Artículo de método

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para

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DOI:

10.3791/50730

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15 de octubre de 2013

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Centre for Understanding and Preventing Infection in Children, University of British Columbia

En este artículo

Resumen

Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior.

Resumen

La investigación de los niveles de proteína intracelular de especies bacterianas es de importancia para la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades causadas por estos organismos. Aquí se describe un procedimiento para la extracción de proteína a partir de especies de Burkholderia basado en la lisis mecánica usando perlas de vidrio en presencia de ácido tetraacético etilendiamina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo en tampón fosfato salino. Este método se puede utilizar para diferentes especies de Burkholderia, para diferentes condiciones de crecimiento, y es probable adecuado para el uso en los estudios proteómicos de otras bacterias. Tras la extracción de proteínas, una de dos dimensiones (2-D) electroforesis en gel de la técnica proteómica se describe para estudiar los cambios globales en los proteomas de estos organismos. Este método consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, seguida de separación sobre la base de peso molecularpor electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. La visualización de proteínas separadas se lleva a cabo mediante tinción con plata.

Introducción

El género Burkholderia comprende más de 62 especies, organismos Gram negativas aisladas a partir de una amplia gama de nichos, y se divide en dos grupos principales 1,2. El primer grupo incluye a los organismos phytotrophic humana, animal y, y la mayoría de los estudios se han centrado en las especies patógenas de este grupo debido a su importancia clínica. Los miembros más patógenas son B. y B. pseudomallei mallei (que causa melioidosis y el muermo, respectivamente) y 3,4 patógenos oportunistas (las 17 especies definidas del complejo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causan la enfermedad de la fibrosis quística (FQ) y enfermedad granulomatosa crónica (CGD) 1. El segundo grupo, con más de 30 especies no patógenas, incluye bacterias asociadas a las plantas o al medio ambiente, y se consideran potencialmente beneficioso para el host 2.

Numerosas complicaciones surgen frinfección bacteriana OM con los miembros patógenas del género Burkholderia, como la transmisión del patógeno entre los pacientes, propagación de la enfermedad y el fracaso del tratamiento debido a la resistencia intrínseca o adquirida a los antibióticos que hacen difícil de erradicar en la mayoría de los casos 6-9. Por lo tanto, obtener una comprensión más clara de la base para el establecimiento de la infección bacteriana es vital para el tratamiento de enfermedades causadas por estos organismos. Con el fin de profundizar en el establecimiento de la infección, se requieren extensas investigaciones sobre los componentes bacterianos asociados con la patogénesis. Los estudios centrados en el análisis proteómico de organismos Burkholderia utilizando enfoques proteómicos describen proteínas que han sido implicados en la patogénesis bacteriana, así como cambios en su proteoma perfiles 10-16.

Métodos de extracción de proteínas utilizando ultrasonidos y los ciclos de descongelado por congelación en tampón de lisis que contiene alta concentration de urea, tiourea en combinación con detergente y anfolitos se ha aplicado en Burkholderia estudios proteómicos 10-13. Aunque la urea es bastante eficiente para la desnaturalización de la proteína, se puede establecer un equilibrio en solución acuosa con isocianato de amonio, que puede reaccionar con los grupos de aminoácidos, formando de este modo artefactos (reacción de carbamilación) 17. Por lo tanto, se recomienda incluir anfolitos portadores, que actúan como eliminadores de cianato y evitar temperaturas por encima de 37 ° C 17. Además, para evitar cualquier interferencia química de tampón de lisis con la cuantificación de proteínas, el mismo tampón de lisis se puede utilizar para generar la curva estándar de modo que las muestras y los estándares tienen el mismo fondo 10. Otras metodologías implican el uso de tampones alcalinos y detergentes con períodos de incubación de calor 17,18; sin embargo estas condiciones podría inducir cambios en el proteoma y algunos detergentes no son compatibles con PRoteomics solicitud a menos que se incluyen los pasos subsiguientes de eliminación de detergente 17,18.

