Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical

Resumen

Realización de ensayos de cultivo celular para investigar la adhesión bacteriana y la invasión en condiciones aerobias es generalmente representativo de la In vivo Medio ambiente. Un modelo de cámara de difusión vertical permite el estudio de las interacciones del patógeno humano Campylobacter jejuni Con las células epiteliales del intestino más bajo In vivo Condiciones similares, lo que resulta en una mayor invasión bacteriana.

Resumen

Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. Hemos desarrollado un modelo in vitro de la infección en que permite que el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas. La cámara de difusión vertical (VCC) modelo imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias estarán en condiciones de muy baja, mientras que los tejidos de oxígeno serán suministrados con el oxígeno del torrente sanguíneo. La colocación de monocapas de células epiteliales intestinales polarizadas (IEC) obtenidas en los prospectos Snapwell en una VDC crea compartimentos apical y basolateral separados. El compartimento basolateral se llena con medio de cultivo celular, sellado y perfundidos con oxígeno wHilst el compartimiento apical está lleno de caldo, mantienen abiertas y se incubaron bajo condiciones microaeróbicas. Tanto Caco-2 y T84 IECs se pueden mantener en el VDC bajo estas condiciones, sin efectos perjudiciales aparentes sobre la supervivencia celular o integridad de la monocapa. Experimentos de cocultivo a cabo con diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje y diferentes líneas de IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical reproducible resultan en un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación a las condiciones de cultivo aerobio ^1. El ambiente creado en el modelo VDC imita más de cerca el ambiente encontrado por C. jejuni en el intestino humano y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que imitan más estrechamente la realidad in vivo en el. Proponemos que el uso del modelo VDC permitirá nuevas interpretaciones de las interacciones apuestaween patógenos bacterianos y células huésped.

Introducción

Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. El uso de estos ensayos de cultivo celular, la adhesión bacteriana a las células huésped, la identificación de los receptores de la célula huésped, célula huésped vías de señalización y la invasión bacteriana de células huésped todas han sido estudiados en detalle, lo que resulta en muchas observaciones importantes. Sin embargo, tales ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas que pueden no ser representativos de la ambiente in vivo. Una limitación importante de los ....

Protocolo

1. El crecimiento de monocapas IEC en especial 0.4 Filtros micras

1. Cultura Caco-2 células en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero de ternero fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales en una tejido estándar de cultivo en estufa a 37 ° C en 5% de _CO2 y 95% de aire. Seed 4 x 10 ⁵ células Caco-2 IECs por 0,4 micras filtran y crecen a la polarización durante 21 días, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días.
2. Mida la TEER para confirmar el estado de polarización de la monocapa utilizando un medidor de resistenci....

Resultados

Experimentos de cocultivo realizaron con un C. jejuni cepa de tipo salvaje y los IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical han demostrado un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación con las condiciones de cultivo aerobias en un momento que dependen de forma ^1. Esta observación fue reproducible usando dos diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje (11168H y 81-176) y dos líneas de e.......

Discusión

El uso de métodos de cultivo de células in vitro para estudiar las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped es una técnica ampliamente utilizada en muchos laboratorios de investigación. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. El ampliamente utilizado en modelos de infec.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de difusión vertical especializado para usar con insertos Snapwell	Aparato Harvard	66-0001	Colector y seis cámaras Snapwell
Tapas Aparato	Harvard	66-0020
Juntas tóricas	Aparato Harvard	66-0007
Abrazaderas	Aparato Harvard	66-0012
Filtros Snapwell (tamaño de poro 0,4 μ m)	Corning Costar	3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm medidor de resistencia	Millipore	MERS00002
WPA Lightwave II espectrofotómetro	Biochrom	80-3003-72