Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

Resumen

Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

Resumen

Los biomarcadores son cada vez más importante en la toma de decisiones clínicas, así como la ciencia básica. Diagnóstico de infarto de miocardio (MI) es impulsado en gran medida mediante la detección de proteínas cardiacos específicos en el suero o plasma de los pacientes como un indicador de daño miocárdico. Después de haber demostrado recientemente que la miosina cardiaca proteína de unión-C (cMyBP-C) es detectable en el suero después de MI, se ha propuesto como un biomarcador potencial de MI. Los biomarcadores se detectan generalmente mediante ensayos inmunoenzimáticos sándwich tradicionales. Sin embargo, esta técnica requiere un gran volumen de muestra, tiene un pequeño rango dinámico, y puede medir sólo una proteína a la vez.

A continuación os mostramos un inmunoensayo múltiplex en el que tres proteínas cardíacas se pueden medir simultáneamente con una alta sensibilidad. Medición cMyBP-C en uniplex o junto con creatina quinasa MB y troponina I cardiaca mostró una sensibilidad comparable. Esta técnica utiliza la Meso Escala Descubrimiento(MSD) método de multiplexación en una placa de 96 pocillos junto con electroquimioluminiscencia para la detección. Aunque sólo se necesitan pequeños volúmenes de muestra, se logran una alta sensibilidad y un amplio rango dinámico. Usando esta técnica, que mide cMyBP-C, MB de creatina quinasa y troponina I cardiaca en muestras de suero de 16 pacientes con MI y se compararon los resultados con 16 sujetos control. Hemos sido capaces de detectar los tres marcadores en estas muestras y encontramos los tres biomarcadores que aumentaron después de un IM. Esta técnica es, por lo tanto, adecuado para la detección sensible de los biomarcadores cardíacos en muestras de suero.

Introducción

La medición de bajas cantidades de proteína en muestras biológicas complejas, tales como el suero, es de creciente importancia clínica para el tratamiento del paciente, así como la ciencia básica. Por ejemplo, un aumento en los niveles séricos de biomarcadores cardíacos, tales como la troponina I, en un entorno clínico es compatible con infarto agudo de miocardio (MI) ^1. Para detectar las proteínas en muestras de suero, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima estándar (ELISA) es la técnica utilizada con mayor frecuencia, ya que tiene una alta sensibilidad y permite la cuantificación absoluta del analito. Sin embargo, las pruebas ELISA tradicionales requi....

Protocolo

1. Uniplex cMyBP-C Ensayo

1. El día antes del experimento, cubra la placa estándar de 96 pocillos desnuda MSD con el anticuerpo de captura. Para cMyBP-C, utilizar un volumen de 30 l de anticuerpo anti-ratón cMyBP-C monoclonal (gelatina libre) a una concentración de 5 g / ml diluido en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2. Dado que el pozo es hidrófobo, pipetear la solución en la esquina inferior del pozo; luego toque los lados de la placa para extender la solución sobre todo el bien.
3. La placa se cubre con un sellador de placas y se incubaron O / N a 4 ° C sin agitación.
4. Eliminar la solución de anticuerpo de captura pulsand....

Resultados

Los principios básicos y de flujo de trabajo de ensayo de la 3-plex se muestran en la Figura 1, el flujo de trabajo y en general se describe en la Tabla 1. Ensayos de Uniplex trabajan a lo largo del mismo principio, excepto que toda la parte inferior así se recubre con un anticuerpo de captura. Detección de la señal se realiza mediante ECL en que se aplica una señal eléctrica a la parte inferior del pozo. Esto, a su vez, inicia una producción local de la luz a través de una reacción quí.......

Discusión

En este estudio, mostramos la aplicabilidad de un inmunoensayo múltiplex para la detección de múltiples biomarcadores cardíacos en el suero de los pacientes. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre ELISA tradicional. En primer lugar, ECL en el kit de ensayo se utiliza en lugar de la detección colorimétrica. En ECL, una señal eléctrica estimula la producción local de la propiedad medida (la luz), desacoplando así el caso de la estimulación de la señal, lo que reduce el fondo ^14. Esto permite una alta sensi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) con surfactante	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
Bloqueador de MSD A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
Solución salina tamponada con fosfato, 10X	Fisher BioReagents	BP399-4	Filtrar antes de usar
Anticuerpo de proteína C de unión a miosina, monoclonal de ratón (E7), sin gelatina	Santa Cruz	SC-137180L	Para el recubrimiento, el anticuerpo debe estar libre
Placas y equipos
Multi-Array Placa estándar de 96 pocillos	Meso Scale Discovery	L15XA-3
Un prototipo de placa de 3 plex, cuatro puntos y 96 pocillos con cMyBP-C, cTnI y CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
Película de sellado ThermaSeal	Productos de Ciencias de la Vida Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
Agitador de microtitulación digital MTS 2/4	IKA	3208001