Describimos cómo realizar imágenes de resonancia magnética y PET del corazón del ratón. El protocolo está diseñado para evaluar la eficacia del tratamiento en modelos de infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Resonancia magnética y PET en modelos de ratón de infarto de miocardio
En este artículo
Resumen
Resumen
El infarto de miocardio es una de las principales causas de muerte en el mundo occidental. La similitud del corazón del ratón con el corazón humano lo ha convertido en un modelo ideal para probar nuevas estrategias terapéuticas.
La resonancia magnética (RM) in vivo proporciona excelentes vistas del corazón de forma no invasiva con detalles anatómicos claros, que pueden utilizarse para una evaluación funcional precisa. Los agentes de contraste pueden proporcionar medidas básicas de la viabilidad de los tejidos, pero no son específicos. La tomografía por emisión de positrones (PET) es una técnica complementaria muy específica para la obtención de imágenes moleculares, pero que carece de los detalles anatómicos de la resonancia magnética. Utilizadas en conjunto, estas técnicas ofrecen una herramienta sensible, específica y cuantitativa para la evaluación del corazón en la enfermedad y la recuperación después del tratamiento.
En este artículo explicamos cómo se llevan a cabo estos métodos en modelos murinos de infarto agudo de miocardio. Los procedimientos aquí descritos fueron diseñados para la evaluación de supuestos tratamientos farmacológicos protectores. Utilizamos la resonancia magnética para medir la función sistólica y el tamaño del infarto con realce tardío de gadolinio, y la PET con fluorodesoxiglucosa (FDG) para evaluar la función metabólica en la región infartada. El artículo se centra en aspectos prácticos como la planificación de cortes, la compuerta precisa, la administración de fármacos, la segmentación de imágenes y el corregistro multimodal. Los métodos presentados aquí logran una buena repetibilidad y precisión, manteniendo un alto rendimiento.
Introducción
Para medir la eficacia de las nuevas estrategias de tratamiento para el infarto de miocardio (IM) en estudios preclínicos, se requiere la evaluación de la etapa aguda, así como el resultado a largo plazo1. Métodos como la histopatología, los catéteres intracardíacos2 y los modelos cardíacos ex vivo 3 se utilizan habitualmente para estudios preclínicos en ratones. Sin embargo, es imposible realizar un seguimiento del tratamiento con métodos ex vivo o altamente invasivos. Las técnicas de medición no invasivas, como la resonancia magnética (RM) in vivo y la tomografía por emisión de positrones (PET), permiten diseños experimentales longitudinales para la estadificación de la enfermedad en sujetos individuales. La cine-resonancia magnética se utiliza para derivar parámetros funcionales globales como la masa ventricular izquierda (LVM), la fracción de eyección (FE) y el gasto cardíaco (CO). Además, después de la inyección de un agente de contraste de gadolinio, debido a la alteración de la perfusión y el lavado en el infarto, la viabilidad del tejido se puede evaluar con una resonancia magnética tardía con realce de gadolinio (LGE). Complementariamente, la PET ofrece una medida sensible de moléculas radiomarcadas para evaluar el metabolismo de los tejidos. La alta precisión de estas técnicas permite reducciones significativas en el número de animales necesarios para probar nuevos fármacos dirigidos al infarto de miocardio.
Los procedimientos de PET y RM están involucrados, y sin un protocolo cuidadosamente diseñado, la reproducibilidad es difícil de mantener. Los procedimientos establecidos en la clínica para los pacientes requieren modificaciones sustanciales para su uso en ratones, debido a su frecuencia cardíaca considerablemente más rápida y a las dimensiones más pequeñas del corazón4. Existe una amplia variación entre los sujetos individuales, tanto al inicio como en respuesta a la lesión inducida, por lo que se necesita un número considerable de ratones para establecer la eficacia del tratamiento.
