La descelularización de todo el órgano produce andamios biológicos naturales que pueden ser utilizados para la medicina regenerativa. Se presenta la descripción de un modelo de regeneración pulmonar en primates no humanos en el que se descelularizan pulmones completos y luego se siembran con células madre adultas y células endoteliales en un biorreactor que facilita la circulación vascular y la ventilación de medios líquidos.
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Artículo de método
Descelularización y recelularización pulmonar de primates no humanos mediante un biorreactor especializado de órganos grandes
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Resumen
Resumen
Hay un número insuficiente de pulmones disponibles para satisfacer las necesidades actuales y futuras de trasplante de órganos. La regeneración de tejidos bioartificiales es una alternativa atractiva al trasplante clásico de órganos. Esta tecnología utiliza la matriz extracelular biológica (MEC) natural de un órgano como andamio en el que se pueden sembrar y cultivar células autólogas o madre/progenitoras de tal manera que facilite la regeneración del tejido original. La MEC natural se aísla mediante un proceso llamado descelularización. La descelularización se logra mediante el tratamiento de los tejidos con una serie de detergentes, sales y enzimas para lograr una eliminación efectiva del material celular mientras se deja intacta la MEC. Los estudios realizados utilizando la descelularización y la posterior recelularización de los pulmones de los roedores demostraron un éxito marginal en la generación de tejido similar al pulmón que es capaz de intercambiar gases in vivo. Si bien ofrecen una prueba de concepto esencial, los modelos de roedores no se pueden trasladar directamente al uso humano. Los primates no humanos (NHP, por sus siglas en inglés) ofrecen un modelo más adecuado para investigar el uso de la producción de órganos bioartificiales para su eventual uso clínico.
Se presentan los protocolos para lograr la descelularización completa de los pulmones adquiridos del macaco rhesus NHP. Los pulmones acelulares resultantes se pueden sembrar con una variedad de células, incluidas las células madre mesenquimales y las células endoteliales. El manuscrito también describe el desarrollo de un sistema de biorreactor en el que se pueden cultivar pulmones de macaco sembrados con células en condiciones de estiramiento y tensión mecánicos proporcionados por ventilación con presión negativa, así como perfusión pulsátil a través de la vasculatura; Se sabe que estas fuerzas dirigen la diferenciación a lo largo de los linajes pulmonar y endotelial, respectivamente. Se proporcionan resultados representativos de la descelularización y la siembra celular.
Introducción
La bioingeniería de tejidos y órganos es una adición atractiva al campo de la medicina regenerativa. La creación de órganos "cultivados en laboratorio" que sean adecuados para el trasplante en pacientes para reemplazar la funcionalidad de los órganos enfermos es muy deseable para satisfacer la demanda actual y futura de necesidades de trasplante. Los principios de la ingeniería de tejidos se centran en la siembra de los tipos de células deseados, o progenitores de los mismos, en un andamio que soporta la forma del tejido modificado mientras proporciona los factores de crecimiento apropiados y las condiciones de cultivo necesarias para imitar los procesos de desarrollo o regeneración. Si bien los andamios sintéticos se han utilizado para la ingeniería de tejidos, la matriz extracelular natural (MEC) puede ser la mejor fuente de andamios específicos de órganos para este propósito. La descelularización de todo el órgano es un proceso que permite la eliminación de células mientras se dejan intactos los aspectos químicos y estructurales de la MEC nativa. El andamio de matriz acelular resultante se puede utilizar como una plataforma en la que se pueden sembrar y cultivar células regenerativas in vitro1,2.
