Artículo de método

El ditranol como una matriz para láser asistida por matriz de desorción / ionización de imágenes en una transformada de Fourier de iones de resonancia de ciclotrón Espectrómetro de Masas

DOI:

10.3791/50733

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26 de noviembre de 2013

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1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

En este artículo

Resumen

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El ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido de pequeñas moléculas; protocolos para el uso de DT para la formación de imágenes de MALDI de los lípidos endógenos en la superficie de secciones de tejido por-ion positivo MALDI-MS en un instrumento cuadrupolar-FTICR ultra alta resolución se proporcionan aquí.

Resumen

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De formación de imágenes Espectrometría de masas (MSI) determina los patrones de localización y la distribución espacial de los compuestos sobre la superficie de una sección de tejido, usando principalmente de MALDI (matriz asistida por láser de desorción / ionización) basado en técnicas analíticas. Se necesitan nuevas matrices de molécula pequeña MSI, que pueden mejorar el análisis de bajo peso molecular (MW) los compuestos. Estas matrices deberán ofrecer mayores señales de analitos mientras que disminuye las señales de fondo MALDI. Además, el uso de instrumentos de ultra-alta resolución, tales como iones de transformada de Fourier de resonancia ciclotrón (FTICR) espectrómetros de masas, tiene la capacidad de resolver señales de analito a partir de señales de la matriz, y esto puede superar parcialmente muchos problemas asociados con el fondo procedente de la MALDI matriz. La reducción de las intensidades de los grupos de matriz metaestables por FTICR MS también puede ayudar a superar algunas de las interferencias de la matriz asociados con picos de otros instrumentos. De alta resolucióninstrumentos tales como los espectrómetros de masas FTICR son ventajosas, ya que pueden producir patrones de distribución de muchos compuestos simultáneamente mientras que todavía proporciona confianza en las identificaciones químicos. Ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) ha sido reportado anteriormente como una matriz MALDI para obtener imágenes de los tejidos. En este trabajo, un protocolo para el uso de DT para MALDI imágenes de lípidos endógenos de las superficies de las secciones de tejidos de mamíferos, por-ion positivo MALDI-MS, en un cuadrupolo híbrido ultra alta resolución ha sido proporcionada instrumento FTICR.

Introducción

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De formación de imágenes Espectrometría de masas (MSI) es una técnica analítica para la determinación de los patrones de localización y la distribución espacial de los compuestos sobre la superficie de una sección de tejido 1,2. Matrix asistida por láser de desorción / ionización (MALDI) MSI para el análisis de péptidos y proteínas se ha utilizado durante más de una década y ha habido grandes mejoras en los métodos de preparación de muestras, la sensibilidad de detección, resolución espacial, la reproducibilidad y procesamiento de datos 3,4. Mediante la combinación de información de las secciones teñidas histológicamente y experimentos MSI, patólogos son capaces de correlacionar las distribuciones de compuestos específicos con características interesantes patofisiológicamente 5.

Los patrones de distribución de pequeñas moléculas, incluyendo fármacos exógenos 6,7 y sus metabolitos 8-10 también han sido interrogados por MALDI-MS de formación de imágenes de tejido 11. Los lípidos son quizás el más estudiado cla-ampliamentess de compuestos con imágenes MALDI, tanto en los MS 12-17 y MS / MS de 18 modos. El uso de MALDI MSI para la imagen pequeña molécula ha sido limitada por varios factores: 1) matrices de MALDI son ellos mismos moléculas pequeñas (típicamente m / z <500), que generan señales de iones abundantes. Estas señales abundantes pueden suprimir la ionización de analitos de moléculas pequeñas e interferir con su 19,20 detección. Recubrimiento libre de disolventes matriz 21, la sublimación de la matriz 22, y la matriz de MALDI MS prerrecubierto 23, entre otros, se han desarrollado para mejorar la MSI de pequeñas moléculas.

