papel causal en el comportamiento pueden ahora ser mejor atendidos. En cantante, esta técnica podría abordar el papel de la neurogénesis adulta en el mantenimiento de el comportamiento robusto y estacional de canto de los pájaros 42, que ha sido obstaculizado por la capacidad de inhibir selectivamente la neurogénesis en regiones específicas del cerebro. La comprensión de este modelo de comportamiento robusto podría arrojar nueva luz sobre el papel de la neurogénesis adulta en la regulación de otras conductas de dimorfismo sexual. Alternativamente, en el campo metabólico, CFIR podría ser utilizado para explorar aspectos de la función de la proliferación de hepatocitos y su papel en el metabolismo y el balance energético. La posibilidad de que avance conceptual en múltiples disciplinas de investigación se ve reforzada por la introducción de esta técnica.

En este trabajo se demuestra la capacidad de CFIR para anatómica precisión la orientación de un haz de irradiación focal. A pesar de que inicialmente desarrollado esta plataforma de investigación de la radiación de pequeños animales (SARRP) para nuestros estudios, otros dispositivos similares están ahora disponibles comercialmente que puede lograr la irradiación similares guiada por TC focal 43, 44. Por lo tanto, se generaliza este protocolo CFIR con los pasos necesarios para todas las plataformas de investigación en lugar de los que son específicos para SARRP. Las ventajas de CFIR más de los enfoques radiológicos anteriores para inhibir la neurogénesis son que esta técnica permite la orientación de imagen volumétrica tridimensional para la localización y la orientación de la dosis, la dosis de conformación minimiza la exposición a regiones del cerebro no focalizados, y la geometría del haz de alta precisión permite una distribución de dosis conforme con límites haz afilados. Planteamos cómo utilizar imágenes guiada por TC para apuntar la dosis a una región anatómica específica, y al hacerlo, la forma de visualizar la radiaciónDistribución de la dosis directamente en el tejido mediante la tinción inmunohistoquímica para γ-H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de DNA 35, 45-48. El uso de este enfoque para la irradiación selectiva de nichos neurogénicos puede tener implicaciones significativas en cuanto a revelar el papel funcional de las nuevas neuronas adultas nacidas en la fisiología y la enfermedad.

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Protocolo

Uso de los Animales

Obtener la aprobación del Comité de Cuidado de Animales y el empleo institucional de los protocolos de atención y de uso estándar. El protocolo actual fue desarrollado para estudios de irradiación focales sobre 5.5-10 semanas de edad adultos ratones C57BL6 / J, como se describió previamente (Figura 2) 2. Sin embargo, otras edades y especies de pequeños animales (ratas, hamsters, ardillas de tierra, etc) también pueden utilizarse, siempre que los protocolos de anestesia efectiva y un atlas de referencia radiográficos que permiten la identificación de la región de interés (ROI) se encuentran disponibles.

1. Calibración de guiada por TC Plataforma Radiológica

Realice las calibraciones basadas en películas para la dosis de radiación en la plataforma radiológica de antemano para cada tamaño del colimador y el tipo de filtro del tubo de rayos X utilizada. Con el fin de dirigir un haz de arco de la irradiación en el lugar de destino deseado, utilice el software de planificación de la dosis de radiación 49 dise en la mayoría de las plataformas comerciales de radiación para calcular el tiempo de entrega requerido en base a la dosis de radiación, la profundidad de la región de interés (ROI) en base a las tomografías computarizadas del ratón, y la velocidad de rotación de la plataforma robótica; detalles sobre este se quedan fuera de este protocolo, ya que difieren entre las plataformas de radiación. A los efectos de visualizar el hipotálamo ventrobasal 2 (Figura 3) con imagen de CT, operar el tubo de rayos X con un punto focal 0,4 mm y la energía del haz de 100 kVp con 1 mm de Al filtración. Para la irradiación focal de la HPZ, operar el tubo de rayos X a 225 kVp, 13 mA, y un punto focal de 1 mm con la filtración de 0,15 mm de Cu, para entregar 10 Gy de radiación a una profundidad de tejido de 0,6 cm durante un tratamiento tiempo de 4,6 min. Targeting entre diferentes regiones de interés requerirá calcular diferentes parámetros.

