Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Resumen

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Resumen

WRN La exonucleasa está involucrada en la resolución del daño del ADN que ocurre durante la replicación del ADN o después de la exposición a genotoxinas endógenas o exógenas. Es probable que desempeñe un papel en la prevención de la acumulación de intermediarios recombinógenos que, de otro modo, se acumularían en horquillas de replicación transitoriamente estancadas, lo que es coherente con un fenotipo hiperrecombinante de células que carecen de WRN. En los seres humanos, el dominio exonucleasa comprende una porción N-terminal de una proteína mucho más grande que también posee actividad helicasa, junto con sitios adicionales importantes para la interacción entre el ADN y la proteína. Por el contrario, en Drosophila, la actividad exonucleasa de WRN (DmWRNexo) está codificada por un locus genético distinto de la presunta helicasa, lo que permite la disección bioquímica (y genética) del papel de la actividad de la exonucleasa en los mecanismos de estabilidad del genoma. Aquí, demostramos un método fluorescente para determinar la actividad de la exonucleasa WRN utilizando DmWRNexo recombinante purificado y oligonucleótidos fluorescentes marcados al final. Este sistema permite una mayor reproducibilidad que los ensayos radiactivos, ya que los oligonucleótidos del sustrato permanecen estables durante meses, y proporciona un método más seguro y relativamente rápido para el análisis detallado de la actividad de la nucleasa, lo que permite determinar la polaridad, la procesividad y las preferencias del sustrato.

Introducción

Las nucleasas cumplen un papel vital en las células en la eliminación del ADN dañado, resolviendo estructuras no dúplex como las uniones de Holliday y proporcionando capacidad de lectura durante la replicación del ADN, tanto intrínseca dentro de las ADN polimerasas como extrínseca a ellas¹. Las nucleasas pueden actuar degradando secuencialmente el ADN de los extremos libres (exonucleasas) o rompiendo los enlaces fosfodiéster internos dentro de una molécula de ADN más larga (endonucleasas). La pérdida de la actividad de la nucleasa puede dar lugar a fenotipos muy específicos de inestabilidad del genoma. Mientras que la mutación del miembro de la familia helicasa RecQ, BLM, da lugar a tasas excesivamente altas de intercambio de cromátidas hermanas y tasas de cáncer elevadas a nivel mundial (revisado por Payne y Hickson²), la mutación de la proteína WRN altamente relacionada conduce al envejecimiento prematuro³; la principal diferencia significativa entre estos dos miembros de la familia es la presencia de un dominio exonucleasa 3'-5' con WRN⁴. La evidencia de un papel crítico de la exonucleasa WRN en el mantenimiento de la estabilidad del genoma se ha acumulado a partir del análisis de genotipos en pacientes con SW⁵, junto con estudios de mutación puntual y deleción en células humanas, respaldados por estudios cristalográficos del dominio de exonucleasa aislado⁶. Sin embargo, la cooperación y la comunicación cruzada entre la actividad exonucleasa de WRN y su actividad helicasa central⁷ dificulta desentrañar la funcionalidad de cada una y sus contribuciones relativas a la estabilidad del genoma. En plantas y animales con metazoos inferiores, la actividad exonucleasa WRN está presente en un solo polipéptido que carece de actividad helicasa^8-10 (revisado en Cox y Boubriak¹¹); se ha demostrado bioquímicamente en Arabidopsis que esta exonucleasa actúa coordinadamente con la helicasa WRN afín, reconstituyendo eficazmente las actividades enzimáticas combinadas observadas en los vertebrados WRN⁹. Hemos estudiado la exonucleasa WRN en Drosophila ya que las excelentes herramientas genéticas permiten analizar el impacto de la mutación de la exonucleasa (sin impactar en la presunta helicasa afín) a nivel de todo el organismo y a través del desarrollo^10,12. Además, hemos clonado, expresado y purificado la exonucleasa recombinante de Drosophila WRN (DmWRNexo) que permite un análisis bioquímico completo de sus propiedades enzimáticas^13,14.

