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Un protocolo rápido para la integración de matrices extracromosómicas con alta tasa de transmisión en el genoma de C. elegans

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DOI:

10.3791/50773

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9 de diciembre de 2013

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1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento rápido y de bajo consumo de material para la integración de matrices extracromosómicas transgénicas en el genoma de Caenorhabditis elegans utilizando irradiación ultravioleta (UV). Además, este protocolo es particularmente adecuado para líneas transgénicas que transmiten matrices extracromosómicas a una alta velocidad.

Resumen

La microinyección de ADN en el citoplasma de la gónada sincitial de Caenorhabditis elegans es la principal técnica utilizada para establecer líneas transgénicas que exhiben tasas de transmisión parcial y variable de matrices extracromosómicas a la siguiente generación. Además, los animales transgénicos son mosaico y expresan el transgén en un número variable de células. Las matrices extracromosómicas pueden integrarse en el genoma de C. elegans utilizando irradiación UV para establecer cepas transgénicas no mosaicas con una tasa de transmisión del 100% del transgén. En ese sentido, las progenies F1 de animales transgénicos irradiados con radiación UV se examinan para detectar animales portadores de una integración heterocigota del transgén, lo que conduce a una tasa de transmisión mendeliana del 75% a la progenie F2. Uno de los retos de este método es distinguir entre el porcentaje de transmisión de transgenes en una población antes (X% de animales transgénicos) y después de la integración (≥75% de animales transgénicos F2). Por lo tanto, este método requiere elegir una línea transgénica no integrada con un porcentaje de animales transgénicos que sea significativamente menor que la segregación mendeliana del 75%. En consecuencia, las líneas transgénicas no integradas con una tasa de transmisión de matrices extracromosómicas a la siguiente generación ≤60% suelen ser preferidas para la integración, y la integración de transgenes en cepas altamente transmisoras es difícil. Aquí mostramos que la eficiencia de la integración de las matrices extracromosómicas en el genoma se incrementa cuando se utilizan líneas transgénicas altamente transmisoras (≥80%). El protocolo descrito permite una fácil selección de varias líneas independientes con integración de transgenes homocigotos en el genoma después de la irradiación UV de gusanos transgénicos que exhiben una alta tasa de transmisión de matrices extracromosómicas. Además, este método es bastante rápido y consume poco material. La posibilidad de generar rápidamente diferentes líneas que expresen un transgén integrado particular es de gran interés para los estudios centrados en el patrón y la regulación de la expresión génica, la localización y la sobreexpresión de proteínas, así como para el desarrollo de marcadores subcelulares.

Introducción

Los transgenes se utilizan ampliamente en C. elegans para una amplia gama de aplicaciones. Las cepas transgénicas se generan típicamente por inyección de ADN en la gónada hermafrodita sincitial1,2. El ADN portador del transgén de interés se coinyecta junto con plásmidos que codifican marcadores de coinyección1,3,4. Los marcadores de coinyección son transgenes establecidos que conducen a la expresión de una proteína fluorescente o a un fenotipo conductual o morfológico específico. Los ADN inyectados se reorganizan para formar matrices extracromosómicas de múltiples copias; Así, el transgén de interés y el marcador de coinyección se transmiten juntos5,4. Las líneas transgénicas se seleccionan en la generación F2 de animales inyectados siguiendo el fenotipo inducido por la expresión del marcador de coinyección (fluorescencia o fenotipo específico)1. Las líneas transgénicas presentan tasas de transmisión parcial y variable de las matrices extracromosómicas a la siguiente generación. Dependiendo de la cepa, entre el 10 y el 100% (el 100% es un evento raro) de los animales heredan matrices extracromosómicas. Además, los animales transgénicos son mosaico y expresan el transgén en un número variable de células. Es probable que este mosaicismo esté correlacionado con la tasa de transmisión a la siguiente generación. De hecho, tanto en la línea germinal como en las células somáticas, la tasa de transmisión depende de la segregación de las matrices extracromosómicas durante las divisiones celulares. Una forma de evitar este problema es integrar el transgén en el genoma. Clásicamente, la integración de un transgén en un cromosoma se basa en la irradiación (ultravioleta o gamma) de gusanos transgénicos portadores de matrices extracromosómicas3. Brevemente, 50-100 animales hermafroditas son irradiados en la etapa larvaria L4. En la generación F1 se seleccionan entre 200 y 800 animales transgénicos y se cultivan individualmente en placas. De acuerdo con la segregación mendeliana, los animales transgénicos F1 portadores de una integración heterocigota del transgén en el genoma producirían 1/2 de los descendientes transgénicos que son heterocigotos para la matriz integrada, 1/4 de los descendientes transgénicos son homocigotos para la matriz integrada, y 1/4 de los descendientes que no han integrado la matriz (Figura 1). Por lo tanto, las placas que contienen la generación F2 se examinan visualmente para detectar un ≥75% de animales transgénicos, según se observa por la expresión del marcador de coinyección. Se supone que alrededor de 1/3 de los animales F2 seleccionados para ser candidatos integrantes son homocigotos para la matriz integrada y que producen el 100% de los animales F3 homocigotos. Por lo tanto, de cada placa seleccionada, se cultivan individualmente de tres a ocho animales transgénicos F2 y se seleccionan placas con 100% de descendientes transgénicos. A continuación, se cultivan individualmente ocho animales F3 para confirmar la herencia del 100% del transgén.