Después de la extracción y cuantificación adecuada, expresión global de proteína de cada proteína individual se puede estudiar usando enfoques proteómicos tales como bidimensional (2-D) electroforesis en gel. Esta técnica fue descrita por primera vez por O'Farell 19 y consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, y a continuación, en función de su peso molecular por electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. Debido a su resolución y sensibilidad, esta técnica es una herramienta poderosa para el análisis y la detección de proteínas a partir de fuentes biológicas complejas 19,20. Esta técnica de separación está actualmente disponible en los enfoques centrados en la proteína con la gran ventaja de la solución de isoformas de proteínas causadas por modificaciones post-transcripcionales o procesamiento proteolítico. Los cambios cuantitativospuede ser detectado mediante la comparación de la intensidad de la mancha correspondiente después de la tinción del gel 20. Sin embargo, esta técnica no es adecuada para la identificación de proteínas muy grandes, proteínas de membrana, proteínas muy básicas y ácidas o hidrófobos, y es una técnica algo laborioso y requiere mucho tiempo 20. Nuevos enfoques-péptido centrado (basadas en gel de no) que son más robustos y objetivo estén disponibles y se pueden utilizar para la comparación cuantitativa por métodos diferenciales de etiquetado de isótopos estables tales como el etiquetado de cisteína por afinidad isótopo codificados etiquetado (ICAT) 21, y grupo amino etiquetado por el etiquetado de isótopos para la cuantificación absoluta y relativa (iTRAQ) 22. El uso de una única técnica de proteómica podría dar información insuficiente, por lo que es necesario el uso de dos enfoques proteómicos complementarias para la mayoría de los cambios totalmente en la evaluación de proteoma. Sin embargo, la electroforesis en gel 2-D es ampliamente utilizado y se puede aplicar de forma rutinaria para Quancuantitativos de expresión de varias proteínas en diferentes organismos.

Aquí se describe una extracción de proteínas de células enteras y procedimientos de electroforesis en gel 2-D para las especies de Burkholderia que fueron adaptados y optimizados de la GE Healthcare 2-D electroforesis Principios y métodos Manual 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). La extracción de proteínas se llevó a cabo usando un batidor de bolas con perlas de vidrio en presencia de PBS que contenía EDTA 5 mM (ácido etilendiaminotetraacético) y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Este procedimiento permite la cuantificación de proteínas con la mínima degradación y es modificable para las aproximaciones proteómicas como se informó anteriormente 15,23,24. Electroforesis en gel 2-D se llevó a cabo utilizando 24 cm de largo inmovilizadas de pH 4-7 gradiente y las proteínas se separaron de acuerdo con su punto isoeléctrico. Luego se separaron las proteínas en función de su molecpeso cular por gel de SDS-poliacrilamida. Además, describimos un método de tinción de plata para la visualización de proteínas in situ, y un método de tinción de plata que es compatible para el análisis de espectrometría de masas. En conjunto, estos procedimientos pueden permitir la identificación de proteínas importantes de especies de Burkholderia que podrían estar involucrados en la patogénesis.

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Protocolo

1. Crecimiento Cultura (días 1 2)

  1. Haga crecer un cultivo iniciador: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo en un tubo a presión superior de 15 ml, a 37 ° C durante la noche de los rotadores. Diluir el crecimiento durante la noche a un OD 600 de 0,6. Añadir 1 ml de esta dilución a 100 ml de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm durante 16 h en fase estacionaria (SP), a una mejor aproximada, en un cultivo discontinuo, condiciones de infección y para asegurar que los factores de virulencia bacteriana bajo el control de factores de señal de fase estacionaria, tales como rpoS y quórum detección, se expresan. Alternativamente, las bacterias cultivadas en SP principios o mediados-o-logarítmica fase tardía se pueden utilizar para obtener información sobre la fase de adaptación bacteriana.
  2. Después de 16 h medir la OD 600 y asegurar la cultura ha alcanzado SP por comparación con una curva de crecimiento previamente construido en condiciones idénticas.