El análisis de nucleasas in vitro se ha realizado tradicionalmente utilizando oligonucleótidos radiomarcados, evaluando la degradación mediante la búsqueda de escalonamiento de productos en geles de acrilamida^4,8,15. Si bien son sensibles, estos ensayos no son cuantitativamente reproducibles en el día a día debido a la desintegración radiactiva de los sustratos marcados. Además, la manipulación y eliminación de los reactivos radiactivos plantea importantes problemas medioambientales y sanitarios; El abastecimiento de radioetiquetas también se está volviendo cada vez más problemático. Un método alternativo reciente evalúa la cantidad del producto final de degradación por espectrometría de masas¹⁶. Sin embargo, lleva mucho tiempo (tarda varios días), requiere equipo especializado y la lectura es la cantidad de producto final (un solo nucleótido), por lo que no es adecuado para la medición sensible de aspectos como la procesividad de las enzimas o para determinar si algunos nucleótidos, secuencias o modificaciones provocan una pausa o detención de la nucleasa. Para superar estos problemas, hemos adaptado los ensayos tradicionales basados en gel para su uso con sustratos de oligonucleótidos fluorescentes, generando sustratos marcados de manera estable que se pueden usar de manera reproducible durante largos períodos de tiempo y, por lo tanto, permiten la comparación directa de las actividades de las nucleasas en diferentes condiciones.

Protocolo

1. Preparación de oligonucleótidos de sustrato

1. Sintetizar oligonucleótidos personalizados.
   1. Diseñar un oligonucleótido monocatenario con una molécula de fluoresceína conjugada 5'; esta será la columna vertebral de cada sustrato. (Tenga en cuenta que esto es para una exonucleasa de 3'-5'; para una exonucleasa de polaridad de 5'-3', use una hebra de columna vertebral conjugada de 3'). Si no se conoce la polaridad, se deben probar tanto 3' como 5'.
   2. Diseñe hebras complementarias de modo que cuando se recocen en el oligonucleótido marcado con fluorescencia, se formen los sustratos dúplex de elección. Tenga en cuenta que la hebra complementaria no se conjuga con un fluoróforo. Al realizar el pedido, especifique PAGE-purification (la desalinización no es suficiente).
   3. Almacene las existencias de oligonucleótidos tamponadas en 10 mM a 1 nmol/μl a -20 °C y en la oscuridad.
2. Mezcle el oligonucleótido marcado con cada oligonucleótido complementario no marcado en una proporción molar de 1:1,2 de tampón marcado:no marcado (10 mM de Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA pH 8,0, 50 mM de NaCl). (Nota: lo más deseable es una proporción de 1:1, pero es más importante que TODA la hebra etiquetada esté unida. Las proporciones de 1:1 a 1:1,5 pueden funcionar).
3. Calentar un baño de agua o un bloque de calor a 95 °C y colocar la mezcla de recocido en él durante 3 minutos, luego apagar y dejar que el conjunto se enfríe lentamente (1 °C/min) a menos de 30 °C.
4. Compruebe el recocido completo del oligonucleótido marcado ejecutando el sustrato dúplex resultante en un gel de poliacrilamida al 10% nativo (10% 19:1 acrilamida:bis-acrilamida en 1x Tris-Borato-EDTA (TBE, 89 mM de base Tris, 89 mM de ácido bórico, 2 mM EDTA) polimerizado con 0,05% p/v persulfato de amonio (APS) y 0,005% v/v TEMED). Visualice a través de PhosphorImager (consulte la sección 5 a continuación).

