Descelularización y recelularización pulmonar de primates no humanos mediante un biorreactor especializado de órganos grandes

Summary

La descelularización de todo el órgano produce andamios biológicos naturales que pueden ser utilizados para la medicina regenerativa. Se presenta la descripción de un modelo de regeneración pulmonar en primates no humanos en el que se descelularizan pulmones completos y luego se siembran con células madre adultas y células endoteliales en un biorreactor que facilita la circulación vascular y la ventilación de medios líquidos.

Abstract

Hay un número insuficiente de pulmones disponibles para satisfacer las necesidades actuales y futuras de trasplante de órganos. La regeneración de tejidos bioartificiales es una alternativa atractiva al trasplante clásico de órganos. Esta tecnología utiliza la matriz extracelular biológica (MEC) natural de un órgano como andamio en el que se pueden sembrar y cultivar células autólogas o madre/progenitoras de tal manera que facilite la regeneración del tejido original. La MEC natural se aísla mediante un proceso llamado descelularización. La descelularización se logra mediante el tratamiento de los tejidos con una serie de detergentes, sales y enzimas para lograr una eliminación efectiva del material celular mientras se deja intacta la MEC. Los estudios realizados utilizando la descelularización y la posterior recelularización de los pulmones de los roedores demostraron un éxito marginal en la generación de tejido similar al pulmón que es capaz de intercambiar gases in vivo. Si bien ofrecen una prueba de concepto esencial, los modelos de roedores no se pueden trasladar directamente al uso humano. Los primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) ofrecen un modelo más adecuado para investigar el uso de la producción de órganos bioartificiales para su eventual uso clínico.

Se presentan los protocolos para lograr la descelularización completa de los pulmones adquiridos del macaco rhesus NHP. Los pulmones acelulares resultantes se pueden sembrar con una variedad de células, incluidas las células madre mesenquimales y las células endoteliales. El manuscrito también describe el desarrollo de un sistema de biorreactor en el que se pueden cultivar pulmones de macaco sembrados con células en condiciones de estiramiento y tensión mecánicos proporcionados por ventilación con presión negativa, así como perfusión pulsátil a través de la vasculatura; Se sabe que estas fuerzas dirigen la diferenciación a lo largo de los linajes pulmonar y endotelial, respectivamente. Se proporcionan resultados representativos de la descelularización y la siembra celular.

Introduction

La bioingeniería de tejidos y órganos es una adición atractiva al campo de la medicina regenerativa. La creación de órganos "cultivados en laboratorio" que sean adecuados para el trasplante en pacientes para reemplazar la funcionalidad de los órganos enfermos es muy deseable para satisfacer la demanda actual y futura de necesidades de trasplante. Los principios de la ingeniería de tejidos se centran en la siembra de los tipos de células deseados, o progenitores de los mismos, en un andamio que soporta la forma del tejido modificado mientras proporciona los factores de crecimiento apropiados y las condiciones de cultivo necesarias para imitar los procesos de desarrollo....

Protocol

1. Descelularización pulmonar de macaco de órgano entero

1. Preparación de soluciones
   1. Autoclave 10-15 L de agua desionizada (dH₂O) en botellas de 1-2 L.
   2. Prepare la "solución de Triton" (0,1% de Triton X-100 en dH₂O) mezclando 1 ml de Triton X-100 en 999 ml de dH₂O mientras agita en un agitador magnético. Filtre la solución a través de un aparato de filtro de 0,22 μm. Almacene a temperatura ambiente.
   3. Prepare la "solución SDC" (2% SDC en dH₂O) agregando lentamente 20 g de desoxicolato de sodio (SDC) a ~ 900 ml dH₂O mientras agita. Una vez disuelto el SDC, transfier....

Results

Los resultados que se muestran a continuación representan experimentos separados en los que se sembraron compartimentos vasculares o de vías respiratorias con células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea de macaco rhesus o células endoteliales microvasculares derivadas del pulmón rhesus, respectivamente, que se aislaron y caracterizaron como se describió anteriormente^16-18.

A lo largo del proceso de descelularización, los pulmones de los macacos mostraron un blanqueamient.......

Discussion

Los tejidos pueden descelularizarse de manera eficiente y efectiva mediante una serie de métodos que emplean agentes físicos, químicos y enzimáticos^12,20. Los desafíos de producir matrices biológicas 3D a partir de órganos grandes incluyen la necesidad de grandes volúmenes de soluciones de descelularización, equipos comerciales costosos (es decir , biorreactores) y una cantidad vertiginosa de perturbaciones metodológicas necesarias para lograr el producto final derivado del tejido. Nuestro método prop.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nitroprusiato de sodio	Sigma-Aldrich	71778-25G
Sal de heparina sódica	Fisher	BP2425
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Desoxicolato de sodio	Fisher	BP349-100
Cloruro de sodio	Fisher	7647-14-5
DNasa pancreática bovina	Sigma-Aldrich	DN25	Preparar caldo, alícuota y congelar
Sulfato de magnesio	Fisher	10034-99-8
Cloruro de calcio	Fisher	C614-500
PBS (no Ca/Mg)	Gibco, Life Technologies	10010-031
Antibiótico-Antimicótico	Gibco Life Technologies	15240062
Medios
Alfa MEM	Gibco Life Technologies	12561-072
Medio 199	Gibco Life Technologies	11150067
Suero Fetal Bovino Premium	Atlanta Biologicals	S11150
L-Glutamina 100x	Gibco Life Technologies	25030-081
Suplemento de Crecimiento de Células Endoteliales (ECGS)	ScienCell	1052
Antibiótico-Antimicótico	Gibco Life Technologies	15240062
Sembrado de células y cultivo de biorreactor Válvulas
de retención	Cole-Parmer	EW-98553-20
Conectores en Y	Cole-Parmer	ED-30614-08
Llaves de paso de 3 vías	Harvard Apparatus 721664
MasterFlex L/S 14 tubos	Cole-Parmer	96420-14
MasterFlex L/S 16 tubos	Cole-Parmer	96420-16
Cerradura macho Luer 1/8 in	Cole-Parmer	EW-45505-04
Luer hembra 1/8 in	Cole-Parmer	SI-45502-04
Tapón de bloqueo Luer macho	Cole-Parmer	EW-45505-56
Puertos de inyección	Medi-Dose EPS	IV2004
Tubo de látex	St. Louis Medical Suppy	HN10910
Abrazadera de manguera	Cole-Parmer	EW-06832-02
2 L Tarro de boca ancha	Fisher	05-719-276
60 ml Jeringas	Fisher	NC9035364