Demostramos un ensayo de PCR multiplex simple para el cribado y tipaje rápidos de los tipos I-V del cromosoma de casete estafilocócico (SCCmec) para el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, y proporcionamos algunos de los pasos vitales y matices de procedimiento que lo hacen exitoso para adaptar este ensayo a laboratorios individuales.
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Artículo de método
Multiplex PCR Ensayo para la tipificaci
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Resumen
Introducción
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) ha adquirido e integrado en su genoma un elemento gen
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Protocolo
Estos procedimientos deben llevarse a cabo en un laboratorio de nivel de bioseguridad certificada 2. Equipo de protecci
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Resultados
Este M-PCR actualizado es capaz de determinar (clasificar) los tipos I-V de SCCmec, así como los principales subtipos de SCCmec IV. El ensayo tiene como dianas loci únicos y específicos de SCCmec I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd, IVE y V, con detección simultánea del gen mecA. También es posible una identificación tentativa de SCCmec VI y VIII, aunque se requeriría una prueba adicional para confirmarla. Figura 3 ilustra representaciones típicas de SCCmec
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Discusión
El ensayo de PCR multiplex descrito aquí proporciona un método simple y confiable para clasificar los tipos y subtipos principales de SCCmec I-V en estafilococos, con discriminación simultánea de MRSA de MSSA. El ensayo es robusto, se realiza convenientemente en una sola reacción de PCR y los resultados son fáciles de interpretar. El ensayo tiene limitaciones en el sentido de que se dirige a loci individuales dentro de cada tipo deSCC mec , pero no ofrece una tipificación completa de ccr y ...
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a T. Ito, K. Hiramatsu, R. Daum, H. de Lencastre y D. Coleman por el amable regalo de algunas cepas de referencia utilizadas en este estudio. Este trabajo fue financiado en parte por el Centro para la Resistencia a los Antimicrobianos (CAR), los Servicios de Salud de Alberta-Calgary/Servicios de Laboratorio de Calgary/Universidad de Calgary.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar tríptico de soja | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| Agua destilada estéril | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq: incluye tampón de PCR 10x y 50 mM de MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Ácido bórico | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| Agarosa | Life Technologies | 16500-500 | |
| Glycerol | Life Technologies | 15514-011 | |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ Escalera de ADN Vida | Tecnologías | 10787-026 | |
| Bromuro de etidio | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1,5 ml Tubos de microcentrífuga | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| Varillas de cultivo | VWR | CA10805-018 | |
| Tubos de PCR | Diamed | AD0210-FCN (nuevo #: DIATEC420-1250) | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5417c | |
| Bloque calefactor | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| Termociclador | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| Cámara de electroforesis de gel sumergible horizontal con molde de gel | BioRad | 170-4469 | |
| Fuente de alimentación | BioRad | 164-5050 | |
| Agitador basculante | VWR | 40000-300 | |
| Molecular Generador de imágenes Gel Doc System | BioRad | 1708170 |
Referencias
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
- Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
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- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