2. Preparación de geles de acrilamida

1. Configure el sistema de fundición en gel, por ejemplo, el equipo de gel Hoefer SE400 con placas de 16 cm x 18 cm y espaciadores de 1,5 mm.
   1. Limpie a fondo las placas de vidrio y los espaciadores con detergente y agua. Use guantes limpios para evitar volver a ensuciar las placas con aceite de los dedos, lo que dificultaría la formación consistente de gel.
   2. Enjuague las placas con abundante agua destilada (desionizada) para eliminar los residuos de detergente, luego limpie con un pañuelo sin pelusa (por ejemplo, toallitas Kim).
   3. Finalmente, rocíe con etanol al 70% y limpie: las placas de vidrio deben chirriar si están limpias. Déjelo a un lado en posición vertical para permitir que se evapore lo último del etanol.
   4. Limpie el resto del equipo de formación de gel con agua destilada (use detergente primero si es necesario) y seque.
   5. Ensamble las placas de vidrio y los espaciadores en la plataforma de formación de gel, asegurándose de que el sistema sea a prueba de fugas.
2. Prepare la solución de gel con el porcentaje deseado de poliacrilamida
   1. Para el ensayo de nucleasas, utilice geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 14% con urea 8 M en 1x TBE.
   2. Para hacer 100 ml (suficiente para 2 geles con mucho exceso para fugas) tome 48,05 g de urea en un vaso de precipitados ancho y agregue 35 ml de solución de acrilamida 19:1 al 40% y 10 ml de TBE 10x (890 mM de Tris, 890 mM de ácido bórico, 20 mM de EDTA, pH 8,3 con NaOH). PRECAUCIÓN: Use guantes: la acrilamida es una potente neurotoxina. Disuelva la urea con una barra de agitación y una placa de agitación magnética (esto llevará algún tiempo).
   3. Cuando se disuelva, añadir agua desionizada milliQ a 100 ml. Filtrar-esterilizar con una membrana de 0,22 μm. Si no se va a utilizar inmediatamente, desgasifique brevemente con un equipo de succión y guárdelo en la oscuridad (se conservará unos días). No refrigere ya que la urea precipitará.
3. Polimerizar y fundir el gel.
   1. Tomar la ureacrilamida y añadir 0,5 ml de persulfato de amonio (APS) al 10% (p/v) y 50 μl de TEMED. Agite el recipiente lentamente para mezclar sin impartir aire (lo que inhibirá la polimerización) y vierta en el formador de gel. Actúe rápidamente o el gel puede fijarse antes de que termine de verterse.
   2. Añada el peine adecuado para formar pocillos para la carga de muestras (elegido según el equipo de gel y el número de muestra a analizar, por ejemplo, los peines de 15 o 29 dientes son adecuados para su uso con el equipo de gel Hoefer). Compruebe que no se introduzcan burbujas de aire debajo de los dientes del peine.
   3. Dejar reposar. Vigile si hay fugas. La polimerización completa se retrasa en los peines debido al contacto con la atmósfera. Cuando los pocillos estén firmes, se fijará el resto del gel.
   4. Retire los peines y enjuague la acrilamida no polimerizada con agua y una pipeta.
4. Prepara el gel para correr.
   1. Coloque el gel de yeso en el sistema de funcionamiento de gel y agregue la cantidad adecuada de 1x tampón de funcionamiento TBE en la cámara inferior y en los pocillos de gel. El gel ya está listo para ser cargado.

