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Artículo de método

Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

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DOI:

10.3791/50816

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31 de diciembre de 2013

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1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

En este artículo

Resumen

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Resumen

TRPV4 (Transient Receptor Potenciales familia vanilloid, tipo 4) es ampliamente expresado en tejidos de vertebrados y se activa por varios estímulos, incluyendo por fuerzas mecánicas. Ciertas mutaciones causan TRPV4 ósea hereditaria compleja o patologías neuronales en humanos. De tipo salvaje o mutante TRPV4 los transgenes se expresan comúnmente en células de mamífero cultivadas y se examinaron por Fura-2 fluorometría y por los electrodos. En cuanto al mecanismo de mechanosensitivity y las bases moleculares de las enfermedades, la literatura actual es confuso y controvertido. Para complementar métodos existentes, se describen dos métodos adicionales para examinar las propiedades moleculares de TRPV4. (1) Rata TRPV4 y un transgén aecuorina se transforman en levadura en ciernes. Un choque hipo osmtic de la población transformante produce una señal luminométrica debido a la combinación de aecuorina con Ca 2 +, lanzado a través del canal TRPV4. Aquí TRPV4 está aislado de sus proteínas asociadas mamíferos habitualesy revela su propio mechanosensitivity. (2) ARNc de TRPV4 se inyectó en oocitos de Xenopus. Después de un período de incubación adecuado, la corriente TRPV4 macroscópica se examinó con una pinza de voltaje de dos electrodos. El aumento de la intensidad después de la retirada de osmoticum inerte del baño de los ovocitos es indicativa de mechanosensitivity. Los microamperios (10 -6 a 10 -4 C) Las corrientes de ovocitos son mucho más grandes que las subnano a nanoamperio (10 -10 a 10 -9 C) Las corrientes de células cultivadas, produciendo cuantificaciones más claras y las evaluaciones de más confianza. Corrientes microscópicas que reflejan las actividades de proteínas de los canales individuales también pueden ser directamente registrados bajo una grapa de parche, en el de las células o el modo extirpado. Lo mismo oocito ofrece varias muestras de parches, lo que permite la replicación de mejores datos. Succiones aplicadas a los parches pueden activar TRPV4 evaluar directamente mechanosensitivity. Estos métodos también deben ser útiles en el estudio de otros tipos de canales TRP.

Introducción

TRP (potencial de receptor transitorio) comprenden siete subfamilias de canales de cationes que sirven funciones sensoriales 1,2. En los mamíferos, TRPV, la subfamilia vanilloid de TRP, tiene seis variedades. TRPV4 (tipo 4) 3,4 responde al calor, ciertos productos químicos, hinchazón osmótica, o esfuerzo de corte. El gen TRPV4 se aisló repetidamente por el candidato-gen y / o clonación de expresión 5-8. El último método siguió la respuesta del producto génico a la hipo-osmolaridad. TRPV4 se expresa en casi todos los órganos y funciones en el desarrollo, fisiología, o patología de muchos tipos de células dispares 3,4.

Llama la atención son las mutaciones TRPV4 autosómicos dominantes humana> 50, provocando neuropatías periféricas y / o displasias esqueléticas (anormalidades en el desarrollo del esqueleto) 9-11. Oscilan Las displasias esqueléticas de leves tipo brachyomia 3 (tipo-3 enanismo), displasia espondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasias, algunas causando la muerte neonatal o embrionario. Aunque parecen posibles toda clase de mecanismos, ninguno explica la diversidad, la complejidad, variabilidad y superposiciones ocasionales de estas enfermedades 4.

Al igual que otros canales TRP 1, TRPV4 es un tetrámero. En rata o TRPV4 humana, cada subunidad está constituida por 871 residuos. Su elemento central es el de seis hélices transmembrana (S1-S6), lo que probablemente se disponen de una manera similar a canales de K + dependientes de voltaje. Hay, S1 a S4 formar un dominio periférica y la S5 y S6 forman el dominio de poro de permeación. Entre S5 y S6 de TRPV4 es una hélice de poro corto seguido por la secuencia de LDLFKLTIGMGDL, cuatro de los cuales presumiblemente convergen para formar el filtro de cationes. El segmento citoplasmático N-terminal de 470 residuos contiene 6 repeticiones de anquirina, conocidos por unirse a proteínas o ligandos pequeños. El segmento citoplásmico 152-residuo C-terminal incluye una secuencia de unión a calmodulina-entre otros sitios posibles que se unen OTsus elementos 3.