Las principales desventajas de este método son que

  1. requiere una pantalla visual de varios cientos de placas F1 para ≥el 7875% de la progenie F2 transgénica, lo que requiere mucho tiempo debido al porcentaje variable e impredecible de transmisión de matrices extracromosómicas no integradas. Alternativamente, para evitar el cribado de las placas F1, se pueden realizar varios pasos posteriores de inanición después de la irradiación de los animales P0; A continuación, se seleccionaron 100 animales transgénicos y se realizó un cribado de 100% de progenie transgénica3.
  2. No está adaptado para cepas que exhiben un porcentaje de transmisión de matrices extracromosómicas superior al 60%, ya que este porcentaje es difícil de distinguir entre el 75%.
  3. dado que sólo se pueden utilizar cepas con una tasa de transmisión relativamente baja, es necesario un gran número de animales transgénicos P0 irradiados, así como la observación de numerosos animales F1 y F2, que requiere mucho tiempo y un número considerable de placas.

La irradiación de los gusanos presumiblemente induce roturas de doble cadena en el ADN y la integración de matrices extracromosómicas en los cromosomas ocurre durante la reparación del ADN. Por lo tanto, es probable que las posibilidades de obtener una integración exitosa mediada por la irradiación sean directamente proporcionales al número de células de la línea germinal que portan una matriz extracromosómica. Las cepas con una alta tasa de transmisión pueden contener más matrices de ADN transgénico que las cepas con una tasa de transmisión baja, como se sugiere en2, y exhibir un mayor número de células de línea germinal que portan matrices extracromosómicas. Por lo tanto, razonamos que en líneas altamente transmisoras, los transgenes podrían ser más fáciles de integrar que en líneas con una tasa de transmisión baja. Sin embargo, el protocolo estándar excluye la posibilidad de integrar transgenes con alta frecuencia de transmisión, ya que el porcentaje de animales transgénicos con una matriz extracromosómica no integrada apenas puede distinguirse del de la progenie de un animal F1 portador de una integración heterocigota del transgén en el genoma (Figura 1).

Aquí mostramos que para un transgén en particular, el número de líneas integradas recuperadas después de la irradiación con luz ultravioleta (UV) depende del porcentaje inicial de transmisión de la matriz no integrada. Presentamos un protocolo mejorado para la integración de transgenes mediada por irradiación UV que es particularmente relevante para las líneas que exhiben una alta tasa de transmisión de matrices de transgenes.

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Protocolo

1. Cultivo de nematodos transgénicos antes de la integración

Las líneas transgénicas se pueden generar como se describe en1. Estas líneas suelen contener un plásmido marcador de coinyección que conduce a la expresión de una proteína fluorescente o a un fenotipo conductual o morfológico específico en una determinada etapa de desarrollo1,3. Este protocolo de integración se puede aplicar a cepas que expresan marcadores de coinyección fluorescentes o no fluorescentes. En el siguiente ejemplo, se utilizó una cepa con un marcador fluorescente de coinyección.