3. Preparación de la proteína DmWRNexo recombinante marcada con His

1. Expresión bacteriana de la proteína DmWRNexo
   1. Usando un circuito de inoculación, recoja las bacterias raspando la superficie de las reservas de glicerol mantenidas a -80 °C (las bacterias son E. coli T7 Iq LysY (NEB) transformadas con pIVEX2.3d-DmWRNexo). Escurrir en placas de agar LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 15 g de agar hecho hasta 1 L con agua destilada y pH ajustado a 7,4) con 50 μg/ml de ampicilina. Incubar invertido durante la noche a 37 °C.
   2. Elija una sola colonia del plato en 50 ml de LB (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl compuesto por hasta 1 L con agua destilada) suplementado con 50 μg/ml de ampicilina (compuesta en agua y esterilizada con filtro hasta 0,22 μm). Crecer agitando a 220 rpm a 37 °C durante la noche.
   3. Inocular 1,8 L (alícuotas de 600 ml cada una en tres matraces cónicos de 2 L para asegurar una aireación adecuada) de LB-ampicilina con el cultivo nocturno de 50 ml y crecer hasta OD₆₀₀ ~ 0,8. Añadir IPTG hasta una concentración final de 0,7 mM e incubar a 26 °C (para evitar la agregación de proteínas) agitando durante 4-8 horas.
   4. Coseche el pellet de celda por centrifugación a 8.000 rpm 4 °C durante 10 min: use 6 botellas de centrífuga de plástico estériles de 500 ml con 300 ml de suspensión de celdas en cada una. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un pequeño volumen (10 ml) del LB-amp original, transfiéralo a un tubo Falcon de 15 ml y luego vuelva a girar a 5.000 rpm para pellet las celdas: retire el sobrenadante nuevamente y congele a -80 °C (esto ayuda con la lisis).
2. Lisis celular bacteriana
   1. Prepare 3,2 ml de tampón de lisis que contenga 1 ml de NaCl 5 M, 1 ml de DTT 1 M, 200 μl de benzamidina 1 M y 1 ml de lisozima de 10 mg/ml (resuspendida en agua destilada).
   2. A cada pellet derivado de 300 ml de suspensión bacteriana, añadir 320 μl de tampón de lisis. Vuelva a suspender tanto como sea posible: use una punta p1000 "recortada" y revuelva, así como pipetee hacia arriba y hacia abajo. Incubar en hielo 20 min. Agregue 100 μl adicionales de tampón de lisis y mezcle bien, luego transfiera la mayor cantidad posible del lisado resuspendido a un tubo de microfuga (será muy viscoso y difícil de pipetear).
   3. Centrifugar el lisado a 14.000 rpm en un rotor de microfuga preenfriado a 4 °C durante 30 min, luego llevar el sobrenadante a un tubo de microfuga limpio: este contiene la proteína recombinante.
3. Purificación de su trampa
   1. Preparación de los reactivos: Etiquetar 5 tubos de microfuga para cada una de las siguientes concentraciones de imidazol: 40 mM, 60 mM, 100 mM, 300 mM y 500 mM (por ejemplo, etiqueta 40-1, 40-2, 40-3, etc.), que se utilizarán para recoger las fracciones de la columna. Guarde los tubos con hielo en una rejilla con las tapas abiertas (pero cúbralos sin apretar con film transparente o similar para mantenerlos limpios mientras prepara todo lo demás). Prepare 25 ml de 20 mM de imidazol y 10 ml de caldos de cada una de las otras concentraciones de imidazol en tubos universales de 25 ml, utilizando 1x PBS (8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄, 0,24 g de KH₂PO₄, pH ajustado a 7,4 y hecho hasta 1 L con agua destilada) como diluyente.
   2. Ajuste el lisado bacteriano a 20 mM de imidazol utilizando un volumen adecuado de solución madre de imidazol 2 M, y ajuste el volumen a al menos 1 ml (<5 ml) utilizando 20 mM de imidazol.
