Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis

Resumen

En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.

Resumen

En este artículo se describen las herramientas, las técnicas y los instrumentos adecuados para las mediciones cuantitativas de contenido elemental intracelular mediante la técnica conocida como microanálisis de sonda de electrones (EPMA). Calcio intramitocondrial es un enfoque particular debido al papel crítico que la sobrecarga de calcio mitocondrial desempeña en las enfermedades neurodegenerativas. El método se basa en el análisis de los rayos X generados en un microscopio electrónico (EM) por la interacción de un haz de electrones con la muestra. Con el fin de mantener la distribución natural de los elementos difusibles en especímenes de microscopía de electrones, EPMA requiere "criofijación" de tejido seguido de la preparación de secciones criogénicas ultrafinas. La congelación rápida de las células cultivadas o cultivos de cortes organotípicos se lleva a cabo por inmersión de congelación en etano líquido o por la congelación de golpe contra un bloque de metal en frío, respectivamente. Criosecciones nominalmente 80 nm de espesor se cortan en seco con un cuchillo de diamante en ca. -16076; C, montada en / rejillas de cobre Pioloform recubierto de carbono y cryotransferred en una crio-EM utilizando un soporte cryospecimen especializada. Después de la inspección visual y la cartografía de la ubicación a ≤ -160 ° C y la dosis de electrones de baja, cryosections congelados hidratado son liofilizada a -100 º C durante aproximadamente 30 min. Imágenes de nivel de Orgánulos de criosecciones secos se registran, también a baja dosis, por medio de una cámara CCD de barrido lento y regiones subcelulares de interés seleccionado para el análisis. Los rayos X emitidos desde ROI por un centrado, sonda de electrones estacionaria, de alta intensidad son recogidos por una placa de rayos X de dispersión de energía (EDX) espectrómetro, procesada por la electrónica asociada, y presentada como un espectro de rayos X, es decir, una gráfico de la intensidad de rayos X de energía vs. Software adicional facilita: 1) la identificación de los componentes elementales de sus "características" energías pico y huellas dactilares, y 2) el análisis cuantitativo mediante la extracción de las áreas de pico / fondo. Este documento concluye con dos ejemplos que ilustran típicaAplicaciones EPMA, una en la que el análisis de calcio mitocondrial proporcionado una visión crítica de los mecanismos de lesión excitotóxica y otro que revelaron la base de la resistencia a la isquemia.

Introducción

Los iones de calcio son, posiblemente, la entidad de señalización celular más importante y versátil en biología, que juega un papel esencial en los procesos normales tan diversos como la transmisión sináptica y la expresión génica. Por otro lado, el calcio es igualmente importante en la muerte celular. En particular, la desregulación del calcio es un factor clave en el daño neuronal en el ictus, Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas ^3,5. Por lo tanto, es críticamente importante entender cuantitativamente cómo se distribuye de calcio dentro de las células, y cómo esto cambia después de estímulos fisiológicos o fisiopatológicos. Este o....

Protocolo

El método descrito aquí se ha desarrollado utilizando instrumentos específicos, herramientas y software. Debido a que los laboratorios no va a utilizar la misma configuración experimental del enfoque es generalizado en lo posible.

1. Congelación Rápida

El método analítico que se describe es absolutamente dependiente de enfoques criogénicos para: 1) el "criofijación" de las células o tejidos de una manera que preserva cuantitativamente la distribución de los componentes del tejido difusibles y elementos químicos como lo fueron en células vivas en el instante de la congelación , y 2) la preparación de ultrafina cr....

Resultados

Las células del cerebro típicamente sufrir una lesión excitotóxica como resultado de la liberación de neurotransmisores patológico que se produce en condiciones isquémicas. EPMA fue fundamental para descubrir cómo la capacidad de las mitocondrias neuronales para secuestrar grandes cantidades de calcio subyace al mecanismo de la lesión. La micrografía de electrones en la Figura 3 ilustra la apariencia de las mitocondrias en criosecciones liofilizados de las neuronas del hipocampo en cultivo congelados rá.......

Discusión

El método analítico basado en microscopio electrónico de que aquí se presenta permite la detección, identificación, y cuantificación de varios elementos de interés biológico, incluidos Na, K, P, Ca y especialmente. Estos análisis pueden llevarse a cabo en subcelular, es decir, dentro de la orgánulo, la resolución debido a la capacidad de localizar e identificar estructuras de interés en imágenes de alta calidad de criosecciones preparados a partir de muestras congeladas rápidamente. Tenga en cuenta que no se re.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
REACTIVOS/MATERIALES
cubreobjetos de plástico Thermanox	Thermo Fischer Scientific	72280
Insertos de cultivo	BD Falcon	353090	Para placas de 6 pocillos
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Aplicadores de madera ranurada
	EM Sciences	72300
Rejillas EM plegables	Ted Pella	4GC100/100	malla 100
Lámina de indio	Alfa Aesar	13982	0,25 mm de grosor
EQUIPMENT
Dispositivo de congelación por inmersión	Leica Microsystems	KF-80
Dispositivo de congelación Slam	LifeCell	CF-100
Ultramicrótomo	Leica Microsystems	UC6
Accesorio criogénico para micrótomo	Leica Microsystems	FC6
Herramienta de recorte	Diatome	Cryotrim 45
Cuchillo criogénico de diamante	Diatome	Cryo 35
Dispositivo antiestático	Diatome	Hauf Static Line
Microscopio electrónico	Carl Zeiss Microscopía	EM912 Omega
Soporte de muestras criogénicas EM	Gatan	CT3500
Cámara CCD de escaneo lento, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
Software de adquisición de imágenes	Olympus SIS	iTEM suite
ED detector de rayos X		Instruments Linksystem Pentafet
Procesador de pulsos	Instruments	XP-3
PCI tarjeta	4pi Systems	Spectral Engine II
Ordenador de sobremesa	Apple	Cualquier modelo
Software de análisis de rayos X	NIST	DTSA, DTSA II
Software de hoja de cálculo	Microsoft	Excel
El CF100 ya no se vende comercialmente, aunque la máquina está disponible en muchas instalaciones académicas, y Las máquinas completas o las piezas se pueden encontrar en línea. Un video tutorial para el soporte de criotransferencia CT3500 está disponible en http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. El SEII está obsoleto; el motor espectral universal es un producto posterior compatible con PC con una funcionalidad comparable. 4PI ha dejado de fabricar y vender, pero sigue proporcionando soporte técnico al cliente. Los sistemas usados a menudo se encuentran en línea. El DTSA original ahora está obsoleto. El NIST ofrece en el dominio público un sucesor actualizado, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

criogénico de diamante Oxford Oxford compatible con OS9