Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

Resumen

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Resumen

WRN La exonucleasa está involucrada en la resolución del daño del ADN que ocurre durante la replicación del ADN o después de la exposición a genotoxinas endógenas o exógenas. Es probable que desempeñe un papel en la prevención de la acumulación de intermediarios recombinógenos que, de otro modo, se acumularían en horquillas de replicación transitoriamente estancadas, lo que es coherente con un fenotipo hiperrecombinante de células que carecen de WRN. En los seres humanos, el dominio exonucleasa comprende una porción N-terminal de una proteína mucho más grande que también posee actividad helicasa, junto con sitios adicionales importantes para la interacción entre el ADN y la proteína. Por el contrario, en Drosophila, la actividad exonucleasa de WRN (DmWRNexo) está codificada por un locus genético distinto de la presunta helicasa, lo que permite la disección bioquímica (y genética) del papel de la actividad de la exonucleasa en los mecanismos de estabilidad del genoma. Aquí, demostramos un método fluorescente para determinar la actividad de la exonucleasa WRN utilizando DmWRNexo recombinante purificado y oligonucleótidos fluorescentes marcados al final. Este sistema permite una mayor reproducibilidad que los ensayos radiactivos, ya que los oligonucleótidos del sustrato permanecen estables durante meses, y proporciona un método más seguro y relativamente rápido para el análisis detallado de la actividad de la nucleasa, lo que permite determinar la polaridad, la procesividad y las preferencias del sustrato.

Introducción

Las nucleasas cumplen un papel vital en las células en la eliminación del ADN dañado, resolviendo estructuras no dúplex como las uniones de Holliday y proporcionando capacidad de lectura durante la replicación del ADN, tanto intrínseca dentro de las ADN polimerasas como extrínseca a ellas¹. Las nucleasas pueden actuar degradando secuencialmente el ADN de los extremos libres (exonucleasas) o rompiendo los enlaces fosfodiéster internos dentro de una molécula de ADN más larga (endonucleasas). La pérdida de la actividad de la nucleasa puede dar lugar a fenotipos muy específicos de inestabilidad del genoma. Mientras que la mutación del miembro de la familia heli....

Protocolo

1. Preparación de oligonucleótidos de sustrato

1. Sintetizar oligonucleótidos personalizados.
   1. Diseñar un oligonucleótido monocatenario con una molécula de fluoresceína conjugada 5'; esta será la columna vertebral de cada sustrato. (Tenga en cuenta que esto es para una exonucleasa de 3'-5'; para una exonucleasa de polaridad de 5'-3', use una hebra de columna vertebral conjugada de 3'). Si no se conoce la polaridad, se deben probar tanto 3' como 5'.
   2. Diseñe hebras complementarias de modo que cuando se recocen en el oligonucleótido marcado con fluorescencia, se formen los sustratos dúplex de elección. Tenga en cuenta que la hebra complement....

Resultados

Realizar el análisis in vitro de la actividad exonucleasa requiere varios pasos preparatorios además del análisis propiamente dicho. En la Figura 1 se muestra un resumen de los procedimientos.

Antes de realizar ensayos de exonucleasa basados en fluorescencia, es fundamental optimizar la detección del sustrato de oligonucleótido marcado fluorescentemente tras su separación en geles de urea-acrilamida, utilizando un sistema de imagen fluorescente adecuado. La elección .......

Discusión

La determinación de la actividad exonucleasa de las proteínas purificadas requiere el análisis de los productos de escisión del ADN. La escisión secuencial del ADN por exonucleasas se puede visualizar mediante la separación de productos de escisión marcados en geles de acrilamida. Históricamente, esto implicó el etiquetado final del sustrato de ADN con un radiomarcado (por ejemplo, ³²P o ³⁵S), pero con las desventajas inherentes al uso del radiomarcado (costo, problemas de seguridad e inest.......

Materiales

Equipment

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo/Material
Oligonucleótidos personalizados	Eurogentec		Es necesario obtenerlos a alta pureza p. ej. con purificación PAGE.
		5'FLO	fluoresesceína-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'burbuja
			5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 Solución de acrilamida	Severn Biotech	20-2400-05	PRECAUCIÓN: neurotoxina potente, por lo que se deben usar guantes en todo momento
Columnas His-Trap (1 ml)	GE Healthcare	17-5247-01
Todos los demás reactivos	de cualquier proveedor		Es necesario el grado de biología molecular (libre de DNasa); De manera similar, los tubos de microfuge deben estar libres de ADNasa y RNasa<
Lector	Fuji
V2.02	FujiFilm
Image Gauge V3.3	FujiFilm

de confianza td colspan="4">Hoefer SE400 aparato de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fósforo y fluorescencia de imágenes