Método de preparación de diapositivas para preservar la arquitectura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares

Resumen

El material aquí describe un método desarrollado para preservar la estructura tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares. Esto se ha denominado el método de diapositiva tridimensional (3D). Este método mejora la sensibilidad para la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH).

Resumen

Durante la diferenciación testicular de la célula de germen, la estructura de la cromatina nuclear cambia dinámicamente. A continuación se describe un método diseñado para preservar la disposición tridimensional de la cromatina de las células germinales testiculares que se encuentran en ratones; este método se ha denominado como el método de diapositiva tridimensional (3D). En este método, los túbulos testiculares se tratan directamente con un paso de permeabilización que elimina el material citoplasmático, seguido de un paso de fijación que fija los materiales nucleares. Los túbulos se disocian, la suspensión celular es citospun, y las células se adhieren a los portaobjetos. Este método mejora la sensibilidad hacia la detección de estructuras subnucleares y es aplicable para la inmunofluorescencia, el ADN y la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) y la combinación de estos métodos de detección. Como ejemplo de una posible aplicación del método de deslizamiento 3D, se muestra que un COT-1 RNA FISH detecta ARN nacientes. El método de deslizamiento 3D facilitará el examen detallado de las relaciones espaciales entre la estructura de la cromatina, el ADN y el ARN durante la diferenciación testicular de las células germinativas.

Introducción

En los testículos, las células germinales se diferencian de la espermatogonia diploide a través de la meiosis en espermatozoides maduros y haploides. Durante este proceso, la estructura de la cromatina nuclear de las células germinales se remodela de forma continua y dinámica. Las separaciones superficiales son de uso general para la examinación citológica de células espermatogénicas individuales. Un método predominante de diseminaciones superficiales emplea el tratamiento hipotónico por el cual las células espermatogénicas individuales se propagan y aplanan¹. Estas condiciones son óptimas para el análisis detallado de cromosomas meióticos. Las característi....

Protocolo

1.3D Preparación de diapositivas

1. Prepare los siguientes reactivos:
   1. Tampón CSK: 100 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 10 mM PIPAS, 3 mM MgCl_2. Ajuste el pH a 6,8 con NaOH de 1 M. Almacene el búfer CSK a 4 °C.
   2. Tampón CSK con Tampón Tritón X-100 al 0,5%: Añadir 200 μl de Tampón X-100 a 40 ml de Tampón CSK. Mezcle la solución con agitador magnético hasta que Triton X-100 se disuelva por completo. Almacene el tampón CSK con 0,5% tritón X-100 a 4 °C.
   3. Paraformadehído al 4% (PFA)–PBS, pH 7.4: Disolver 4 g de PFA en aproximadamente 70-80 ml de agua. Para acelerar el proceso de disolución, añadir aproximadamente 20 μl de NaOH de 4 N y ....

Resultados

Un resultado representativo de una diapositiva 3D se muestra en la Figura 2. En este experimento, cot-1 ARN FISH se realizó para detectar la transcripción naciente junto con inmunostaining utilizando anticuerpos anti CBX1 y γH2AX. Para combinar el ARN FISH y el immunostaining, el immunostaining fue realizado primero, seguido por el PESCADO del ARN según lo descrito en^3. CBX1 es una proteína heterocromatina que se localiza en heterocromatina pericentromérica y cromosomas sexuales silenciosos en.......

Discusión

En la preparación de diapositivas 3D, el paso de permeabilización precede al paso de fijación. Estos pasos se realizan directamente sobre túbulos seminíferos, preservando así la estructura tridimensional de la cromatina. Una opción alternativa para preservar la estructura de la cromatina para el ARN/ADN FISH es realizar la etapa de permeabilización y la etapa de fijación simultáneamente. Esta técnica alternativa se ha realizado en células germinales marsupiales y en embriones preimplantacional de ratón^7,8. Sin.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADN de la cuna-1	Invitrogen	18440-016
Stratagene Prime-It Kit de etiquetado de fluorescencia fluorada	Agilent	300380
Solución de ADN de esperma de arenque	Invitrogen	15634-017
Etanol. 200 prueba (absoluta)	Pharmco-aaper	111000200
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Formamida desionizada	American Bioanalytical	AB00600-00500
Citrato de sodio tribásico dihidratado	Sigma-Aldrich	C8532
Albúmina sérica bovina	Lifeblood Medical	77110-100
Sulfato de dextrano sal sódica de Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D6001
RPMI 1640	Invitrogen	A10491-01
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
TUBOS	Sigma-Aldrich	P6757
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M0250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	76240
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	221465
solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
VECTASHIELD Medio de montaje con DAPI	Vector Laboratories	H1200
Complejo de ribonucleósido-vanadilo	Nueva Inglaterra Biolabs	S1402S
Illustra MicroSpin G-50 Columnas	GE Healthcare	27-5330-01
Microcentrífuga	Eppendorf	5424
Pinzas	VWR	300-050
Tubos de microcentrífuga	Bioexpress	C-3262-1
Cytospin 3	Shandon
Coplin Jar	Fisher	08-815
Superfrost /Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher	12-550-15
Plato de 4 pocillos	Fisher	12-566-301
Cubrevas	Fisher	12-544-G
Incubadora de aire	Revolutionary Science	RS-IF-203