Las nuevas matrices que pueden mejorar el análisis de compuestos de bajo MW son de gran interés en la pequeña molécula de MSI. Estas matrices deberán ofrecer mayores señales de analitos con las señales de la matriz disminuido. En el modo de ion positivo, 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) y-4-hidroxicinámico α-ciano ácido (CHCA) son las dos matrices MALDI MS comúnmente utilizados para MSI 24 . La matriz ideal sería formar cristales pequeños, a fin de preservar la localización espacial de los analitos. DHB tiende a formar cristales más grandes, por lo tanto, la aplicación de la matriz usando la sublimación se ha desarrollado para superar parcialmente este problema, y ha permitido el uso de esta matriz para formación de imágenes sensibles de los fosfolípidos de 22,25. 9-amino-acridina se ha usado para MSI de analitos próticos en el modo de ion positivo 26 y para los nucleótidos y fosfolípidos en el modo de 26-29-ion negativo. 2-mercaptobenzotiazol se ha encontrado para dar la detección de MALDI eficiente de lípidos 30, y se ha utilizado para la formación de imágenes de cerebro de ratón gangliósidos 31. La resolución ultra alta de iones de transformada de Fourier de resonancia ciclotrón (FTICR) espectrómetros de masas algo pueden aliviar este problema mediante la resolución de las señales de analito a partir de señales de la matriz 32. Otra ventaja de la utilización de FTICR-MS es que las intensidades de los grupos de matriz son metaestables reduccióned 33, lo que también reduce estas interferencias 27.

El uso de ditranol (DT; 1,8-dihidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) como una matriz de MALDI para obtener imágenes de tejido ha sido previamente reportado 34. En este trabajo actual, se proporciona un protocolo detallado para el uso de DT para el MSI de los lípidos endógenos en las superficies de las secciones de tejido de la lente de la especie bovina, en el modo de ion positivo.

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Protocolo

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1. Seccionar los tejidos

  1. Flash congelar las muestras temáticas, una vez cosechados, con nitrógeno líquido, enviarlos en hielo seco (si se requiere el envío), y almacenar a -80 ° C hasta seccionar los tejidos. (Si se utilizan muestras comerciales, asegúrese de que las muestras se prepararon de esta manera.)
  2. Cortar los órganos a un tamaño manejable para adaptarse a la diana MALDI. Recorte los partes no deseadas del órgano. Para este estudio se describe aquí, las lentes de ternera fueron decapsulated usando un procedimiento descrito previamente-35 antes de seccionar los tejidos.
  3. Retire órganos enteros desde -80 ° C congelador y fijarlos a un escenario de corte de tejido criogénico. Para corregir una lente de ternera, coloque una o dos gotas de agua en la etapa de corte de tejido de un criostato. Coloque rápidamente la lente en el agua antes de que se solidifique. Alternativamente, la temperatura óptima de corte (OCT) compuestos también se pueden usar para fijar un tejido en la etapa de corte. Si se usan compuestos octubre, un miniMal cantidad de la OCT se debe aplicar y se debe tener cuidado para asegurar que las secciones de tejido cortada no estar contaminados con compuestos PTU que pueden interferir con la ionización y la detección de los analitos 5,36,37.
  4. Deje que la temperatura en el interior del criostato se equilibre a -18 ° C. Las temperaturas más frías o más calientes se pueden utilizar para los tejidos más blandos o más duros, respectivamente. A continuación, cortar el tejido ecuatorial en 20 micras rodajas gruesas. Utilice 10-15 micras rodajas gruesas para la mayoría de los tejidos, sin embargo, debido a la naturaleza frágil del tejido del cristalino bovino, se utilizaron 20 micras rodajas gruesas. Para el tejido cristalino bovino, deseche los primeros cortes de tejido y sólo usar sectores que están cerca o en el plano ecuatorial.
  5. Si se forma la imagen de un tejido de la lente ocular, utilizar 1,5 l de ácido fórmico (98% en pureza, CL-EM grado) a prehumedecido la superficie de un óxido de indio y estaño (ITO) recubiertos con portaobjetos de vidrio.
  6. Transferir cuidadosamente las secciones de tejido de la superficie de la ITO-coportaobjetos de vidrio ATED dentro del criostato. La sección de tejido se descongelará rápidamente y se convertirá firmemente fijado a la superficie de deslizamiento. Por lo general, múltiples secciones de tejido se pueden montar en un mismo portaobjetos recubiertos de ITO de esta manera.
  7. Liofilizar la corredera durante 15 min antes de la aplicación de la matriz de MALDI.
  8. Para la prueba de matriz, disolver las matrices individuales en disolventes apropiados. Detectar manualmente 1 l de cada solución de matriz en la sección de tejido. Además, detectar un patrón de calibración de molécula pequeña sobre el tejido para la verificación de la sensibilidad de MALDI.
  9. Añadir tres marcas de enseñanza para el portaobjetos de vidrio recubierto de ITO por la escritura en la superficie no conductora de la placa de vidrio recubierto de ITO con un lápiz corrector-fluido. Tome una imagen óptica de la diapositiva tejido utilizando un escáner de superficie plana y guardarlo en un formato adecuado, como tiff o jpg.