2. Extracción de proteínas (Día 3)

  1. Chill todos los medios de comunicación y soluciones de antemano en la nevera durante la noche. Todos los pasos deben realizarse con tubos en un cubo de hielo. Preenfriar una microcentrífuga y una centrífuga de alto rendimiento de Beckman Coulter (o equivalente) a 4 ° C y el rotor interior (rotor JA-20 =, = centrífuga J2-HS).
  2. Prepare fresco 0,1 M fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF, 174,19 g / mol) de solución en acetona disolviendo 0,0174 g de PMSF (PMSF "PRECAUCIÓN" es tóxico y corrosivo, use protectores para la cara y guantes) en 1 ml de acetona (acetona «caution» tóxico e inflamable, use protectores para la cara y guantes).
  3. Hacer una solución de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de 0,1 M de PMSF, 0,1 ml de EDTA 0,5 M, y 9,8 ml de PBS. Compruebe el diámetro exterior de la cultura hr 16 es aproximadamente donde debería estar en SP.
  4. Tomar 35 ml de la cultura y la transferencia de bacterias a un tubo de centrífuga Oakridge y centrifugar el cultivo a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C.
  5. Extraer el sobrenadante a un contenedor de residuos yañadir 35 ml de PBS enfriado y resuspender el precipitado. Centrifugar de nuevo a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C.
  6. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de PBS frío. Traslado al estériles Eppendorf de 2 ml y centrifugar 1 min a lo alto de la microcentrífuga a 14000 × ga 4 ° C. Quitar y desechar el sobrenadante.
  7. Añadir 1 ml de solución de PBS / EDTA / PMSF, resuspender el pellet y transferir a un tubo de 2 ml de tornillo tapa (con junta tórica) que contiene perlas ~ 0,5 ml de vidrio (preesterilizadas). Añadir el sedimento se volvió a suspender al tubo que contenía las perlas de vidrio y cordón de golpearlos a 4 ° C durante 1 min en frío-habitación. Haga esto 3 veces, poniendo la muestra en hielo después de cada golpe.
  8. Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min en la microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante y lo puso en un tubo de poliestireno de 5 ml estéril.
  9. Para aumentar el rendimiento de añadir 1 ml de solución de PBS / EDTA / PMSF al mismo tubo contiene perlas de vidrio de nuevo. Fiesta de bolas del tubo a 4 ° C durante 1 min. Haga esto 2x poner la muestra en hielo affiesta ter. Se centrifuga a 14.000 xg durante un minuto en la centrifugadora y eliminar el sobrenadante y añadir al sobrenadante del paso 2.8. Usar una jeringa de 1 ml y un filtro de 0,20 micras el sobrenadante del tubo de poliestireno a un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml estéril.
  10. En este punto, las muestras deben ensayarse para la cantidad de proteína, utilizando el kit de extracción de proteínas Pierce MicroBCA y partes alícuotas de 200 g deben congelarse a -80 ° C hasta que sea necesario.

3. Preparación de la muestra (Día 4)

  1. Preparar 25 ml solución de rehidratación (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de azul de bromofenol) y guárdela en 2,5 ml alícuotas a -20 ° C. Añadir 7 mg de ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol) justo antes del uso a una parte alícuota de la solución de rehidratación de stock 2,5 ml.
  2. Proceso descongelado muestras del paso 2,10 utilizando un 2-D Limpiar kit con resuspensión final en 450 l de solución de rehidratación de stock preparadas en el paso 3.1.

4. PrimeroDimensión Isoeléctrico (IEF) (Día 4)

Todos los pasos de esta sección están utilizando el Sistema IEF Ettan IGPhor.

