La migración transepitelial del neutrófilo en respuesta a la infección bacteriana de la mucosa contribuye a lesión epitelial y a la enfermedad clínica. Se ha desarrollado un modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos y capas polarizadas de células epiteliales humanas cultivadas en filtros transwell para facilitar las investigaciones hacia el desentrañamiento de los mecanismos moleculares que orquestan este fenómeno.
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Artículo de método
In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las superficies mucosas sirven como barreras protectoras contra organismos patógenos. Las respuestas inmunitarias innatas se activan al detectar patógenos que conducen a la infiltración de tejidos con células inflamatorias migratorias, principalmente neutrófilos. Este proceso tiene el potencial de ser destructivo para los tejidos si es excesivo o se mantiene en un estado no resuelto. Los modelos ines vitro cocultivos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos moleculares únicos implicados en la migración transepitelial inducida por patógenos neutrófilos. Este tipo de modelo proporciona versatilidad en el diseño experimental con la oportunidad de manipulación controlada del patógeno, barrera epitelial o neutrófilo. La infección patógena de la superficie apical de monocapas epiteliales polarizadas crecidas en los filtros permeables del transwell instiga la migración basolateral a apical fisiológico relevante del transporte-epitelial de neutrófilos aplicados a la superficie basolateral. El modelo in vitro descrito en este documento demuestra los múltiples pasos necesarios para demostrar la migración de neutrófilos a través de una monocapa epitelial pulmonar polarizada que ha sido infectada con patógeno p. aeruginosa (PAO1). La siembra y el cultivo de transwells permeables con las células epiteliales derivadas humanas del pulmón se describen, junto con el aislamiento de neutrófilos de sangre humana entera y el cultivo de PAO1 y de K12 E. coli no patógeno (MC1000). El proceso de emigración y el análisis cuantitativo de los neutrófilos migrados con éxito que se han movilizado en respuesta a la infección patógena se muestran con datos representativos, incluidos controles positivos y negativos. Este sistema modelo in vitro puede ser manipulado y aplicado a otras superficies mucosas. Las respuestas inflamatorias que implican la infiltración excesiva del neutrófilo pueden ser destructivas a los tejidos del anfitrión y pueden ocurrir en la ausencia de infecciones patógenas. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que promueven la migración transepitelial del neutrófilo con la manipulación experimental del sistema in vitro del análisis del cocultivo descrito adjunto tiene potencial significativo para identificar las blancos terapéuticas nuevas para una gama de enfermedades infecciosas de la mucosa así como inflamatorias.
Introducción
Las superficies mucosas sirven como barreras físicas e inmunológicas proporcionando protección contra las amenazas externas generalizadas en el medio ambiente1,2. Esta barrera epitelial protectora puede verse comprometida cuando los organismos patógenos invaden2. En el caso de un patógeno bacteriano, este encuentro a menudo instiga un proceso inflamatorio al activar el sistema inmune innato y desencadenar una rápida movilización de granulocitos de primer respondiente conocidos como neutrófilos2-4. Los agentes quimiotácticos que facilitan el reclutamiento de neutrófilos son producidos en parte por las células epiteliales de la mucosa qu....
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Protocolo
Los pasos (1-3) deben realizarse en un ambiente estéril bajo una campana de flujo laminar.
1. Recubrimiento de colágeno Transwells
- Haga una solución de colágeno de 30 μg/ml. Diluir 3 mg/ml de colágeno 1:100 en etanol al 60% que ha pasado a través de una unidad de filtro de 0,2 μm.
- Vórtice diluido 30 μg/ml solución. Nota: No es necesario vortex la solución de 3 mg/ml de colágeno, ya que esta solución es bastante viscosa y se pueden introducir burbujas de aire, lo que potencialmente disminuye la precisión al pipetear.
- Retire los transwells de área de crecimientode 0,33 cm 2 con un tamaño de p....