2. Revestimiento de matriz

2.1. Automatizado matriz de revestimiento

  1. Apsoluciones de matriz de capas, que contienen acetonitrilo o acetonitrilo / agua mezclada como disolventes, automáticamente a las superficies de las secciones de tejido utilizando un ImagePrep Bruker o un pulverizador de matriz electrónico similar.
  2. Cubrir los bordes de la superficie frontal de la corredera de vidrio recubierta con ITO con cinta de modo que la matriz no hace recubrir los bordes de la diapositiva. Esto asegura que las marcas de enseñanza sobre la superficie opuesta se pueden utilizar para la alineación de diapositivas tejido. No cubra los bordes de la corredera con la matriz a medida que se utilizan como puntos de contacto para mantener la conductividad eléctrica de la corredera recubierto con ITO.
  3. Cubra el portaobjetos de vidrio utilizando veinte ciclos de revestimiento de matriz (spray de 2 segundos, la incubación de 30 segundos y 60 segundos el tiempo de secado para cada ciclo).

2.2. Revestimiento de matriz Manual

  1. Si disolventes orgánicos (por ejemplo, cloroformo y acetato de etilo) que son incompatibles con los materiales de fabricación de la matriz de pulverizador electrónica necesarias para evirojo, utilice un pulverizador aerógrafo neumáticamente asistida para aplicar la matriz. Añadir la solución de matriz preparados para el depósito de disolvente de la pistola de aerógrafo y aplicar un ligero flujo de gas nitrógeno presurizado para cebar el pulverizador.
  2. Cubrir los bordes de la superficie frontal de los portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO con cinta de modo que la matriz no hace recubrir los bordes de la diapositiva. Esto asegura que las marcas de enseñanza sobre la superficie opuesta se pueden utilizar para la alineación de diapositivas tejido. No cubra los bordes de la corredera con la matriz a medida que se utilizan como puntos de contacto para mantener la conductividad eléctrica de la corredera recubierto con ITO.
  3. Después de que se han observado los aerosoles estables y finos, rocíe manualmente la matriz de manera que haya finalizado la fase cubre la sección de tejido. Aplicar la cantidad mínima de solución de matriz requerido para mojar apenas la superficie durante cada ciclo para evitar la posible deslocalización analito. En general, utilizar aproximadamente 10 ciclos de pulverización de matriz para revestir una sección de tejido; el número de ciclos esdepende del tipo de tejido y la composición de la matriz.