  1. Configure las primeras tiras de IPG dimensión: soportes de tira limpia con la solución de limpieza tira y luego lavar con agua Milli-Q, dejar boca abajo para secar. Asignar a cada muestra un número de soporte de tiras de gel.
  2. Cargue la muestra a partir del paso de rehidratación en la segunda zona más amplia de la - end (). Utilice pinzas limpias para sacar tiras de gel de embalaje. Saque la capa protectora de las tiras de gel. Línea tiras cara rugosa hacia abajo en un movimiento lento deslizamiento para obtener las tiras mojadas en el camino a partir de (-) de extremo a extremo (+).
  3. Coloque papel secante humedecido con agua esterilizada en la parte superior del electrodo y en las tiras de gel para prevenir el agotamiento. Enjuague pinzas en-entre las rondas con agua purificada y etanol. Quite todas las burbujas, superponer finas con aceite mineral para evitar outs secos. Alinee los soportes de tiras de gel en la máquina.
  4. Ejecutar 12 horas a 20 ° C durante rehydración, 1 hora a 200 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1000 V, 0,5 horas a 4000 V, 12 h a 8000 V, 24 h a asimiento 300 V y se puede sacar en este momento.
  5. Después de IEF se terminó, se recomienda llevar a cabo la segunda dimensión electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, a menos que la tira IPG se están congeló a -80 ° C en Saran Wrap recubierto con aceite mineral para el análisis futuro. Alternativamente, con el fin de evitar el punto de rayas debido al acceso TDT es posible incluir un segundo paso de equilibrado de la tiras IPG antes de la segunda dimensión con un tampón que contiene yodoacetamida.

5. Segunda dimensión SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (Día 5)

Todos los pasos de esta sección están utilizando el aparato de electroforesis Ettan DALTsix.