TRPV4 es un canal catiónico que excluye esencialmente aniones 1. Aunque su función fisiológica es para transducir estímulos a Ca 2 + afluencia, que también es permeable a otros cationes con una secuencia de permeabilidad Eisenman IV, favoreciendo divalente a un Ca P: P Na ~ 7 12. Conductancia de un canal rectifica a ~ 90 pS hacia afuera y hacia adentro ~ 40 pS 6,13,14. Heteróloga expresada actual (abajo) se puede activar por hipo-osmótica hinchazón, tensión de corte o calor 15. También es activado por los ácidos grasos poliinsaturados 16,17 y el éster de forbol sintética 4αPDD 18. En la actualidad, el agonista más potente es GSK1016790A 19 y antagonista es GSK2193874, eficaz en 10 -9 a 10 -8 M 20, ambas descubiertas por el alto rendimiento, la pequeña pantalla-molecular.

Dos áreas clave de la investigación TRPV4 permanecen confusos: (1) A pesar de que TRPV4 es estudiado en gran medida por su mechanosensitivity, su base molecular es controversial. Un modelo describe hipo-osmolaridad de alguna manera activa la fosfolipasa A2 (PLA2) para producir el ácido graso poliinsaturado (PUFA) de ácido araquidónico (AA), que se convierte en ácido epoxieicosatrienoicos (EET) por una epoxigenasa, y la unión de EET activa TRPV4 16, 17. Sin embargo, sí TRPV4 se ha demostrado que responden directamente a estiramiento de la membrana 14 (a continuación), que proporciona una explicación más simple. (2) Las patologías mutantes TRPV4 son desconcertantes. En la base, es necesario saber si las enfermedades se deben a la pérdida, la reducción o el aumento de las actividades de canal. Incluso en este caso, la literatura está lejos de ser clara. Aunque se reportaron múltiples alelos esquelético-displasia tener actividades más altas, (ganancia de función, GOF) 4,21, varios se informó que han reducido las actividades (pérdida de la función, LOF) 10,22. Un estudio sistemático de 14 alelos que los ha encontradotodas las mutaciones se GOF (continuación) 23. La afirmación de que algunos son LOF parece contradecir el fenotipo de TRPV4-/ - ratón knockout, que son viables o fértiles, con sólo pequeños defectos, a pesar de una pérdida completa de la función TRPV4.

Una parte de estas controversias tiene origen metodológico. Los laboratorios usan diferentes métodos, o variantes de un método, y emplean diferentes normas de juzgamiento. Por lo general, TRPV4 se expresa transitoriamente en células de mamífero en cultivo (HEK, CHO, HeLa) y el surgimiento de interior [Ca 2 +] sobre agonista o estimulación hipotónica está registrada con el colorante fluorescente sensible a Ca + 2, Fura-2. El exceso de confianza en este ensayo fluorométrico ha sido criticada 1. El nivel de expresión en diferentes poblaciones, necesita ser controlado y documentado la distribución en el mismo, así como la concentración de colorante eficaz,. Más fiable es los exámenes electrofisiológicos directos. Incluso esto, como commonly practica, también no está exenta de problemas. Debido a que los niveles de expresión en células cultivadas individuales son difíciles de controlar, las corrientes de células enteras tienen grandes variaciones. Además, puesto que las corrientes son pequeñas, las estadísticas fiables tendrán que depender de muestras de gran tamaño, a menudo no es práctico. Rara vez se han realizado los exámenes Patch-clamp. Algunas de estas grabaciones muestran racimos de estallidos de actividad que componen la evaluación estadística desafiante 16,17.

Para comprender mejor el mechanosensitivity molecular, se han desarrollado dos sistemas adicionales para examinar TRPV4. (1) Para aislar TRPV4 lejos de sus socios de mamíferos habituales, hemos expresado TRPV4 rata en ciernes de levadura 24. La expresión funcional de TRPV4 en este contexto evolutivamente distantes mostró que aún podría responder a la fuerza osmótica sin sus socios habituales. Debido a que la levadura no hace PUFAs como AA o EET, y su genoma no tiene genes PLA2 o epoxigenasa, esta expression también muestra que no se requieren para TRPV4 para detectar la fuerza. Tener TRPV4 en los eucariotas biológicamente más susceptibles moleculares también permite la manipulación eficiente de avanzar-o revertir-genéticos 25. (2) Para los análisis biofísicos en profundidad de TRPV4, expresamos TRPV4 en ovocitos de Xenopus. A diferencia de las células cultivadas, que producen sub-nA a nA (10 -10 a 10 -9 A) corrientes, un oocito expresa corrientes en μA de (10 -6 a 10 -4 A). Señal mucho más grande sobre el ruido permite una mejor cuantificación y la comparación con más confianza. TRPV4, así expresado, también se puede examinar como moléculas individuales utilizando un patch clamp. Un único ovocito permite el muestreo de parches repetido, de nuevo haciendo una cuantificación más fiable. Estos estudios mostraron que la propia canal TRPV4 directamente puede ser activado por fuerza de estiramiento de la membrana 14. Los análisis también mostraron que 14 alelos representativos esquelético-displasia son todas las mutaciones con ganancia de función. Además, el degree de este constitutiva Ca 2 + fugas es paralelo a la gravedad de las enfermedades esqueléticas 23.

