El cultivo y mantenimiento<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En un ambiente anaeróbico

Resumen

Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.

Resumen

Clostridium difficile es un anaerobio, bacteria Gram-positiva, esporogénica que es el principal responsable de la diarrea asociada a antibióticos (DAA) y es un patógeno nosocomial significativo. C. difficile es notoriamente difícil de aislar y cultivar y es extremadamente sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Aquí, métodos para aislar C. difficile a partir de muestras fecales y, posteriormente, el cultivo de C. difficile para la preparación de los stocks de glicerol para el almacenamiento a largo plazo se presentan. También se describen técnicas para la preparación y la enumeración de las existencias de esporas en el laboratorio para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo estudios de microscopía y animales. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que mantiene un ambiente anaeróbico coherente para garantizar condiciones adecuadas para óptima C. crecimiento difficile. Proporcionamos protocolos para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara sin Cautilizando una contaminación significativa de oxígeno, junto con sugerencias para el mantenimiento regular necesario para mantener el medio ambiente anaeróbico apropiado para una eficiente y consistente C. cultivo difficile.

Introducción

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas Gram-positivo que es un anaerobio obligado y un patógeno gastrointestinal potencialmente fatal de los seres humanos y animales. Inicialmente descrito en 1935 como un organismo comensal encuentra en las muestras de heces de los recién nacidos ^1, C. difficile más tarde se demostró que era el agente causante de la colitis pseudomembranosa asociada con el tratamiento antibiótico ^2. C. infecciones difficile (CDI) son típicamente precedidas de un tratamiento con antibióticos que resulta en la alteración de la flora normal del colon, creando un nicho para

Protocolo

Nota: C. difficile es un patógeno humano y animal que puede causar enfermedad gastrointestinal. Los experimentos con C. difficile debe realizarse con las precauciones de bioseguridad apropiadas (BSL-2).

1. Cámara anaeróbica de uso y mantenimiento

C. difficile es un anaerobio estricto y es extremadamente sensibles incluso a concentraciones bajas de oxígeno en la atmósfera. Por lo tanto, se necesita un ambiente anaeróbico controlada para su manipulación con éxito. El uso de una cámara anaeróbica (Figura 1A) proporciona el entorno más estable y las condiciones ideales par....

Resultados

Un ejemplo de C. difficile crecido en BHIS y Columbia anaeróbica ovejas medios de agar sangre puede ser visto en la Figura 2. C. difficile forma colonias irregulares que son planas y poseen una apariencia de vidrio esmerilado que es evidente en ambos medios. Aquí, un aislado clínico-eritromicina sensible de C. difficile, 630E ^30, se cultiva en BHIS de agar, un medio enriquecido, no selectivo, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). Las colonias sobre.......

Discusión

Los métodos descritos aquí permiten una recuperación rápida y sencilla de C. difficile a partir de una variedad de muestras fecales, incluyendo seres humanos, ratones y hámsteres, así como el almacenamiento a largo plazo de C. difficile como stocks de glicerol o de esporas. C. difficile puede ser un organismo difícil de cultivar, pero cuidado mantenimiento de un ambiente anaerobio y la aplicación de técnicas asépticas puede proporcionar para un crecimiento vigoroso y una reducción en la contam.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Proteose Peptona n.º 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhidro)	Fisher	M65
a'...-Fructosa	Fisher	L96
Taurocolato de sodio	Sigma	T4009
á'...-cicloserina	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Medio de infusión cerebro-corazón	BD	237300
Proteose Peptona	BD 211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cisteína	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Agar sangre de oveja colombiana	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glicerol	Fisher	BP2291
Asas de inoculación estériles	Fisher	22363596
Hisopos estériles	Cámara
Coy y accesorios	Coy Laboratory Products, Inc	Especificado por el cliente	Estos artículos se ordenan a medida según las necesidades
Materials
TCCFA agar Proteose peptona n.º 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhidro) 0,1 g Fructosa 6 g Agar 20 g Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 & grados; C durante 20 min para esterilizar. Después del autoclave, agregar: 10 ml de taurocolato de sodio al 10% (p/v), esterilizado por filtro (disolver en agua; concentración final, 0,1%) 25 ml de 10 mg/ml á'...-cicloserina, esterilizada por filtro (disolver en agua; concentración final, 250 μ g/ml) 1,6 ml de 10 mg/ml de cefoxitina, esterilizada con filtro (disolver en agua; concentración final, 16 μ g/ml) BHIS Medium Infusión cerebro-corazón 37 g Extracto de levadura 5 g Para los platos, agregue 15 g de agar. Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 ° C durante 20 minutos para esterilizar. Opcional (agregar después del autoclave): 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.03%) 10 ml de taurocolato de sodio al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.1%) SMC Medio de esporulación BactoPeptone 90 g Proteasa peptona 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1,5 g Agar 15 g Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 & grados; C durante 20 min para esterilizar. Opcional (agregar después del autoclave): 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (disolver en agua; concentración final, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Peptona proteasa 3,5 g Infusión cerebro-corazón 11,1 g Extracto de levadura 1,5 g (NH4)2SO4 0,7 g Tris base 1,06 g Para los platos, agregue 15 g de agar. Llevar a 1 L con agua desionizada y autoclave a 121 ° C durante 20 min para esterilizar. Después de esterilizar en autoclave, agregue 3 ml de L-cisteína al 10% (p/v) (concentración final, 0.03%). Blood agar Se recomienda el uso de placas de agar de sangre de oveja anaeróbica Columbia prefabricadas (Fisher Scientific, L21928)35. 1X Solución salina tamponada con fosfato (PBS) NaCl 8,01 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,27 g Lleve a 1 L con agua desionizada y ajuste el pH a 7.4 con HCl. Filtro Esterilizar antes de usar.

anaeróbica de vinilo Coy 1495990 del laboratorio