  1. Para montar el aparato de colada de gel, limpiar a fondo todos los componentes y asegúrese de que las ruedas de gel esté nivelado y la unión de goma gris se lubrica con gel de silicona. Ponga el problema negrober tapón triangular en la parte inferior. Luego, colocar alternativamente el separador y las placas de vidrio con la placa más corta de cristal hacia delante. Asegúrese de que los separadores son en la espalda y la parte delantera. Llenar el espacio restante con las cargas (unos 5 hojas) por lo que la parte superior es plana. Coloque el panel delantero con la punta roja en el exterior. Utilice abrazaderas para apretar cada lado y apretar los tornillos inferiores.
  2. Preparación del gel: Añadir 297,3 ml de Duracryl, ("PRECAUCIÓN" Duracryl es el uso de tóxicos caretas y guantes), 147 ml de tampón Tris 1,5 M pH 8,8 y 143,3 ml de agua Milli-Q en un matraz con la punta de vacío que contiene un barra de agitación. Ponga la tapa en la parte superior y se mezcla la solución a una velocidad moderada con el vacío durante 20 min. El vacío se utiliza para desgasificar la solución. Hacer un fresco 10% de solución de persulfato de amonio (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g de APS a 2 ml de agua Milli-Q.
  3. Adición de la mezcla de gel a la máquina de colada de gel: Cuando se hace el vacío añadir 6 ml de 10% de dodecil sulfato de sodio (SDS, 228,38 g / mol)para el lado del matraz para evitar poner más burbujas en la solución. Añadir APS, revolver, añadir 0,25 ml de N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED, 116,20 g / mol) ("PRECAUCIÓN" TEMED es inflamable uso caretas y guantes) y revuelva.
  4. Verter la mezcla de gel en gel de máquina de colada a través de un embudo insertado en la parte posterior del aparato. Vierta hasta una pulgada por debajo de la placa corta. Añadir 1,5 ml de butanol saturado de agua a la parte superior del gel y envolver la parte superior con una envoltura Saran para evitar la deshidratación. Espere 1 hora para asegurar la polimerización completa.
  5. Comprobación del gel: Cuando el gel se hace (marque el frasco), desmontar la máquina de colada de gel por un sumidero. Compruebe la integridad del gel mientras se lava las placas de vidrio con agua tibia; no permita que entre agua en el plato. Vierta el butanol y enjuague la parte superior de gel dos veces con agua para deshacerse de butanol. Llene la parte superior con agua de nuevo y dejar reposar si los geles no se usan de forma inmediata.
  6. Preparación de las tiras de: Preparar la solución tampón de equilibrado de lacongelador (6 M urea, 75 mM de Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol). Esto puede ser preprepared y almacenado en 10 ml de alícuotas a -20 ° C. Disolver 0,1 g de DTT a una 10 ml de solución de tampón de equilibrio. Un tubo puede ser utilizado para dos tiras IPG. Coloca los geles de la cara de la tira hacia abajo en el buffer y deje reposar durante 30 min. Recuerde qué extremo es cuál.
  7. Preparación de la unidad de electroforesis (aparato de separación 2-D): Añadir 4,5 l de 1x tampón de electroforesis (25 mM de Tris base [121.1 g / mol], 192 mM de glicina [288,38 g / mol], y 0,1% w / v de SDS [288,38 g / mol]) al tanque de funcionamiento. Este tampón se puede utilizar durante un máximo de 3 veces. Gire la unidad de electroforesis en. Revise el nivel de agua en la máquina de refrigeración por agua y llenarlo con agua si es baja. Encender la máquina, pulse mode para comprobar la temperatura designada, la cual debe ser de 10 ° C.
  8. Hacer 1 L de tampón 2x ​​correr y 1 l de 1x de tampón de ejecución y almacenar a 4 ° C. Haga solución de agarosa de sellado: peso 0,25 g de agarosE y disolver en 50 ml de tampón 1x corriendo. Pulsos durante 15 segundos cada uno.
  9. Configuración de la unidad de electroforesis: Use pinzas para sacar cada tira y eliminar el exceso de tampón en ambos lados con una toalla de papel limpia. NO toque las tiras. Vierta el agua en la parte superior del gel y la línea de la parte superior del gel con tampón 1x corriente. Utilice pinzas limpias y colocar las tiras en la parte superior de la placa de largo, con la cara de gel hacia usted. Añadir tampón 1x a las tiras para lubricarlo. Tiras de diapositivas más adelante mediante el uso de tiras de plástico. Quite todas las burbujas en medio de la avenida principal y el gel.
  10. Añadir solución de agarosa-sellado a la parte superior de la tira para sellarlo. Repita este procedimiento para el resto de las tiras. Coloque las placas de vidrio que contienen los geles a base de gel y la menor en el depósito de gel. Asegúrese de que el nivel de tampón 1x en la cámara exterior está en la línea de fondo designado antes de poner la cámara superior en.
  11. Coloque el marco para la cámara de amortiguación superior en la parte superior de las placas de vidrio y asegúrese de que es toda la way abajo presionando la parte inferior hacia abajo. Utilice un embudo y añadir el tampón de desarrollo 2x en la cámara superior hasta la línea media. Utilice un embudo y añadir tampón de ejecución 1x a la cámara exterior hasta que alcanza la línea superior. Coloque la tapa en la parte superior y encienda la unidad de electroforesis y la fuente de alimentación.
  12. Ejecutar toda la noche a 52 V, 96 mA, 5 W. Compruebe si la corriente va buscando las burbujas en el alambre de plata en la parte superior. Ejecute el gel hasta que la línea principal es de 1 cm de la parte inferior.
  13. Las proteínas también se pueden analizar utilizando equipos y reactivos de otras compañías tales BIORAD o Hoefer, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6. Tinción con plata de los geles para la visualización del gel (día 5-6)