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Resultados
Varios estudios han demostrado que las capas epiteliales infectadas por patógenos facilitan la migración transepitelial de neutrófilos3,8,19,24-28,31,32. Esto ocurre a través de una inducción específica del patógeno de un gradiente quimiotáctico de neutrófilos derivado de células epiteliales3,23. Por ejemplo, la patogenicidad de P. aeruginosa que interactúa con la superficie apical de las células epiteliales pulmonares hace que un número sustancial de neutrófilos migren a través de la capa .......
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Discusión
La migración de neutrófilos a través de las superficies epiteliales de la mucosa es una característica común en la patología de la enfermedad después de la infección con patógenos bacterianos3. La metodología descrita en este documento ofrece un enfoque rápido y directo para aislar experimentalmente este evento discreto utilizando un sistema de ensayo de cocultivo in vitro derivado de células humanas que modela una característica del proceso inflamatorio desencadenado por infecciones bacterianas. Este.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por los NIH (1 R01 AI095338-01A1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Células NCl-H292 | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medio | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC# | 47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) líquido | Invitrogen | 14190-144 | sin calcio y magnesio |
| Suero fetal bovino inactivado por calor | Invitrogen | 10082-147 | 10% añadido al medio de cultivo |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10.000 unidades de penicilina y 10.000 µ g de estreptomicina por ml. |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml de alícuotas se almacenan congeladas a -20 ºC. La alícuota en uso se puede almacenar en 4 º C a corto plazo. |
| Solución salina equilibrada de Hank - HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Solución estéril, sin calcio ni magnesio |
| Azul | tripán Invitrogen | 15250-061. | Acciones = 0,4% |
| Colágeno, cola de rata | Invitrogen | A10483-01 | También se puede aislar en el laboratorio directamente de las colas de ratas utilizando protocolos estándar |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Componente de una solución de tampón de citrato 1 M y citrato ácido dextrosa (ACD) |
| Citrato de sodio | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Componente de tampón de citrato 1 |
| M Dextrosa anhidra | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Componente de la solución de citrato ácido dextrosa (ACD) |
| Cloruro de amonio | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Componente del tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Componente del tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Componente del tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) |
| HBSS(+) polvo | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Componente clave de HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Componente de HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Siga las instrucciones del proveedor para recubrir las puntas de pipeta de vidrio |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) sal de diamonio (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Componente clave de la solución de sustrato ABTS |
| Solución de peróxido de hidrógeno al 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Componente de la solución de sustrato ABTS |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP o fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | Se debe preparar una solución madre de 10 mM en DMSO y almacenar alícuotas a -20 ºC. |
| Gelatina Tipo B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Agar de aislamiento de Pseudomonas | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Seguir fabricante s instrucciones para hacer placas PIA |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Opcional, puede mejorar la pureza de los neutrófilos |
| Placa de migración de 24 pocillos | Corning Incorporated | #3524 | |
| Placa de lavado de 24 pocillos | Falcon | 35-1147 | Se puede reutilizar si se empapa en etanol al 70% y se lava a fondo antes de la reutilización |
| Placa de 96 pocillos | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Soportes permeables Transwell | Corning Incorporated | #3415 | Policarbonato; Diámetro: 6,5 mm; Área de crecimiento: 0,33 cm2; Estilo de plato: plato de 24 pocillos; Tamaño de poro: 3.0 y micro; m |
| Placa de Petri | Falcon | 35-1013 | Cada placa de Petri contiene 24 Transwells invertidos de 0,33 cm2 |
| 500 ml 0,2 μ m filtro / matraz | Fisher Scientific | 09-740-25A | Para esterilizar una solución de citrato ácido dextrosa (ACD) |
| 5-3/4 en vidrio Pipeta Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20A | Puntas de recubrimiento con Sigmacote antes de usar |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | |
| Microscopio Invertoskop | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Lector de microplacas | Dispositivos Moleculares | #432789 |
Referencias
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threat....
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Reimpresiones y permisos