En este informe, describimos nuestro método para la obtención secuencial de imágenes PET/MRI del corazón del ratón. Ambas modalidades utilizan agentes de contraste intravenosos, que se administran a través de la vena de la cola. La RM consiste en una evaluación estándar con Cine-MRI5 con un protocolo óptimo para la LGE como se describe en nuestro trabajo anterior6. Todo el procedimiento de resonancia magnética dura 30 minutos. Hemos obtenido accesorios consistentes para las camas de nuestros instrumentos, por lo que es posible transferir al animal a una plataforma con el mismo aparato de monitoreo y administración de anestésico entre las máquinas. La PET tiene una duración de 45 min con inyección in situ una vez iniciada la exploración. El paso final es medir los parámetros de las imágenes de resonancia magnética y PET después del corregistro.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los componentes de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido, 1986, y con la aprobación del Panel de Revisión Ética de la Universidad de Cambridge.
1. Preparación de los animales
- Inducir infartos con una intervención quirúrgica7,8. Para la medición en la etapa aguda, realice imágenes 24 horas después de la intervención.
- Prepare un tubo de jeringa delgado para la administración del medicamento con una aguja de 25 g en un extremo y una jeringa con una aguja de 25 g en el otro extremo. La longitud de la línea debe ser suficiente para permitir la inyección desde el exterior del orificio del imán (aproximadamente 1,5 m).
- Preparar una solución diluyendo Gadovist en solución salina. Cargue una jeringa con la cantidad correcta de solución para lograr 3 mmol/kg ajustados para el peso corporal del ratón. Mantenga el volumen de inyección entre 50-100 μl.
- Rellene previamente la línea con la solución de Gadovist. Para evitar la coagulación de la sangre, llene el extremo de la vía cerca de la cánula con solución salina de heparina.
- Coloque el ratón en la caja de inducción para anestesia con isoflurano al 3% en Ø2 1 L/min durante 3-5 min según sea necesario. La profundidad correcta de la anestesia se puede identificar con la disminución de la frecuencia respiratoria, que debe disminuir a menos de 70 lpm.
- Cánula la vena de la cola usando la vía previamente preparada, use cinta quirúrgica para mantener la aguja en su lugar durante el procedimiento.
2. Posicionamiento y Monitoreo de Animales
- Coloque el ratón en la cama de resonancia magnética, administrando isoflurano al 1-2% en 1 L/min O2 para el mantenimiento de la anestesia según sea necesario. Mantenga la frecuencia respiratoria entre 20 y 70 lpm.
- Asegúrese de que el centro de la bobina de resonancia magnética esté ubicado sobre la posición del corazón del ratón.
- Controle la respiración colocando un sensor de almohada respiratoria ligeramente por debajo del diafragma. Use un termómetro rectal con un cubreobjetos prelubricado para controlar la temperatura central. Asegúrese de que la temperatura se mantenga constante durante las exploraciones a 37±2 °C.
- Para la monitorización del ECG, coloque tres electrodos en las patas anteriores y en la pata trasera izquierda, asegurándose de que la palma del dedo del pie esté completamente abierta. Elija el par de electrodos que logre la mejor calidad de señal para derivar el ECG. Retuerza los cables de ECG para asegurarse de que no formen circuitos resonantes a la frecuencia de resonancia magnética, lo que corrompería gravemente la señal de ECG al ejecutar secuencias de pulsos.
- Asegúrese de que los electrodos estén firmemente sujetos a la cama con cinta adhesiva. Los electrodos y el cono de la nariz mantendrán al animal en su lugar durante todo el procedimiento.
- Coloque una manta calentada con agua sobre el mouse, encapsulando los cables de monitoreo y bobina para mantener la temperatura corporal.
- Alinee el láser de la cama con la posición del corazón; use la línea anterior de los dedos como punto de referencia. Colóquelo en el isocentro magnético mediante una cama automática.
- Ejecute los ajustes estándar para el sistema de resonancia magnética.
- Configure el equipo de monitoreo para detectar la onda R en el ECG. Ajuste los umbrales para cada ratón y dentro de las sesiones de imagen para que haya una activación fiable.
3. Resonancia magnética
- Adquiera una imagen piloto para planificar las imágenes piloto multiplanares.
- Identifique el corazón en la imagen, más fácilmente por sus artefactos de flujo. Si las imágenes muestran que el ratón no está bien centrado en la bobina o en el isocentro, retraiga la cama y repita la posición.
- Adquiera una imagen de eco de gradiente rápido (GE) con cinco cortes por orientación y un campo de visión (FOV) de 3 cm con la compuerta de ECG activada.