Debido a su novedad y utilidad, los procedimientos detallados de estos dos métodos se ensamblan aquí para permitir repeticiones en futuras investigaciones sobre TRPV4 o canales similares.

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Protocolo

1. Métodos luminometría Levadura

Utilice cepa BYYT de Saccharomyces cerevisiae. Es un yvc1-tok1-derivado de BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformar las células con los plásmidos pEVP1/Aeq Aequorina que expresan-Leu seleccionable y la rata TRPV4-expresión de plásmido-ura seleccionable p416GPDV4, como se describe en Batiza et al. 26 y Loukin et al. 24 Use métodos estándar de la construcción del plásmido y la transformación 27 . La cepa de levadura y plásmidos están disponibles bajo petición.

  1. Cultura 2 ml de células de levadura durante toda la noche a fase de post-logarítmica en un agitador 30 ° C en Leu-URA-"DCD" medio de abandono 28 (una variante sulfato-empobrecido del medio de CMD-Leu-ura 29), suplementado con sorbitol 1M . Inocular 200 l de estos cultivos en 1,8 ml de medio fresco suplementado con 2 mM de la Luciferin coelenterazina. Crecer en la oscuridad a temperatura ambiente durante otras 24 horas sin agitación.
  2. Medir la osmolaridad de la cultura (típicamente a 1400 mOsM) y otras soluciones (a continuación) utilizando un osmómetro de presión de vapor.
  3. Alícuota de 20 l de cultivo fresco en un tubo luminómetro 12 mm para un solo tubo luminómetro.
  4. Para el choque hipotónico, añadir 200 l de una solución, que contiene 25 mM de NaEGTA (pH 7,2) o nombres (pH 7,2) y NaCl 500-100 mM, (osmolaridad total de 1,200-400 mOsM) dependiendo del grado de descarga deseada. Monitorear continuamente la luminiscencia antes y por lo menos 120 segundos después de la downshock osmótica, sólo interrumpido por la breve operación de dilución. Registro de salida luminómetro en un ordenador de escritorio como unidades relativas de luminiscencia (RUL).

Aunque no para el estudio de TRPV4 transgénico, hemos utilizado una variante del protocolo anterior en un sistema automatizado para examinar las respuestas de un gran número de cepas de levadura. Estudio of las respuestas a la hipo-30 o hiperosmóticos 31 estímulos del deletome levadura (la colección de 4906 de la levadura deletants de un solo gen) utilizando un luminómetro de microplacas y analizadas con el software correspondiente ha sido un éxito.

2. y 3. Métodos de ovocitos Electrofisiología

Electrofisiología utiliza métodos básicos 32. PCR amplificar el marco de lectura abierta de tipo salvaje o mutante TRPV4 utilizando alta fidelidad PfuUtra polimerasa e integrado en pGH19 33. Esto implica una inserción precisa de la ORF entre los 5 'y 3' UTRs de el gen β-globina de Xenopus y aguas abajo de un promotor de la ARN-polimerasa de T7. Linealizar el constructo de aguas abajo de la UTR 3 'y utilizado como plantillas en una reacción in vitro de la polimerasa de ARN de T7 en. Utilizar técnicas de biología molecular estándar 34.

Utilice ovocitos V-VI de la etapa de X. laevis. La cría de animales, ovariecto parcialmi, la eliminación del sobre defolliculation y vitelina siga los procedimientos estándar 32,33,35. Inyectar 2-40 ng de ARNc por oocito solución usando un microinyector automática Drummond Nanoinject II. Inyectar ~ 30 ovocitos por cada conjunto de experimentos. Después de la inyección de ARNc de TRPV4-, incubar los ovocitos en el medio ND96 con gentamicina (100 mg / ml) y 1 M rojo de rutenio 14.