   3. Lavar una columna His-Trap (Amersham) de 1 ml con 10 ml de agua MilliQ utilizando una jeringa de 5 o 10 ml con Luer lock y una presión manual suave, luego equilibrar la columna pasando 10 ml de imidazol de 20 mM compuesto en PBS (ver paso 3.3.1 arriba).
   4. Cargue el lisado en la columna. A medida que el lisado se carga en la columna, se puede experimentar una contrapresión significativa; Esto es perfectamente normal. No caiga en la tentación de aplicar demasiada fuerza a la jeringa y mantenga una presión constante y uniforme. Es habitual ver un leve cambio de color a medida que el lisado entra en la columna. Recoja el flujo en un frasco de bisutería Sterilin (7 ml de capacidad) y guárdelo en hielo.
   5. Lave la columna con 10 ml de imidazol de 20 mM y recoja esto en un tubo universal de 25 ml sobre hielo, etiquetado como "lavado".
   6. Pase 5 ml de imidazol de 40 mM a través de la columna, recogiendo fracciones de 1 ml en cada uno de los tubos de microfuga (etiquetados con 40.1, 40.2, 40.3, etc.): observe cuidadosamente el émbolo de la jeringa, ya que esto permite la medición de 1 ml.
   7. Ahora pase secuencialmente 5 ml de cada uno de los 60 mM, 100 mM, 300 mM y 500 mM de imidazol, recogiendo nuevamente 5 fracciones de 1 ml en cada concentración de sal.
4. Análisis de fracciones de columna
   1. Dot blot: Puntee 2 μl de cada fracción de columna (y también cargue, fluya y lave) sobre una hoja de nitrocelulosa - es más fácil si esto se premarca con una cuadrícula con un lápiz suave). Deje secar al aire. Procese el dot blot bloqueándolo durante 15 min a 1 h a temperatura ambiente en leche en polvo descremada al 5% compuesta en PBS con 0.2% v/v Tween 20, luego lave en PBS-Tween varias veces e incube con el anticuerpo HRP-anti-his diluido 1:500 en PBS-Tween durante 30-60 min. Lave abundantemente con PBS-Tween y luego PBS, y detecte los anticuerpos unidos mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL), visualizada en Hyperfilm MP. Este punto de transferencia proporciona una excelente idea de las fracciones máximas antes del análisis SDS-PAGE, y puede informar sobre los pasos de purificación posteriores si es necesario (por ejemplo, si la estabilidad de la proteína es un problema, es posible agrupar las fracciones máximas en función de los resultados de la transferencia de puntos y cargarlas directamente en las columnas de filtración de gel; consulte el paso 3.5 a continuación).
   2. SDS-PAGE: Recoja 50 μl de cada fracción de columna en un tubo de microfuga etiquetado que contenga 50 μl de colorantes de carga 2x SDS-PAGE (4% p/v de SDS, 20% v/v glicerol, 120 mM de Tris-HCl pH 6.8 con 200 mM de DTT). Hervir estas muestras durante 5 minutos a 95-100 °C (tenga en cuenta que si utiliza un bloque caliente sin tapa caliente, haga un pequeño agujero en la tapa de cada tubo con una aguja de jeringa de calibre estrecho para evitar que los tubos "exploten" a medida que se calientan). Ejecute minigeles SDS-PAGE al 10% cargando 10 μl de cada fracción de columna y tiña con azul brillante de Coomassie para verificar las fracciones máximas y el % de pureza de la proteína. Si es necesario, también es posible realizar una transferencia occidental para la proteína marcada con His mediante la transferencia de proteínas separadas por SDS-PAGE a nitrocelulosa; bloquee las membranas con leche descremada al 5% en PBS-0.2% Tween 20, luego lave y pruebe con el anticuerpo anti-his conjugado con HRP (1:500) como para el dot blot.
5. Para aumentar la pureza, las fracciones pico de la columna his-trap pueden agruparse y cargarse en una columna de filtración de gel Superdex 75 con elución en sal creciente (como se describió anteriormente Boubriak et al.¹³ y Mason et al. ¹⁴).

