Aquí detallamos un método de cultivo de gérmenes dentales en rodajas mandíbula usando un cortador de tejidos. Este método permite un acceso único a los dientes durante el desarrollo, que proporciona una excelente oportunidad para la manipulación y el linaje de rastreo, no está disponible utilizando métodos de cultivo más tradicionales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura
En este artículo
Resumen
Resumen
Cultura explante permite, por tanto, la manipulación de desarrollar órganos en puntos específicos de tiempo y es un método importante para el biólogo del desarrollo. Para muchos órganos es difícil acceder a los tejidos en desarrollo para permitir el monitoreo durante el cultivo ex vivo. El método de cultivo de cortes permite el acceso a los tejidos para que los movimientos morfogenéticos pueden ser seguidos y poblaciones específicas de células pueden ser objeto de manipulación o rastreo de linaje.
En este trabajo se describe un método de cultivo de cortes que ha sido muy exitoso para el cultivo de los gérmenes de los dientes en una amplia gama de especies. El método proporciona un excelente acceso a los gérmenes de los dientes, que se desarrollan a un ritmo similar al observado in vivo, rodeado de los otros tejidos de la mandíbula. Esto permite interacciones de tejido entre el diente y el tejido circundante a controlar. Aunque este documento se concentra en los gérmenes de los dientes, el mismo protocolo se puede aplicar a seguir el desarrollo de un númerode otros órganos, como las glándulas salivales, el cartílago de Meckel, glándulas nasales, lengua y orejas.
Introducción
Para un número de experimentos es importante ser capaz de cultivo de tejidos ex vivo para seguir el desarrollo. Cultura de desarrollar tejido proporciona acceso a determinados períodos de desarrollo y permite la manipulación de los genes por la adición de factores al medio de cultivo, o en perlas cargadas, y por el uso de la transfección y la electroporación 1. Para muchos experimentos es importante ser capaz de visualizar el tejido a medida que crece, por ejemplo, para seguir el destino de las células de linaje etiquetado como el tejido se somete a la morfogénesis. Esto puede ser particularmente problemático para los tejidos que se desarrollan pr....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Establecer
- Enfocar los instrumentos de disección (con una piedra de afilar lubricado con aceite mineral) y esterilizar antes de su uso para el cultivo de órganos utilizando un spray de etanol al 70% y la esterilización de calor seco. Afilar las agujas de disección utilizando la electrólisis en 2 M de hidróxido de sodio utilizando un suministro de 12 V.
- Preparar el medio de cultivo utilizado para la disección y la cultura de órganos embrionarios, que consta de modificación F12 Medio Eagle de avanzada Dulbecco (DMEM F12), complementado con 1% GlutaMAX y 1% de penicilina-estreptomicina.
2. La disección de embrione....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Con el fin de seguir el movimiento de la primera folículo dental molar, 250 micras rodajas frontales fueron tomadas a través de una mandíbula utilizando el método descrito anteriormente. El folículo dental es la capa de mesénquima que rodea el epitelio del esmalte exterior (OEE) del diente en desarrollo, y se ha mostrado previamente para tomar parte en la formación de tejido del periodonto 6. Mandíbulas fueron disecados en E14.5, la etapa de desarrollo de los dientes cap. En la rebanada el contorno del epitel.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este método de la cultura de los dientes tiene la ventaja de que el acceso a la germen del diente es excelente, lo que permite linaje precisa la localización y la colocación de los granos en el epitelio o el mesénquima. Por lo tanto, las regiones definidas del germen dentario en desarrollo pueden ser dirigidos específicamente. Durante el cultivo de la morfología cambiante de la germen del diente se puede seguir, y el efecto de las manipulaciones evaluarse rápidamente.
El método, sin embargo,.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Sarah A. Alfaqeeh es financiado por Kind Saud University College de Odontología, Ministerio de Educación Superior, Reino de Arabia Saudita.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol | VWR | 101077Y | El etanol al 100% se diluyó en H2O destilado al 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma | P0781 | |
| DiI (Sondas moleculares) | Vybrant | V-22885 | Solución |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO ( Sondas moleculares) | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Esterilización por calor seco |
| Picadora de tejidos McIlwain | Ted Pella, Inc. | 10180 | Mesa estándar |
| Placa de cultivo de órganos (placa de cultivo de órganos Center-Well) | halcón | ||
| (insertos de cultivo celular, 0,4 μ m tamaño de poro) | BD Falcon | 353090 | Membrana de PET grabada con rieles, formato de 6 pocillos |
| Rejillas metálicas (Acero inoxidable - AISI 304 - Malla) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Calor directo CO2 Incubadora | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Picospritzer III |
| monocanalCapilar de vidrio con filamento de 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Alambre de tungsteno de 0,1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Alambre de tungsteno de 0,38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Tubos de aspiración | Sigma | A5177 | Utilizado para trazadores de linaje de aspiración bucal |
Referencias
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