3. MALDI MS

  1. Preparar una solución de calibración de masas por dilución de la solución "ES ajuste Mix" estándar por un factor de 1:200 en 60:40 de isopropanol: agua (que contiene ácido fórmico al 0,1% en la mezcla final).
  2. Introducir 2 l / min de la solución diluida "ES ajuste Mix" en el modo dual de ionización por electrospray (ESI) / fuente de iones MALDI en el espectrómetro de masas FTICR, desde el lado de ESI.
  3. Utilice el instrumento FTICR en el modo ESI-iones positivos, con detección de banda ancha y un tamaño de adquisición de datos de 1.024 kb / s. ESI parámetros típicos son la tensión de electrospray capilar, 3900 V; rociar tensión escudo, 3600 V; de gas nebulizador (2 N) de flujo, 2 L / min; gas seco (N 2) de flujo y la temperatura, 4 L / min y 200 º C; skimmer 1 tensión, 15 V, el tiempo de vuelo (TOF), 0,009 segundos; gas de colisión (Ar) de flujo, 0,4 l / s; fuente de iones tiempo de acumulación, 0,1 seg;y celda de colisión de iones tiempo de acumulación, 0,2 seg. Ajustar los parámetros de operación FTICR con el fin de maximizar la sensibilidad analítica sobre el rango de masas de m / z 200 a 1400, mientras se mantiene buena de dominio de tiempo-libre de la inducción de la caries señales (FID). Por lo general, los parámetros de funcionamiento de ICR son tensión sidekick, 8 V; Sidekick tensión de offset, 8 V; amplificación de excitación de 10; excitación tiempo de impulso, 0,01 hasta 0,015 seg; tensión trampa placa frontal, 1.5 V, trampa de nuevo la tensión de placa, 1,6 V y tensión de entrada del analizador, -4 V. Después de que se ha determinado un conjunto de parámetros de funcionamiento FTICR, adquirir los espectros de masas ESI y calibrar el instrumento usando las masas de referencia de los compuestos estándar en la solución "ES ajuste Mix".
  4. Para afinar el instrumento para el funcionamiento de MALDI, disolver varias alícuotas de 1 l de una mezcla de terfenadina y solución estándar reserpina en la solución de matriz a una concentración de 1 M cada uno, y en el clavo estas soluciones directamente sobre uno de los tissusecciones E (es decir, una sección de tejido de prueba) que ha sido montado en una corredera recubierto con ITO. Colocar el portaobjetos recubierto con ITO en un adaptador de diapositivas de tejido (es decir, una diana de MALDI especial) y cargar el adaptador desde el lado de MALDI en la fuente de iones ESI / MALDI doble. Optimizar los parámetros de funcionamiento de MALDI adecuados para la potencia del láser y el número de disparos de láser para la acumulación de señales MALDI para cada exploración de masas, etc parámetros de operación MALDI típicos son: disparos láser, 50, y una tensión de la placa de MALDI de 300 V.
  5. Después de la sintonización, la calibración, y optimizando el instrumento para experimentos de MALDI-MSI, alinear la ubicación física de una sección de tejido a ser fotografiado con su óptica de la imagen registrada en el software de imágenes. Utilice las tres marcas de "corrección"-de fluido, que se habían puesto previamente en el lado opuesto de la superficie de deslizamiento recubierto con ITO (paso 1.9), para esta alineación utilizando un método de triangulación de tres puntos.
  6. Realice una ESI y MAL simultáneaOperación DI para que cada espectro de masas contiene los picos de masa de referencia de la solución "ES Sintonía Mix" de post-adquisición calibración de masa interna. Esto dará como resultado en la medición de la masa más precisa durante MALDI MS. Para hacer esto, primero atenuar la señal ESI por la disminución de la tensión capilar hasta que las señales de MALDI dominan los espectros mientras que las señales calibrantes ESI son todavía lo suficientemente alta para la calibración de masa interno.
  7. A continuación, configure un método rastering automatizado para la irradiación láser. Definir las regiones de tejido para formar imágenes y establecer el tamaño adecuado paso raster láser. Tenga en cuenta que los tamaños de paso más pequeña trama proporcionan imágenes de tejidos de mayor resolución, sino que requieren un tiempo significativamente mayor masa espectral adquisición y más espacio de almacenamiento de datos. El número de los píxeles de la imagen depende del tamaño de paso de trama láser para configurar y el tamaño del tejido. Para una lente bovina típica que tiene un tamaño de 1 cm 2 de tejido, una imagen de tejido se compone típicamente de CA. 5000 píxeles si un tamaño de paso de trama láser de 200 micras se utiliza en un instrumento FTICR. Utilizar un análisis "in situ al azar", ya que esto evita el sesgo basado en la ubicación debido a la atenuación de la señal progresiva durante el experimento.

4. Análisis de Datos

  1. Calibrar los espectros de masas MALDI usando calibración interna para la comparación inicial y para seleccionar picos de MS / MS. De-isótopo y seleccione los picos monoisotopic como se describió anteriormente, utilizando una secuencia de comandos de VBA personalizado 38.
  2. Exportar el resultado pico listas monoisotopic y introducir los valores de m / z medido en el METLIN 39 y / o las bases de datos HMDB 40 metabolome para la coincidencia de masa con las entradas de biblioteca. Considere la (M + H) +, (M + Na) +, y (M + K) + iones durante las búsquedas de bases de datos, con un error de masa permisible de ± 1 ppm.
  3. Generar imágenes MALDI para todas las entidades de lípidos detectados a través de toda la sección de tejido usando imagsoftware de e-análisis, con una anchura filtro de masa de 1 ppm en el vértice del pico.
  4. Una vez que las imágenes han sido generados para todos los valores de m / z que coinciden con las entradas de la base de datos, generación de imágenes para todos los demás picos y buscar patrones de distribución únicas que pueden ser investigados más tarde.