4. Ensayo de nucleasa

1. Hacer existencias de trabajo de sustratos.
   1. Utilice 20 pmol de sustrato por reacción (aunque esto puede variar según la pregunta a tratar), por lo que un material de trabajo conveniente es de 200 pmol/μl (es decir, 10x). Las existencias de trabajo se componen en pequeños volúmenes de tampón de recocido (10 mM de Tris-HCl pH7,6, 1 mM de EDTA pH 8,0, 50 mM de NaCl) o en 10 mM de Tris-HCl pH 7,0 (hasta pH 8,5, según la nucleasa) sin sal ni EDTA, según la sensibilidad de la enzima o el ensayo a realizar.
   2. Mantener a 4 °C y en la oscuridad (envuelto en papel de aluminio). Los sustratos duran muchas semanas sin pérdida de la integridad dúplex ni de la señal fluorescente.
2. Ensaye la concentración de proteínas exonucleasas mediante análisis colorimétrico o espectrometría UV en Abs₂₆₀.
   1. Almacenar en pequeñas alícuotas a -80 °C.
   2. Si las muestras se congelan/descongelan una vez, suponga una tasa de plegamiento incorrecto de proteínas del 5% (o defina empíricamente para cada proteína que se va a analizar) y ajuste las concentraciones en consecuencia.
   3. Deseche las proteínas para el análisis de la actividad de la exonucleasa después de dos ciclos de congelación/descongelación, y anote el estado de la proteína para cada experimento.
3. Diseñe, experimente y calcule las cantidades de mezcla maestra (MM) para las muestras.
   1. Haga un MM que contenga todos los componentes comunes a las muestras que se están analizando (generalmente todo excepto la enzima o el sustrato) para disminuir la variación entre muestras.
   2. Tenga en cuenta el error de pipeteo al formar el MM, por ejemplo, calcule los volúmenes de N muestras haciendo suficiente para (N + 0,1N) muestras.
   3. Configure las reacciones en un volumen total de 20 μl/muestra, que contenga 1 pmol de enzima y 20 pmol de sustrato (por defecto antes de la optimización; obviamente, las cantidades varían según lo que se esté probando, por ejemplo, altere la cantidad de enzima si se prueba el efecto de la concentración de enzima). Para DmWRNexo, se encontró empíricamente que el tampón óptimo para la actividad de la nucleasa contenía 40 mM de Tris-HCl pH 8.0, 4 mM MgCl₂, 5 mM de ditiotreitol, con 0.1 mg/ml de BSA de grado de biología molecular.
4. Configura las reacciones.
   1. Mantenga todos los reactivos a 4 °C (cubitera o criorack).
   2. Constituya la mezcla maestra y la alícuota en el número adecuado de tubos de microfuga estériles de 0,5 ml sin DNasa. Incluya un control sin enzimas para visualizar el sustrato inicial (control no degradado).
   3. Ajuste un bloque de calor a la temperatura adecuada para la actividad enzimática (37 °C, con un punto de tiempo final de 30 min fue óptimo para DmWRNexo, aunque esto puede necesitar determinarse empíricamente comparando la actividad de la enzima elegida en un rango de temperaturas y tiempos). Los posibles inhibidores enzimáticos comúnmente presentes en los tampones deben probarse cuidadosamente (por ejemplo, el EDTA inhibe el DmWRNexo, al igual que el exceso de ATP¹⁴, presumiblemente por quelación del Mg²⁺ crítico para la actividad de la nucleasa). Tenga en cuenta que incluso las concentraciones altas de imidazol (>300 mM) no tienen ningún impacto en la actividad de la enzima DmWRNexo ni apagan la fluorescencia.
   4. Prepare la solución STOP (80% Formamida, 1x TBE). Esto es en 3x. Esto puede contener colorantes como el azul de bromofenol si es necesario. Tienda en RT.
   5. Coloque lo siguiente cerca del bloque de calor: los reactivos finales que se agregarán a la mezcla de reacción (generalmente enzimas); una pipeta y puntas de 1-10 μl, un temporizador, un criorack o cubo de hielo y una solución STOP.
5. Inicia la reacción.
   1. Configure el temporizador para agregar enzima al primer tubo. Coloque el tubo en el bloque de calor.
   2. Continúe agregando enzima al resto de los tubos a intervalos apropiados. (15 segundos es suficiente para reacciones simples que solo requieren una solución STOP para completarse). Coloque en el bloque de calor tan pronto como se haya agregado la enzima.
6. Detén la reacción.
   1. A medida que el temporizador alcance el tiempo correcto (por ejemplo, 15 min), añada 10 μl de solución STOP a la primera muestra y mezcle mediante pipeteo. Coloque inmediatamente en hielo / en el criorack.
   2. Continúe deteniendo las reacciones en los intervalos de tiempo apropiados y en el mismo orden en que se configuraron para que cada reacción haya tenido exactamente el mismo tiempo de incubación.
7. Las muestras ya están listas para cargarse en el gel desnaturalizante preparado.
   1. Cargue la mitad (o la totalidad) de cada muestra utilizando puntas de carga de gel para un pipeteo preciso. A los niveles de oligonucleótidos utilizados en la reacción, la mitad de la reacción dará una buena salida para la visualización y permitirá que se repita (por ejemplo, si el gel inicial no funciona correctamente).
   2. Es conveniente cargar 1x solución STOP que contenga colorante (por ejemplo, azul de bromofenol) en uno o más carriles para determinar cómo está funcionando el gel.
   3. Los oligonucleótidos fluorescentes de tamaños conocidos pueden analizarse junto a las muestras como marcador de tamaño.
8. Corre el gel.
   1. Añada la cámara tampón de funcionamiento superior al aparato de gel y llénela con tampón de funcionamiento (1x TBE), asegurándose de que las muestras no se alteren. Compruebe si hay fugas en el tampón.
   2. Conecte el equipo de gel a una fuente de alimentación y hágalo funcionar a 200 V (voltaje constante) durante 150-200 minutos o hasta que el tinte azul de bromofenol (si se usa) esté a unos dos tercios del camino por el gel (corre alrededor del nivel de ADN de 10nt en este porcentaje de gel). Supervise las fugas del tampón, que pueden sesgar o impedir la separación.
   3. Detenga el gel y retírelo del aparato en funcionamiento.