  1. Si el estudio de los efectos de la dieta rica en grasas sobre la neurogénesis en la eminencia media a lo descrito previamente 2, obtener C57B hembra de cuatro semanas de edad,L6 / J ratones de laboratorios Jackson ratón, y las casas cuatro ratones por jaula. Desconecte la alimentación de pienso normal a una dieta alta en grasa a las cinco semanas de edad. Permitir a los ratones para aclimatarse a la nueva vivienda y alimentación. Realizar el tratamiento CFIR en 5,5 semanas de edad. Transporte somete a la sala de operación que contiene la plataforma radiológica. Minimizar los niveles de estrés durante la transferencia. Prepare la cámara de gas de anestesia isoflurano. A continuación, agregue un solo ratón en la cámara. De forma paralela, preparar almohadilla eléctrica (baja temperatura) para el post-tratamiento.
  2. Una vez que el ratón está bajo y ya no responde a la compresión del pie-pad, llevar el tema a la plataforma radiológica y colocar sobre la cama inmovilización de la fase de robótica. Coloca la boca del sujeto dentro de la taza anestesia ojiva, y los dientes en el protector bucal (Figura 1D). Acuéstese ratón sobre la cama inmovilización y comprobar para ver si se sigue manteniendo la insensibilidad. Si es así, con cinta adhesiva del ratón a la cama con cinta de gasa. Mientras la grabación pulsado el ratón para la cama, Asegúrese de que la cabeza se nivela a un plano horizontal. Esto se puede determinar tirando hacia arriba de las orejas y viendo si se nivelan. Una vez que el ratón está en la posición correcta, cierre la pantalla protectora de plomo.
  3. Adquirir la exploración de tomografía computarizada utilizando el software de a bordo de la plataforma radiológica del experimentador (esto será diferente entre las plataformas), que proporcionará un análisis estructural anatómico tridimensional del sujeto ratón. Compruebe si la cabeza del ratón está nivelado con el plano horizontal. Si no, repita los pasos 1.2 a 1.3 hasta que se estabilizó la cabeza del sujeto.
  4. Identificar el ROI imagen CT. Calcular la distancia de retorno de la inversión a la superficie del cráneo con un ángulo de 45 ° con el plano horizontal como se muestra en la Figura 3E.
  5. El uso de software de a bordo, toma una placa de rayos X de la asignatura ratón desde arriba, como se muestra en la figura 4A. A continuación, retire el ratón desde la plataforma radiológica, se puso el cojín de la calefacción, y el monitor hasta que activa.
  6. De las imágenes de TC coronal, el cálculo de la profundidad media anatómica retorno de la inversión de por lo menos tres ratones para determinar la dosificación de entrega. Como un ejemplo de un estudio previo 2 que se administró 10 Gy de irradiación para el hipotálamo ventrobasal, la profundidad de la ROI desde el cráneo (a partir de un ángulo de 45 °) es 0,66 cm (véase la figura 3E). Sabiendo eso, los investigadores utilizaron el software de planificación de dosis (DPS) instalado en su plataforma radiológico para calcular la velocidad de rotación adecuado y la duración del tratamiento para conseguir la dosis deseada al ROI.
  7. Después de determinar la duración del tratamiento y la velocidad de rotación de la fase de robótica con el software de planificación de dosis, medir distribuciones de dosis de los parámetros calculados con películas sensibles a la radiación Gafchromic incrustados en un modelo de ratón maqueta de plástico-el equivalente en agua. Para ello, insertar tres películas Gafchromic sensibles a la radiación entre los cuatro bloques de plásticos equivalentes a agua apiladas verticalmente 29 comose muestra en la Figura 4B.
  8. Coloque modelo de ratón maqueta que contiene películas Gafchromic en el escenario robótico, y ejecutar el haz de irradiación focal con los parámetros recién calculados. Por ejemplo, para apuntar el hipotálamo ventrobasal, los parámetros de entrada de 0,15 mm de filtro de Cu, 225 kVp, 13 mA, ajuste de 1 mm de diámetro del haz de radiación, 45 ° ángulo de pórtico, 1,3 ° / seg rotación, y 4,6 min para lograr un retorno de la inversión dosis radiológica de 10 Gy.
  9. Después de la irradiación, compruebe las películas para el patrón y la intensidad de la dosis de radiación. Para una rotación de ángulo de 360 ​​° con los parámetros enumerados para apuntar el hipotálamo ventrobasal, un anillo oscuro en la película por encima del isocentro, un pequeño punto crujiente en la película isocentro, y un anillo más ligero en la película por debajo de la isocentro correspondiente al cono- administración de haz de la radiación se observó (Figura 4B).
  10. Superponer isocentro película Gafchromic largo de los rayos X de los sujetos ratón a los que los parámetros eran calcalculado. El punto focal irradiado en el isocentro debe superponerse con la región ROI deseada como se muestra en la Figura 4C.

Método alternativo: Si la dificultad en la selección de ROI cerebral persiste, utilice contraste yodado inyectado por vía intratecal para mejorar la visualización de los ventrículos bajo las imágenes de TC. En aras de la brevedad, este procedimiento se deja fuera de este protocolo, pero se describe previamente 35, 50. Contraste de yodo proporcionará hitos ventriculares adicionales (Figura 5A).

