Se presentan métodos para estudiar el efecto de las MEP y otras toxinas secretadas por Staphylococcus aureus En los neutrófilos usando citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
El estudio de las interacciones de
En este artículo
Resumen
Resumen
Se presentan métodos para estudiar el efecto de modulinas solubles en fenol (PSM) y otras toxinas producidas y secretadas por Staphylococcus aureus en los neutrófilos. Para estudiar los efectos de los PSM en los neutrófilos que aislamos neutrófilos frescos utilizando centrifugación en gradiente de densidad. Estos neutrófilos se cargan con un medio de contraste que emite fluorescencia en la movilización del calcio. La activación de los neutrófilos por las MEP inicia un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre intracelular. En un experimento de citometría de flujo de esta rápida movilización se puede medir mediante el control de la fluorescencia de un colorante pre-cargado que reacciona con el aumento de la concentración de Ca2 + libre. Con este método se puede determinar la concentración PSM necesario activar los neutrófilos, y medir los efectos de los inhibidores específicos y generales de la activación de los neutrófilos.
Para investigar la expresión de los PSM en el espacio intracelular, we han construido fusiones reportero del promotor del operón PSMα a GFP. Cuando estos reportero cepas de S. aureus son fagocitadas por los neutrófilos, la inducción de la expresión se puede observar mediante microscopía de fluorescencia.
Introducción
Los neutrófilos (PMNs) son fagocitos profesionales que juegan un papel clave en la respuesta inmune innata contra Staphylococcus aureus 1. La batalla constante entre el huésped y microbio ha llevado a una carrera de armamentos de ambos. Recientemente, cepas relacionadas con la comunidad (CA) de la meticilina resistente S. aureus (MRSA) se han comprobado que parece ser muy eficiente en la elusión de los neutrófilos muerte 2,3. Modulina (MEP) soluble en fenol producción excesiva de CA-MRSA se ha asociado con una mayor virulencia 4,5. Los neutrófilos humanos pueden reconocer estos MEP a través de FPR2 que conducen a la ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Aislamiento de PMN de sangre humana mediante centrifugación de densidad
- Dibuja 5 9 tubos ml de sangre venosa heparinizada.
- Preparar de doble capa de gradientes de Ficoll (4 gradientes para 5 tubos de sangre) de la siguiente manera: Verter 12 ml de una densidad de 1,119 g / ml de solución de Ficoll en un tubo de 50 ml y cuidadosamente capa de 10 ml de una densidad de 1,077 g / ml de solución de Ficoll en la parte superior.
- Diluir la sangre con un volumen igual de PBS.
- Capa de la sangre diluida con cuidado en el gradiente de Ficoll de doble capa; 20-25 ml por gradiente.
- Centrifugar 20 minutos a 396 xg en un rotor de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Ensayo de citometría de flujo para la evaluación de la movilización de calcio en los PMN humanos
La incubación de los neutrófilos con una serie de concentración de PSMα3 sintéticos resultantes en la activación rápida tal como se mide por el flujo de calcio, que se muestra por un aumento en la señal en FL-1. Pre-incubación de PSMα3 sintético con 0,01%, 0,1% o 1% de suero humano inhibió significativamente la capacidad para obtener los flujos de calcio (Figura 1).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En los métodos descritos aquí algunos pasos son muy críticos. Vamos a destacar estas aquí.
Para el aislamiento de neutrófilos por centrifugación en gradiente de densidad es importante no perturbar las capas durante o después de las etapas de centrifugación. Al aspirar los neutrófilos utilizando una pipeta de plástico, asegúrese de no apretar el globo, mientras que en la capa de células, como inyectar líquido perturbará las capas. Además, inspeccione visualmente el sedimento de neutrófilos de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
RN fue parcialmente financiado por una Marie Curie Becas Re-integración europeas (ERG) del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea, el número de proyecto 268324.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fluo-3, AM | Sondas moleculares / Life Technologies | F-1241 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | densidad 1.077 g/ml |
| Histopaque | Sigma | 11191 | densidad 1.119 g/ml |
| RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contiene 25 mM HEPES y L-glutamina |
| Leica TCS SP5 Microscopio Leica TCS SP5 | Leica Microsistemas, Países Bajos | TCS SP5 | objetivo: HCX PL APO 40x/0.85 |
| FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Muy importante que el tubo pueda ser retirado y reemplazado durante el proceso de medición |
Referencias
- Rigby, K. M., DeLeo, F. R. Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections. Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).
- Voyich, J. M., et al. Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus au....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