5. Análisis de gel e imágenes

1. Determine la sensibilidad del generador de imágenes que se utilizará, por ejemplo, el Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager puede detectar la fluorescencia de la fluoresceína utilizando un láser azul de 473 nm, utilizando su mayor configuración de sensibilidad de F1000 y la lectura de píxeles más pequeña (resolución) de 50 μm.
2. Escanea el gel.
   1. Retire los espaciadores y una placa de gel con cuidado. Enjuague bien (pero con cuidado) el gel que queda en la otra placa de gel para eliminar los rastros de urea precipitada que, de otro modo, interferirían con la exploración.
   2. Coloque la placa (con el gel aún adherido) sobre la cara de vidrio del soporte de gel y colóquela en el generador de imágenes. Anote las coordenadas del gel en el vidrio (si no llena toda la superficie).
   3. Abra el software apropiado en la computadora conectada y escanee la región anotada del área de escaneo donde se encuentra el gel. Utilice las mejores condiciones determinadas en el paso 5.1. El archivo resultante será relativamente grande (varios MB), pero la imagen se puede recortar y comprimir si es necesario.
   4. Guarde y, a continuación, exporte como un archivo que pueda ser leído por el software de análisis, por ejemplo, exporte como un .tiff para el análisis con ImageJ.
3. Analice los datos.
   1. Un ensayo de exonucleasa exitoso causará la degradación del sustrato secuencialmente a lo largo del oligonucleótido hacia el fluoróforo, lo que dará como resultado un patrón característico en forma de escalera de fragmentos de ADN fluorescente en el gel. Las especies con mayor movilidad en el gel (que corren más lejos) son más pequeñas que el sustrato de partida no degradado y, por lo tanto, representan productos de la degradación de la exonucleasa.
   2. Utilice la herramienta 'Gels' de ImageJ para cuantificar las intensidades relativas de las especies en cada carril en función de su movilidad, con el fin de determinar los niveles de degradación y, por tanto, la actividad de la exonucleasa en cada muestra.

Resultados

Realizar el análisis in vitro de la actividad exonucleasa requiere varios pasos preparatorios además del análisis propiamente dicho. En la Figura 1 se muestra un resumen de los procedimientos.

Antes de realizar ensayos de exonucleasa basados en fluorescencia, es fundamental optimizar la detección del sustrato de oligonucleótido marcado fluorescentemente tras su separación en geles de urea-acrilamida, utilizando un sistema de imagen fluorescente adecuado. La elección ...

Discusión

La determinación de la actividad exonucleasa de las proteínas purificadas requiere el análisis de los productos de escisión del ADN. La escisión secuencial del ADN por exonucleasas se puede visualizar mediante la separación de productos de escisión marcados en geles de acrilamida. Históricamente, esto implicó el etiquetado final del sustrato de ADN con un radiomarcado (por ejemplo, ³²P o ³⁵S), pero con las desventajas inherentes al uso del radiomarcado (costo, problemas de seguridad e inest...

Materiales

Equipment

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo/Material
Oligonucleótidos personalizados	Eurogentec		Es necesario obtenerlos a alta pureza p. ej. con purificación PAGE.
		5'FLO	fluoresesceína-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'burbuja
			5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Solución de acrilamida	Severn Biotech	20-2400-05	PRECAUCIÓN: neurotoxina potente, por lo que se deben usar guantes en todo momento
Columnas His-Trap (1 ml)	GE Healthcare	17-5247-01
Todos los demás reactivos	de cualquier proveedor		Es necesario el grado de biología molecular (libre de DNasa); De manera similar, los tubos de microfuge deben estar libres de ADNasa y RNasa<
Lector	Fuji
V2.02	FujiFilm
Image Gauge V3.3	FujiFilm

de confianza td colspan="4">Hoefer SE400 aparato de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fósforo y fluorescencia de imágenes