5. La confirmación de la identidad de los Lípidos Imaged

  1. Confirmar las identidades de los lípidos de alta abundancia, que tienen iones fragmentados característicos que se pueden detectar usando el instrumento FTICR (por ejemplo, 184.073 para fosfolípidos), por MALDI-MS/MS. Realizar MALDI-MS/MS usando disociación inducida por colisión (CID) directamente sobre el tejido.
  2. Para las especies de lípidos que no pueden ser confirmadas directamente por MALDI-MS/MS, utilizar un sistema de UPLC acoplado a un espectrómetro de masas Q-TOF 34.
    1. Diseccionar manualmente alícuotas que contienen ~ 10 mg de tejido de la zona donde se localizan las especies de interés. Coloque estas alícuotas de tejidos en 2tubos de centrífuga ml.
    2. Homogeneizar cada alícuota de tejido en 250 l de agua, utilizando un molino mezclador con dos bolas de metal de acero inoxidable de 5 mm.
    3. Añadir 1 ml de solución de cloroformo-metanol (1:3, v / v), y agitar los tubos. A continuación, centrifugar los tubos utilizando una microcentrífuga a 12.000 xg durante 10 min.
    4. Reunir los sobrenadantes y secarlos en un concentrador de velocidad rotatorio al vacío.
    5. Disolver el residuo en 100 l de isopropanol: agua 30:70. Inyectar una alícuota de 10 l en la columna de la UPLC para la separación usando un gradiente de elución.
    6. Utilice las condiciones cromatográficas para LC-MS/MS lípidos en línea, que han sido previamente publicados 34.
    7. Generar corriente de iones extraídos (XIC) los cromatogramas con los valores teóricos m / z, con una ventana de ± 50 ppm alrededor de las masas teóricas.
    8. Si están disponibles compuestos auténticos para los lípidos, que coincida con los tiempos de retención de los compuestos auténticos con los de la correspondiente picos XIC de las muestras de tejido. Si los compuestos son los mismos, los tiempos de retención y los espectros de MS / MS deben coincidir.
  3. Si un compuesto auténtico no está disponible, utilice el patrón de fragmentación de los lípidos detectado para que coincida con un espectro estándar de MS / MS de una base de datos metabolome como METLIN o HMDB. Utilice la interpretación de espectros de masas de novo para determinar una posible estructura de los lípidos.

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Resultados

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Las muestras de tejido que se seccionan y se montaron deshielo en los portaobjetos de vidrio recubiertos de ITO deben estar intactos, sin rotura visible. Para muchos tejidos, montaje sobre un portaobjetos de vidrio recubierto de ITO deshielo tisular directa es aceptable. Para algunos tejidos específicos, tales como lente bovina, extensa desgarro del tejido se ve a menudo cuando se usa un montaje deshielo directa (Figura 1a). Prerrecubrimiento del portaobjetos de vidrio de ITO con etanol o ácido fórmico ...

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Discusión

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Las consideraciones más importantes para el éxito de MALDI MSI son: 1) la preparación del tejido, 2) la elección de la matriz, y 3) la aplicación de la matriz, y 4) la interpretación de datos y análisis. Cuando la muestra y la matriz se preparan adecuadamente, la adquisición de datos de MS está automatizado. El análisis de los datos de este tipo de experimento es bastante mano de obra intensiva.

La preparación del tejido adecuado es crucial para el éxito de los experimentos de MALDI MSI. La ...

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Divulgaciones

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No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer Genoma Canadá y Genoma de Columbia Británica para la financiación de plataforma y apoyo. También agradecemos a la Dra. Carol E. Parker para la revisión crítica de la asistencia manuscrito y edición. CHL también agradece a la Columbia Británica Proteómica red de apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hígado de RataPel-Freez Biologicals56023-2
Lente de ternero bovinoPel-Freez Biologicals57114-2La muestra debe ser desencapsulada29 antes de usar
Dithranol (DT)Sigma-Aldrich10608MALDI Matrix
α-Ácido ciano-4-hidroxi-cinámico (CHCA)Sigma-Aldrich70990MALDI Matrix
Ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB)Sigma-Aldrich85707MALDI Matriz
ReserpinaSigma-Aldrich83580
TerfenadinaSigma-AldrichT9652
Ácido fórmicoSigma-Aldrich14265
Formiato de amonioSigma-Aldrich14266
Hidróxido de amonioSigma-Aldrich
Ácido trifluoroacético (TFA)Sigma-Aldrich302031
aguaSigma-Aldrich39253
MetanolSigma-Aldrich34860
AcetonitriloSigma-Aldrich34967
Acetato de etiloSigma-Aldrich34972
IsopropanolSigma-Aldrich34965
CloroformoSigma-Aldrich366927
AcetonaSigma-Aldrich34850
Etanol Alcoholes95%
ES Tuning MixAgilent TechnologiesG2431A
ITO Portaobjetos de vidrio recubierto HudsonSurface TechnologyPSI1207000Asegúrese de que las muestras se coloquen en el lado conductor de la electricidad
Bolígrafo corrector Wite-Out Shake-N-SqueezeBicWOSQP11
Pulverizador de aerógrafoIwataEclipse HP-CS
ImagePrepBruker249500-LS
Adaptador MALDIBruker235380
320145 comerciales

Referencias

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