  1. Prepare una solución de arreglo 1 (800 ml de etanol, 200 ml de ácido acético, y 1000 ml de agua Milli-Q en la campana de humos en un cubo de plástico). La solución es buena para 6 geles. Gire todas las máquinas y se lleve a cabo toda la parte central de la unidad de electroforesis y pull en el fregadero. También poner el soporte blanco en el fregadero. Tire de la bandeja superior contiene el tampón 2x ​​ejecución.
  2. Desmontar el aparato y retirar los geles de las placas de vidrio en solución de arreglo 1. Los geles pueden ser identificados por cortar esquinas cuando se retiran de las placas de vidrio, el número de esquinas de corte correspondiente a la orden de gel en la máquina de colada.
  3. Coloque el recipiente con la solución de arreglo y los geles en un agitador durante al menos 1 hora de la noche a 4 ° C.
  4. La transferencia de los geles para fijar la solución de 2 (20 ml de 50% glutaraldehído, 600 ml de etanol, 5 g de tetrationato de potasio (302,46 g / mol), 136 g de acetato de sodio (82,03 g / mol), y agua Milli-Q para 2000 ml) y colocan en un agitador durante 1 hora.
  5. Lavar los geles 4x durante 15 minutos cada una en agua Milli-Q.
  6. Tinción de los geles en solución nitrato de plata (4 g de nitrato de plata (169,87 g / mol), 500 l de formaldehído, y agua Milli-Q para 2000 ml) durante 30 min o hasta 48 horas.
  7. Lave gel durante 1min en agua Milli-Q.
  8. Transferencia a solución de revelado (60 g de carbonato de sodio (105,99 g / mol), 300 l de formaldehído, 15 mg de tiosulfato de sodio (158,11 g / mol), y agua Milli-Q para 2000 ml) durante 5-30 min hasta que el gel se tiñe.
  9. Ponga los geles en solución de parada (100 g de Tris-base (121,14 g / mol), 40 ml de ácido acético y agua Milli-Q a 2.000 ml) durante 10 min.
  10. Para el almacenamiento, la transferencia de los geles de glicerol de la solución (40 ml de glicerina o de 400 ml, si se desea un almacenamiento a largo plazo, y 1.600 ml de agua Milli-Q) durante 10 minutos y luego secarlas con un secador de gel.
  11. Los geles se pueden visualizar después de la tinción utilizando sistemas de imagen, como un escáner / densitómetro, fotografiada con transiluminador de luz o de imágenes Gel. El software de análisis de imagen tales como PDQuest análisis 2-D de BioRad a continuación, se puede utilizar para obtener información cuantitativa y cualitativa de las proteínas en una muestra.

7. Gel de plata de tinción para el análisis de espectrometría de masas

  1. Fijar los geles en 50% de metanol, y ácido acético al 5% durante 1 hora.
  2. Lavar con metanol al 50% durante al menos 10 minutos a toda la noche.
  3. Lavar con agua destilada 3 veces durante 10 min.
  4. Sensibilizar con tiosulfato de sodio 0,02% (158,11 g / mol) 2x durante 15 min.
  5. Lave 3 veces en CHILLED 3x agua destilada durante 10 min.
  6. Sumergir en gel de solución de nitrato de plata ENFRIADA 1% (169,87 g / mol) durante al menos 20 min a 1 hora a 4 ° C
  7. Lavar 2x durante 1 min con agua destilada. Cambie la bandeja / cubo.
  8. Desarrollar en el 0,04% de formaldehído en el 2% de carbonato de sodio anhidro (105,99 g / mol) y desechar cuando se vuelve amarillo bastante rápido; tienen tres lotes y estar dispuestos a cambiar cada 5 min.
  9. Lavar en ácido acético al 5% y luego almacenar en ácido acético al 1%.
  10. Enjuague 1,5 ml tubos Eppendorf (para sostener llegar mancha recortes) con etanol de grado USP y de aire seco antes de su uso.
  11. Pinzas limpias, hojas de afeitar y superficies con metanol al 100%.
  12. Rocíe guantes y superficies con etanol.
  13. Manchas de Impuestos Especiales en una campana de flujo o un área de aire limpio. Spots pueden ser también extirpados usando un cortador de punto automático.
  14. Póngalos en tubos Eppendorf y barco en el hielo o mantenerse en la nevera.