2. Dos Electrodo abrazadera de voltaje

  1. Tire de borosilicato pipetas de registro de vidrio de precisión desechables Micropipetas 100 l individualmente con un extractor de pipeta.
  2. Tire tanto voltaje de medición y electrodos de pipeta corrientes inyección se tiran a tener una abertura punta de ~ 1 m de diámetro.
  3. Electrodos de reposición con 2 M KCl resultante en 0,1-0,2 resistencia mΩ. Montarlos en Headstages HS2A, que junto con una abrazadera de baño virtual con conexión a tierra VG-2Ax100, están conectados a una interfaz GeneClamp 500 amplificador a través de un digitalizador Digidata 1440. Adquirir datos utilizando el software pClamp10.
  4. Coloque el ovocito para ser probado en un baño de 1 ml en una cámara de plástico fabricada montada en el escenario de un microscopio de disección con 20 aumentos. La solución del baño es virtual a tierra por un puente de agar 3 M KCl y un cable de plata clorada colocado cerca del ovocito y conectado a una etapa de tierra virtual VG-2A.
  5. Construir la cámara para la perfusión continua con tubos de plástico como de entrada y salida de solución. Conectar el tubo de entrada está conectado a un sistema de perfusión fabricada, que es un múltiple de seis conchas 50 ml de jeringa, cada uno lleno con una solución diferente. Tipos de alimentación por gravedad de cualquier solución particular se controla para ~ 2-3 ml / min utilizando "Keck" abrazaderas de rampa en los tubos.
  6. Montar los dos electrodos con sus Headstages sobre micromanipuladores. Realice las penetraciones de electrodo del ovocito por micromanipulación.

3. Patch Clamp Examen de directo mecanosensibilidad

"> Los métodos básicos de patch clamp incluyendo la preparación de la pipeta, la formación GΩ-sello, y formación de en-célula o modos extirpados son aquellos en los Hamill et al. 36 y Conn 32.

  1. Llenar pipetas de vidrio de borosilicato con una abertura ~ 1 m de diámetro en la punta (número de burbujas 5-6) con 98 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, y 10 mM de K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Coloque la pipeta de pinzamiento zonal a través de un tubo de plástico a una jeringa de 5 ml y por medio de una junta en T, también a un manómetro. Utilice un ordenador para manejar tanto el electrodo y las salidas de manómetro. Adquirir datos a 10 kHz, y luego jugar de nuevo a través de un filtro de ocho polos Bessel a 1 kHz para el análisis.
  3. Diferentes parches pueden ser extirpados de la misma ovocito repetidamente. Esta práctica hace que el análisis de la actividad molecular de TRPV4 más eficiente y confiable.

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Resultados

En un experimento típico luminometría, una gama de 400-1,200 mOsM choques hipotónicas abajo se logra mediante la adición de 200 l de soluciones de choque de diferente osmolaridad baja a 20 l de cultivo a 1.400 mOsM. La actividad TRPV4 es evidente cuando el RLU de la experimental se comparó con la de dos controles negativos: células de levadura transformadas con el plásmido p416GPDV4 vacía o una que contiene el gen TRPV4 con una mutación en el filtro de iones (Figura 1) 24.

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Discusión

Como se dijo en la introducción, los métodos comúnmente utilizados para estudiar las funciones TRPV4 veces resultaron en inconsistencias y controversias. Los dos conjuntos de métodos descritos aquí ofrecen algunas ventajas y pueden complementar los métodos existentes. Mientras describimos sólo los estudios sobre TRPV4, los métodos pueden ser extendidos para estudiar otros canales iónicos también.

1. Métodos luminometría Levadura

Levadura en ciernes tiene una Ca

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Andrea Kremsreiter por su excelente asistencia técnica. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por el NIH GM096088 y el Vilas Confianza de la Universidad de Wisconsin - Madison.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Osmómetro de presión de vaporWescorWescor 5500Logan, UT, EE. UU
. Luminómetro de un solo tubo Sirius Titertek-BerholdSiriusHuntsville, LA, EE. UU.
Luminómetro de microplacaTitertek-BertholdMithras LB940Huntsville, LA, EE. UU.
Software de luminometríaTitertek-BertholdMikroWin2000Huntsville, LA, EE. UU.
Pinza de parche y softwareAxon InstrumentHS2A headstage, VG-2Ax100 abrazadera de baño virtual con conexión a tierra, amplificador GeneClamp 500, digitalizador digidata 1440, Software pClamp10Union City, CA, EE. UU.
ManómetroBio-TecWinooski, VT, EE. UU.
Extractor de pipetasSutter Instrument CoModelo P-97Novata, CA, EE. UU
MicroinyectorDrummond ScientificNanoinject IIBroomall, PA, EE. UU.
Luciferina celenterazinaInvitrogenCarlsbad, CA, EE. UU
ARN polimerasa T7 reacciónAmbionmMessage mMachineAustin, TX, USA
GentamicinSigma 
Rojo de rutenio Sigma 
Micropipetas Micropipetas Drummondde 100 microlitrosBroomall, PA, EE. UU
. PfuUtra polimerasa de alta fidelidad StratageneLa Jolla, CA, Estados Unidos
. .

Referencias

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