  1. Preparar placas de cultivo:
    1. Prepare alrededor de 500 placas de Petri grandes de 60 mm vertidas asépticamente con 10 ml cada una de Medio de Crecimiento de Nematodos (NGM)6,7.
    2. Siembre cada placa con 0,3 ml de cultivo saturado de Escherichia coli OP50 siguiendo el procedimiento estándar6,7.
  2. Evaluar la tasa de transmisión de la línea transgénica a integrar:
    1. Para cada línea transgénica, se escojan diez adultos grávidos fluorescentes en diez placas de cultivo separadas bajo un estereoscopio fluorescente utilizando un palillo de gusano como se describe enla figura 7.
    2. Cultive los animales en una incubadora de lombrices a 15-25 °C (dependiendo de los antecedentes genéticos) para permitir que las lombrices se reproduzcan.
    3. Observar la progenie cada día para evaluar en qué etapa de desarrollo se expresa el marcador de coinyección y se puede observar mejor. La expresión de la mayoría de los marcadores de coinyección utilizados actualmente se observa en la etapa larvaria L4 o en la edad adulta.
    4. Evaluar la tasa de transmisión de la progenie determinando el porcentaje de progenie fluorescente mediante observación bajo un estereoscopio fluorescente.
  3. Elija una línea transgénica para la integración de transgenes:
    1. Seleccione la línea transgénica con la tasa de transmisión más alta posible (idealmente ≥80%).
  4. Obtener una población de animales transgénicos sincronizados en la etapa larvaria L4 para su integración:
    1. Elija 30 adultos grávidos fluorescentes en cinco placas de cultivo (seis animales por placa).
    2. Deje que los gusanos pongan huevos durante 3-4 horas a 15 °C.
    3. Elimine a los adultos de los platos después de verificar la presencia de al menos 30 huevos por plato.
    4. Cultive los animales en una incubadora de lombrices a 15-25 °C hasta que la progenie alcance la etapa larvaria L4 (96 horas a 15 °C o 36 horas a 25 °C).

2. Irradiación UV y recuperación de gusanos transgénicos

  1. Irradiación de gusanos:
    1. Escoja de 30 a 100 animales L4 transgénicos fluorescentes en placas de cultivo separadas (15 a 20 animales por placa).
    2. Coloque las placas, sin las tapas, en un reticulante UV. Irradiar los gusanos a 0,012 J/cm2. Tenga en cuenta que las cepas son más o menos sensibles a los rayos UV y que los resultados pueden variar según el irradiador UV utilizado. Se puede probar un rango de dosis entre 0,010-0,015 J/cm2.
  2. Recuperación de lombrices después de la irradiación:
    1. Coloque las placas con gusanos irradiados durante la noche a 15 °C para su recuperación.
    2. Comprueba el número de animales que están vivos. En nuestras manos, una tasa de supervivencia de alrededor del 80-90% está adaptada para una irradiación eficiente.
    3. Cultivar los animales irradiados a 15-25 °C hasta que la progenie haya alcanzado la etapa de desarrollo que permita observar la expresión del marcador de coinyección, según lo establecido en el paso 1.2.