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Resultados

Análisis comparativo de los perfiles de proteínas extraídas de un mismo cultivo bacteriano en dos ocasiones diferentes mostraron patrones similares de bandas indicando extracciones de proteínas con éxito. Proteínas de peso molecular extraídos oscilaron desde 10 hasta 150 kDa. La Figura 1 muestra representativa de Coomassie de gel de tinción de azul de las extracciones de proteínas de células enteras de multivorans Burkholderia (un miembro de la BCC) aislados clínicos cultivadas en LB o de levad...

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Discusión

Un método para la preparación de proteínas se ha descrito que puede extraer la mayoría de las proteínas Burkholderia con buena reproducibilidad. Esto se demuestra mediante la obtención de la misma perfil de proteínas a partir de dos preparaciones independientes realizados en diferentes días utilizando el mismo cultivo bacteriano crecido en LB o caldo YEM como se muestra en la Figura 1. La extracción fue eficiente para las bacterias cultivadas en medio líquido, sin embargo no hemos probado este ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca de la Universidad de British Columbia (BV) y las subvenciones de la Fibrosis Quística Canadá y canadienses Institutos de Investigación en Salud (DPS). Damos las gracias a Jacqueline Chung para la preparación inicial de los protocolos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)SigmaP7626Acetona tóxica y corrosiva
FisherA18-1
Tampón PBSBioscienceR028
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)FisherBP118-500tóxico
Perlas de vidrio (0.1 mm)Productos BioSpec11079101
Tubos de centrífuga Nalgene Oak Ridge, policarbonato (50 ml)VWR21009-342
Kit de extracción de proteínas MicroBCAPierce23235
Tubos de microcentrífuga Cónicos de 2,0 ml Tubos con tapón y junta tóricaFisher02-681-375
Kit de limpieza 2-DGE Healthcare80-6484-51
UreaInvitrogen15505-050Irritante
CHAPSAmersham Biosciences17-1314-01
Dithiothreitol (DTT)MPBiomedical, LCC856126Irritante
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cmAmersham Biosciences176002-46
DuracrylSoluciones Proteómicas80-0148Muy tóxico, cancerígeno
Persulfato de amonioFisherBP179-100Inflamable, tóxico, corrosivo
N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED)Invitrogen15524-010Inflamable
Dodecil sulfato de sodio (SDS)FisherBP166-500Toxicidad aguda, inflamable
AgarosaInvitrogen15510-027
EtanolFisherHC1100-1GLInflamable, tóxico
Ácido acéticoFisherA491-212Inflamable, corrosivo
GlutaraldehídoFisherG151-1Muy tóxico, corrosivo, peligroso para el medio ambiente
Tetrationato de potasioSigmaP2926Irritante
Acetato de sodioEM Science7510
Nitrato de plataSigma209139 Corrosivo, peligroso para el medio ambiente
FormaldehídoSigma252549
Tóxico Tiosulfato de sodioSigmaS7026
Tris BaseEMD9230
GlycineMPBiomedical, LCC808831
GlycerolMPBiomedical, LCC800688
MetanolFisherA412-4Inflamable, tóxico, peligroso para la salud
Carbonato de sodio anhidroEMDSX0400-3
Tóxico Aceite mineralACROS415080010
Equipo
Rotor ultracentrífugo JA-20Beckman Coulter334831
Mini BeadbeaterProductos Biospec3110BX
Sistema de enfoque isoeléctrico Ettan IPGphor II y accesoriosGE Healthcare80-6505-03www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Sistema de electroforesis vertical grandeGE Healthcare80-6485-27www.amershambiosciences.com
inflamable

Referencias

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  3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
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