2. Determinar la exactitud de irradiación de haz

Confirmar aún más la precisión CFIR haz mediante visualización directa del haz de radiación en el tejido 2, 35, 51. Para ello, lleve a cabo la inmunohistoquímica para detectar γH2AX 51, una proteína histona y un marcador precoz de ADN de doble filamento se rompe. Sujetos Ratón deben transcardially perfundidos y fijados dentro de la hora de la irradiación. Después de la irradiaciónación, la reparación del ADN sobreviene rápidamente, y los niveles de ΥH2Ax disminuyen significativamente 35.

  1. Repita los pasos 1.1 a 1.3.
  2. Después de que el destino se identifica en la TC, el tema del ratón se mueve bajo control robótico para alinear este objetivo con el haz de administración de la radiación. Parámetros calculados de entrada (velocidad de rotación y duración del tratamiento para lograr la dosis deseada) desde el paso 1.6 en el software de la dosis de planificación y comenzar el tratamiento. El tratamiento se suministra con el pórtico se refirió a 45 ° respecto a la vertical, mientras que el ratón hace girar alrededor de un eje orientado verticalmente.
  3. Después de la irradiación, lleve a cabo la perfusión transcardial sobre temas de ratón. Realizar la perfusión dentro de una hora 52. Después de cerebros de perfusión, fix inmersión en el 4% PFA / PBS y mueva suavemente la noche a 4 ° C.
  4. A la mañana siguiente, lavado de 5 min en PBS 3x para eliminar fijador paraformaldehído. Luego, sumerja en el 30% de sacarosa en PBS 1x en una mecedora a 4 ° C.
  5. Agite suavemente a 4 º C (usdualmente 12-16 h), hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo del tubo. Esto sirve como un paso crioprotección. Una vez que el cerebro se hunden, retire el cerebro con una cuchara perforada para evitar el exceso de 30% sucrose/1x transferencia PBS. Rápidamente incrustar en medio de congelación en hielo seco. Agitar medio de congelación con puntas de pipeta y alinear cerebral en moldes de plástico.
  6. Una vez completamente congelado, transferir bloques cerebrales a -20 ° C congelador para su almacenamiento.
  7. El día en que se llevará a cabo la inmunohistoquímica, sección coronal a 40 micras de espesor, y flotan en una placa de 24 pocillos que contenía PBS con un pincel fino. Secciones deben mantenerse en orden serial correcto para inmunotinción para determinar la cobertura de la irradiación de la región de destino.
  8. Precalentar 0,01 M de solución de citrato de sodio a 80 ° C en baño de agua en preparación para la etapa de recuperación de antígeno. Al mismo tiempo, mientras que el citrato de sodio se está calentando, realice 5 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS.
  9. Una vez solución de citrato de sodio es a 80 ° C, se sumergen secciones de cerebro iN la solución tampón de citrato de sodio. Dejar en baño de agua a 80 ° C durante 1 hora.
  10. Retire la sección y permita que la solución de citrato de sodio alcance la temperatura ambiente, a continuación, realizar tres lavados de 5 minutos en 0,01 M de PBS.
  11. Bloquee las secciones del cerebro durante 1 hora en PBS-Triton que contiene 5% de suero normal de cabra.
  12. Incubar las secciones del cerebro durante la noche en PBS-Triton que contienen 5% de suero normal de cabra con 1:700 concentración de ratón anti-fosfo-H2AX anticuerpo primario a 4 º C.
  13. Al día siguiente, realizan 15 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS-Tritón.
  14. Incubar las secciones del cerebro de PBS-Triton que contiene 5% de suero normal de cabra con la cabra anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo 488 nm a 1:500 concentración durante 2 horas.
  15. Efectuar 15 min lavados 3 veces en 0,01 M PBS-Tritón.
  16. Realizar 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) mancha (1:5.000 en PBS) durante 10 min para visualizar núcleo. A continuación, lavar las secciones del cerebro durante 5 min con PBS.
  17. Montar en electrostáticamente chmicroscopio arged desliza por la sección flotante en PBS. Limpie el exceso de PBS y permitir que se sequen. Cubreobjetos las diapositivas utilizando medio de montaje y deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche.
  18. Tome fotografías de secciones coronales de serie con microscopio de fluorescencia. ΥH2Ax inmunotinción (verde) indica el sitio de la irradiación. DAPI (azul) es un colorante nuclear (Figura 5B).

3. Preparación de Ratón Temas de irradiación focal

Examine los resultados de inmunotinción ΥH2Ax. Una vez satisfecho con la calibración y la orientación del haz de irradiación, proceder con el experimento. En este punto, el tiempo total requerido para el tratamiento de un ratón (de la configuración de los animales a la finalización de la entrega de haz) es de aproximadamente 10-15 minutos para un tratamiento de 10 Gy con un haz de 1 mm.