3. Aislamiento de líneas transgénicas integradas

  1. Selección de animales F1:
    1. Un solo animal F1 fluorescente de 150 a 200 en placas de cultivo separadas. Para líneas de alta transmisión (≥80%), 100 animales F1 son suficientes.
    2. Mantenga estas placas F1 a 15-25 °C hasta que la progenie alcance una etapa apropiada para la observación de animales F2 fluorescentes.
    3. Deseche todas las placas F1 que presenten i) ninguna progenie, lo que indica que el animal F1 era estéril o murió, o ii) ningún animal F2 fluorescente, o solo unos pocos, lo que indica que el animal F1 no transmitió el transgén a la velocidad esperada. Este paso es rápido y representa una ventaja real cuando se compara con el protocolo estándar que requiere una estimación del porcentaje de gusanos F2 fluorescentes para seleccionar placas F1 que exhiben ≥75% de progenie fluorescente (Tabla 1).
  2. Selección de animales F2:
    1. Cuatro animales transgénicos F2 fluorescentes de cada placa F1 seleccionada. Cuando se utilizan transgenes fluorescentes (por ejemplo, mCherry8, gfp9 o dsRed10), se eligen gusanos F2 con un alto nivel de fluorescencia, ya que esto podría indicar que estos animales son homocigotos para la matriz integrada. Tenga en cuenta que al elegir animales F2 es fundamental no llevar huevos o larvas, para evitar falsos negativos en el siguiente paso.
    2. Cultive animales F2 a 15-25 °C.
  3. Aislamiento y validación de cepas transgénicas integradas:
    1. Cribado de placas F2 para gusanos F3 transgénicos 100% fluorescentes. La pantalla es bastante rápida, ya que la presencia de un solo gusano no fluorescente indica que la placa debe desecharse. Un animal homocigoto F2 para el transgén integrado dará una progenie fluorescente 100% homocigótica.
    2. Ocho animales F3 fluorescentes de placas seleccionadas para confirmar el 100% de la herencia del transgén. En teoría, elegir un animal es suficiente en este paso. Sin embargo, puede ser necesario elegir ocho animales F3 fluorescentes para evitar seleccionar animales no fértiles o enfermos, ya que la irradiación puede inducir mutaciones aleatorias que afectan a genes importantes para la fisiología de los gusanos.
    3. Si es posible, mantener varias cepas transgénicas integradas independientes, es decir, cepas recuperadas de diferentes animales F1.

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Resultados

Se realizaron integraciones de transgenes en dos líneas diferentes que transmiten matrices extracromosómicas aproximadamente con la misma frecuencia (50-60%) utilizando los protocolos estándar y mejorado (Tabla 1). El protocolo estándar permitió obtener tres líneas integradas independientes tras la irradiación con UV de 91 animales transgénicos en estadio L4, mientras que el protocolo mejorado permitió obtener una línea integrada tras la irradiación con UV de 30 animales transgénicos en estadio L4. Esto ...

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Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un método eficiente para integrar matrices transgénicas extracromosómicas en el genoma de C. elegans. Utilizando diferentes líneas no integradas, que transmitieron el mismo transgén Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) a diferentes velocidades (10-15%, 50-60% y >80%), mostramos que el número de cepas integradas recuperadas después de la irradiación UV depende del nivel inicial de transmisión de la línea no integrada (Tabla 2). Por lo tanto, los transgenes s...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero contrapuesto.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Claire Lecroisey y Laurent Ségalat por generar Pdyc-1::d yc-1::gfp no integrado; Cepas transgénicas Pmyo-2::d sRed y Pmyo-3::gfp. Agradecemos a Andy Fire por el regalo del plásmido Pmyo-2::d sRed y a Pamela Hoppe por el regalo del plásmido Pmyo-3::gfp. Este trabajo fue fundado por el Centro Nacional de Investigación Científica de Francia (CNRS) y la Universidad Claude Bernard de Lyon.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarProlabo20768.292para la preparación de NGM (medio de crecimiento de nematodos) (6,7)
NaClChimie-Plus40045para la preparación de NGM
Bacto-peptonaBD211820para la preparación de NGM
KH2PO4Roth3904-1para la preparación de NGM
K2HPO4Prolabo26930.293para la preparación
NGM MgSO4RothP027.2para la preparación de NGM
CaCl2Prolabo22317.297para la preparación de NGM
ColesterolRectapurpara la preparación de NGM
Caldo LBSigmaL3022para el cultivo de OP50 bacterias
EQUIPO
Reticulante UVFischer ScientificLongitud de onda 254 nm
Microscopio SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
Placas de Petri, 60 mmCMLBPS55E6
Alambre de platino 0,25 mmAlfa Aesar7440-06-4Para hacer una púa para lombrices (7)
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Referencias

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

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