- Ejecute una exploración 3D no codificada centrada en el corazón para el corregistro de la PET (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de la exploración). Mientras se ejecuta este examen, planifique los exámenes sucesivos.
- Planifique una exploración de vista de cuatro cámaras (4 canales) (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de exploración). Esto debe cortar a través del ápice y las válvulas tricúspide y mitral, mostrando las 4 cámaras.
- Planifique una vista de dos cámaras (2 canales) (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de exploración). Debe cortar a través del ápice y la válvula tricúspide, mostrando la aurícula y el ventrículo izquierdos.
- Comprobación cruzada de la geometría de las dos vistas de eje largo. Si la planificación de cortes no es óptima, repita el escaneo.
- Planifique una pila de cortes de eje corto (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de exploración) ortogonales a la vista de 4 canales y a la vista de 2 canales. Cubra todo el corazón, comenzando desde la primera rebanada apical sin acumulación de sangre hasta la primera rebanada basal sin ningún VD. Las rodajas deben estar igualmente espaciadas sin espacios.
4. Mejora tardía del gadolinio
- Aumente el tiempo en blanco para que la compuerta adquiera cada dos latidos del corazón (TR = 550-750 mseg). Se debe aplicar un retraso tal que la adquisición se realice en la fase diastólica final del ECG.
- Realice una versión de baja resolución de la secuencia LGE (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de exploración) antes de la inyección para verificar que la compuerta sea correcta y que no haya artefactos de flujo presentes. Si hay artefactos de flujo en la fase diastólica, aumentar ligeramente el retraso (es decir, imágenes en la etapa muy temprana de la sístole) los eliminará.
- Realice la inyección de la solución de Gadovist de forma lenta y constante durante 15 segundos.
- Inicie la obtención de imágenes de LGE (consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de exploración) después de la inyección. Se logra un buen contraste cuando se obtienen imágenes dentro de los primeros 15 minutos.
5. Imágenes PET
- Transfiera la cama de resonancia magnética al escáner PET dejando el receptor en su lugar y fíjelo firmemente al soporte de la cama PET. Conecte el equipo de anestesia y monitoreo.
- Coloque el corazón en el centro del campo de visión de la PET, moviendo la cama solo axialmente.
- Adquiera un escaneo de transmisión de un solo paso con una fuente de germanio.
- Extraiga 10-30 Mbq de FDG marcado radiactivamente de su recipiente con una jeringa. Tenga el cuidado necesario con el material radiactivo. Mida la actividad con un contador de pozos. Un buen volumen de inyección para ratones oscila entre 50-100 μl, si el volumen es demasiado pequeño, diluya la solución con solución salina.
- Inicie la exploración de emisiones, configurada para adquirir PET con compuerta en modo de lista durante 45 min. Al mismo tiempo, inyecte el marcador de manera lenta y constante durante 15 segundos. Enjuague la línea con suficiente solución salina para administrar todo el trazador radiactivo.
- Para la salud animal, no debe exceder los 300 μl con las tres inyecciones (es decir, Gadovist, FDG, flush).
- Vuelva a colocar la jeringa en el contador de pocillos para medir la actividad residual.
- Siga las reglas locales en todo momento para el manejo de material radiactivo.
6. Segmentación por resonancia magnética
- Cargue las imágenes de Cine-MRI en el segmento v1.9 9.
- Ejecute las herramientas automáticas para la segmentación. Comenzando desde un punto dentro del ventrículo, estos inflarán las paredes del ventrículo estimadas hasta que se encuentre la mejor coincidencia.
- Delinear manualmente el VI y el VD al final de la sístole (ES) y al final de la diástole (ED), definidos respectivamente como los cuadros con el volumen global máximo y con el volumen mínimo global del VI. Excluya los músculos papilares y las trabeculaciones en todo el cuerpo. No ajuste el contraste de la imagen, ya que la inconsistencia en el contraste conduce a una interpretación diferente de los efectos de volumen parcial.
- Delinee manualmente el epicardio en ES y ED para los cálculos de masa del VI, como se muestra en la Figura 6. El músculo cardíaco es incompresible, por lo que la masa del VI debe ser consistente en CE y DE. Si la diferencia es superior al 5%, es probable que se produzca un error del operador, y estos deben revisarse.