  1. Orden de cuatro semanas de edad, los ratones hembras C57BL6 / J de los laboratorios Jackson Ratón. Casa de cuatro ratones por jaula, y cambie la comida de pienso normala una dieta alta en grasa a las cinco semanas de edad. Ratones sacador del oído para darles marcas de identificación únicos. Monitorizar la salud de los ratones diariamente. Nota: marcadores metálicos no pueden ser utilizados, ya que darán lugar a rayas artefactos en la CT.
  2. Pesar los ratones el día antes de la radioterapia o la farsa. Los ratones se dividieron en dos grupos para la radiación o el tratamiento simulado y asegurar que no hay una diferencia significativa en el peso entre las cohortes. En el día del tratamiento, cuando los ratones tienen seis semanas de edad, pesar de nuevo todos los ratones y registrar su masa. Transportar suavemente ambas cohortes a la plataforma radiológica. Tenga cuidado para reducir al mínimo los niveles de estrés.
  3. Prepare la cámara de gas de anestesia isoflurano. Anestesie dos ratones, uno en el grupo de irradiación predeterminado, y otro en el grupo de control simulado. Preparar almohadilla térmica en el nivel bajo para el tratamiento postoperatorio.
  4. Siga los pasos 1.2 a 1.4 para el mouse para recibir irradiación. Para el ratón farsa, mantenga el ratón en la cámara de anestesia mientras que el tratamiento continúa. Hacer sure que cámara de anestesia es cerca de la plataforma CFIR así cualquier efecto sobre la radiación ambiental son factores pulg Después de que el destino se identifica en la TC, mueva el ratón sujetos bajo control robótico para alinear este objetivo con el haz de administración de la radiación. Entrada calcula parámetros (velocidad de rotación y duración del tratamiento) en el software de planificación de dosis.
  5. Una vez que el tratamiento de irradiación se ha completado, regrese ambos, farsa y ratones irradiados con almohadilla de calefacción, y monitorear hasta que se despiertan.
  6. Volver tanto farsa y ratones irradiados a las instalaciones de los animales. Supervise todos los días. Pesar los ratones cada media semana. Para confirmar la irradiación de la zona proliferativa específica hipotalámico, administrar inyecciones intraperitoneales de BrdU (50 mg / kg), tres días después del tratamiento y examinar la neurogénesis entre grupos por colabeling de inmunohistoquímica para BrdU y un marcador neuronal un mes después de la exposición inicial de BrdU (Figura 6) 2.

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Resultados

Evaluar Targeting guiada por TC y Precisión

La calibración mecánica del sistema es crítica para asegurar que los haces de todos los varios ángulos se cruzan en un solo punto. La calibración se lleva a cabo con un método basado en la formación de imágenes semiautomático, donde la precisión de alineación de extremo a extremo se ha medido para ser de 0,2 mm 29. Esta precisión es muy crítico como el volumen de la estructura de la eminencia mediana del hipotálamo es pequeña 2. ...

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Discusión

La irradiación focal guiada por tomografía computarizada (CFIR) es un enfoque novedoso y completo sistema capaz de entregar los campos de radiación a los objetivos en pequeños animales bajo control robótico utilizando CT-guía 32. La capacidad de CFIR para que emita haces altamente enfocados a los pequeños modelos animales proporciona nuevas oportunidades de investigación para colmar la investigación de laboratorio y la traducción clínica. En este trabajo se describe el enfoque CFIR para la entrega precisa de ...

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Divulgaciones

JW tiene una financiación de la investigación y de consulta acuerdos con Xstrahl, Inc.

Agradecimientos

Damos las gracias a C. Montojo, J. Reyes y M. Armadura de asesoramiento y asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de subvención F31 NS063550 (a DAL), un premio Basil O'Connor arranque Académico y subvenciones del Fondo Klingenstein y NARSAD (a SB). SB es un WM Keck Distinguido Académico Joven en la investigación médica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plataforma de investigación SARRPXstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP búnker de irradiaciónXstrahlOpcional, pero la exposición a la radiación debe limitarse con un blindaje de plomo alternativo
Película crómica GAF IPSGAFchromic ETB2
Fantoma de ratónGammex457Compre losas de agua sólida de 0.5 cm x 30 cm x 30 cm de Gammex y córtelas al tamaño deseado.
Anticuerpo antifosfohistona H2AX Ser139 para ratonesMillipore, Inc.05-636clon JBW301
Dieta alta en grasas para roedoresDietas de investigaciónD12492i60% de las calorías en forma de grasa, los alimentos deben ser irradiados
IsofluranoBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0.01 M Citrato de sodioFisher Scientific1.471 g de citrato de sodio disuelto en 500 ml de agua desionizada
Superfrost Plusdiapositivas Fisher Scientific12-550-15
DAPIFisher Scientificcontratinción nuclear
Se prefiere el medio de montajeFisher Scientific, Vectashield o Gelvatol

Referencias

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