- En la base de los ventrículos, use una línea recta para diferenciar los ventrículos de las aurículas como se muestra en la Figura 6, identificando el ángulo del corte con la ayuda de las vistas de eje largo.
- Verifique la segmentación en las vistas de eje largo.
- Delinee el área de la cicatriz en las imágenes de LGE. Divida el volumen de la cicatriz por la masa del VI derivada en la imagen de cine para obtener el infarto como porcentaje del VI.
7. Análisis PET y coregistro con resonancia magnética
- Reconstruya las imágenes PET utilizando un algoritmo de retroproyección filtrado en 3D y exporte los datos a formato Nifti (http://nifti.nimh.nih.gov/) mostrando valores de absorción estándar.
- Transforme todas las imágenes PET utilizando la matriz de transformación fija entre el PET y el sistema de resonancia magnética. Si no se conoce la matriz, llene un maniquí geométrico con material radiactivo y realice una resonancia magnética, luego mueva la cama a la PET y realice una exploración de emisión. La matriz obtenida para transformar la PET en la imagen de resonancia magnética es la matriz estándar para pasar de la PET al sistema de resonancia magnética.
- Registre la imagen PET promedio en la resonancia magnética 3D utilizando la herramienta de corregistro masivo SPM-mouse10.
- Apila los cortes de Cine-MRI para obtener una reconstrucción en 3D, interpola para obtener una resolución isotrópica de 0,3 mm. Registre el volumen de PET diastólica final en el volumen de RMN diastólica final utilizando herramientas de corregistro SPM-Mouse. Use la misma matriz para todas las demás fases del corazón.
- Para evaluar el tamaño del infarto PET, elija el 50% de la intensidad máxima en el corazón para discriminar entre vóxeles infartados y no infartados. Expresa vóxeles infartados como porcentaje del VI.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Una de las ventajas de utilizar la resonancia magnética es que puede emplearse un diseño longitudinal para determinar las etapas de la enfermedad. Esto es especialmente importante al evaluar compuestos novedosos, ya que puede no conocerse el curso temporal del efecto. Las variaciones en los volúmenes cardíacos debidas a la progresión de la enfermedad en el mismo animal se muestran en la Figura 4. La figura muestra claramente los efectos del remodelado tras el infarto de miocardio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La PET/MRI es un método de medición integral para la evaluación longitudinal y no invasiva de la función sistólica, la viabilidad tisular y los marcadores metabólicos específicos en modelos de ratón de infarto de miocardio. Aquí hemos descrito un protocolo para realizar resonancia magnética y PET secuencialmente, donde el corregistro se simplifica mediante la transferencia de la misma cama entre sistemas. Esta estrategia, también adoptada por los fabricantes de sistemas clínicos11, no requiere un escáner combi...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos por la financiación de la Fundación Británica del Corazón a TK y al Consejo de Investigación Médica del Reino Unido para una beca de investigación de posgrado en GB.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Gadovist | Bayer Schering Pharma | PL 00010/0535 | |
| FDG | IBA Molecular | ||
| Equipment Bruker | |||
| BioSpec 47/40 | Bruker | ||
| Cama de ratón Bruker | Bruker | Esta cama incluye tubos para la administración de anestesia y la barrido. | |
| Transmisor de jaula para pájaros de 12 cm de diámetro | Bruker | T5346 | |
| Receptor de bobina de superficie de 2 cm de diámetro | Bruker | T7027 | |
| Red Dot Electrodos de monitorización neonatal | 3M | P/N: 2330 | |
| Equipos de monitorización | SA Systems | El kit de monitorización incluye almohada respiratoria y sonda rectal para la medición de la temperatura. | |
| Equipo de anestesia | Servicios | ||
| Caja de inducción | Vet Tech Solutions LTD | ||
| Cambridge Escáner PET/MRI de imanes divididos | Universidad de Cambridge | Se utilizó un escáner PET/MRI 22 hecho a medida para realizar la PET, su rendimiento PET similar al de un escáner de micropet F12023 | |
| Segment software | Medviso, Lund University | Disponible gratuitamente | |
| SPM-mouse | University of Cambridge | Disponible gratuitamente |
Referencias
- Borst, O., et al. Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice. Cell. Physiol. Biochem. 28, 1-12 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and. 3, 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflügers Arch. 437, 979-985 (1999).
- Epstein, F. H. MR in mouse models of cardiac disease. NMR Biomed. 20, 238-255 (2007).
- Schneider, J. E., Wiesmann, F., Lygate, C. A., Neubauer, S. How to perform an accurate assessment of cardiac function in mice using high-resolution magnetic resonance imaging. J. Cardiov. Magn. Reson. 8, 693-701 (2006).
- Buonincontri, G., Methner, C., Krieg, T., Carpenter, T. A., Sawiak, S. J. A fast protocol for infarct quantification in mice. J. Magn. Reson. Imaging. , (2013).
- Methner, C., Schmidt, K., Cohen, M. V., Downey, J. M., Krieg, T. Both A2a and A2b adenosine receptors at reperfusion are necessary to reduce infarct size in mouse hearts. Am. J. Physiol. 299, 1262-1264 (2010).
- Methner, C., et al. Protection through postconditioning or a mitochondria-targeted S-nitrosothiol is unaffected by cardiomyocyte-selective ablation of protein kinase. , in press (2013).
- Heiberg, E., et al. Design and validation of Segment--freely available software for cardiovascular image analysis. BMC Med. Imaging. 10, 1 (2010).
- Sawiak, S. J., Wood, N. I., Williams, G. B., Morton, A. J., Carpenter, T. A. Voxel-based morphometry in the R6/2 transgenic mouse reveals differences between genotypes not seen with manual 2D morphometry. Neurobiol. Dis. 33, 20-27 (2009).
- Zaidi, H., et al. Design and performance evaluation of a whole-body Ingenuity TF PET-MRI system. Phys. Med. Biol. 56, 3091-3106 (2011).
- Thomas, D., et al. T1-weighted cine FLASH is superior to IR imaging of post-infarction myocardial viability at 4.7T. J. Cardiov. Magn. Reson. 8, 345-352 (2006).
- Protti, A., Sirker, A., Shah, A. M., Botnar, R. Late gadolinium enhancement of acute myocardial infarction in mice at 7T: cine-FLASH versus inversion recovery. J. Magn. Reson. Imaging. 32, 878-886 (2010).
- Bohl, S., et al. Advanced methods for quantification of infarct size in mice using three-dimensional high-field late gadolinium enhancement MRI. Am. J. Physiol. 296, 1200-1208 (2009).
- Chapon, C., Herlihy, A. H., Bhakoo, K. K. Assessment of myocardial infarction in mice by late gadolinium enhancement MR imaging using an inversion recovery pulse sequence at 9.4T. J. Cardiov. Magn. Reson. 10, 6 (2008).
- Price, A. N., et al. Cardiovascular magnetic resonance imaging in experimental models. The open cardiov medicine journal. 4, 278-292 (2010).
- Hiba, B., Richard, N., Thibault, H., Janier, M. Cardiac and respiratory self-gated cine MRI in the mouse: comparison between radial and rectilinear techniques at 7T. Magn. Reson. Med. 58, 745-753 (2007).
- Buonincontri, G., et al. PET/MRI in the infarcted mouse heart with the Cambridge split magnet. Nucl. Instrum. Methods Phys. Res. A. , (2012).
- Büscher, K., et al. Isochronous assessment of cardiac metabolism and function in mice using hybrid PET/MRI. J. Nucl. Med. 51, 1277-1284 (2010).
- Berr, S. S., et al. Images in cardiovascular medicine. Serial multimodality assessment of myocardial infarction in mice using magnetic resonance imaging and micro-positron emission tomography provides complementary information on the progression of scar formation. Circulation. 115, 428-429 (2007).
- Lee, W. W., et al. PET/MRI of inflammation in myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 153-163 (2012).
- Lucas, A. J., et al. Development of a combined microPET-MR system. Technol. Cancer Res. Treat. 5, 337-341 (2006).
- Hawkes, R. C., Fryer, T. D., Siegel, S., Ansorge, R. E., Carpenter, T. A. Preliminary evaluation of a combined microPET-MR system. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 53-60 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