Se han desarrollado varios modelos de descelularización pulmonar y posterior recelularización en roedores para estudiar la viabilidad de esta tecnología3-6. Si bien ofrecen una prueba de concepto esencial, los modelos de roedores no son directamente trasladables a las necesidades clínicas humanas. Un estudio reciente señaló que las respuestas genómicas a las lesiones traumáticas (y la inflamación relacionada) no se correlacionan bien entre ratones y humanos; Estos hallazgos plantean preguntas sobre la validez del uso de ratones como modelos para procesos bioquímicos tan complejos en humanos7. Los modelos de primates no humanos (NHP) ofrecen la ventaja de parecerse mucho a la biología de los humanos a nivel genómico, anatómico y fisiológico y permiten una manipulación más flexible para una mayor extrapolación al uso humano. El macaco rhesus se ha utilizado en una variedad de aplicaciones preclínicas y es un excelente modelo para estudiar la ingenieríade tejidos 8-11. Recientemente describimos la descelularización exitosa de los pulmones de macaco rhesus (Macacca mulatta) utilizando un procedimiento que tiene un impacto mínimo en la MEC pulmonar12. La descelularización pulmonar se logra mediante el tratamiento del tejido consecutivamente con cuatro soluciones de descelularización compuestas por detergentes, sales y enzimas con lavado intermitente con agua desionizada (dH2O) y PBS. Hemos optimizado este procedimiento modificando un protocolo descrito originalmente por Price et al.4 Se utilizaron diversas técnicas histológicas y analíticas de proteínas para caracterizar los componentes de las matrices acelulares resultantes en relación con los pulmones de macacos nativos.
En este informe, demostramos un protocolo detallado para la descelularización de pulmones de primates no humanos y la recelularización de los andamios pulmonares acelulares resultantes en un biorreactor de órganos grandes demostrado originalmente por Calle et al. Al modificar su protocolo original para adaptarse a los requisitos de tamaño, ventilación y perfusión para los pulmones de animales grandes, la tecnología se trasladó con éxito del modelo de roedor al modelo de macaco rhesus. Todos los estudios presentados en este informe se realizaron de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) vigentes en el Centro Nacional de Investigación de Primates de Tulane. La demostración de esta técnica es esencial porque la identificación de las estructuras anatómicas y la manipulación física de los órganos más grandes a veces es difícil sin visualizar los pasos del protocolo. Los estudios que estos métodos han hecho posible proporcionan una base para estudios preclínicos esenciales en pulmones de macaco rhesus descelularizados en los que se puede evaluar la recelularización con células madre del linaje mesenquimal rhesus y células endoteliales microvasculares rhesus. Nuestra versión de este biorreactor simula el entorno de desarrollo y aplica fuerzas de estiramiento y tensión mecánicas en pulmones de animales grandes y permite la investigación de la recelularización pulmonar en condiciones que se sabe que facilitan el desarrollo pulmonar y endotelial13-15.
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Protocolo
1. Descelularización pulmonar de macaco de órgano entero
- Preparación de soluciones
- Autoclave 10-15 L de agua desionizada (dH2O) en botellas de 1-2 L.
- Prepare la "solución de Triton" (0,1% de Triton X-100 en dH2O) mezclando 1 ml de Triton X-100 en 999 ml de dH2O mientras agita en un agitador magnético. Filtre la solución a través de un aparato de filtro de 0,22 μm. Almacene a temperatura ambiente.
- Prepare la "solución SDC" (2% SDC en dH2O) agregando lentamente 20 g de desoxicolato de sodio (SDC) a ~ 900 ml dH2O mientras agita. Una vez disuelto el SDC, transfiera la solución a un cilindro graduado y aumente el volumen a 1 ml con dH2O. Filtre la solución a través de un aparato de filtro de 0,22 μm. Almacene a temperatura ambiente.
- Prepare la "solución de NaCl" agregando 58 g de NaCl a ~ 900 ml de dH2O y revuelva hasta que se disuelva por completo. Añadir dH2O hasta un volumen final de 1 L, filtrar y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparación de órganos
- Se debe tener sumo cuidado para evitar incidentes de exposición infecciosa cuando se trabaja con tejidos de macacos. Póngase el siguiente equipo de protección personal (EPP) antes de manipular tejidos de primates no humanos: mascarilla quirúrgica, protector facial, guantes quirúrgicos, bata desechable y una segunda capa de guantes quirúrgicos.
- Recoger bloques cardiopulmonares intactos de la necropsia animal en PBS que contengan 50 U/ml de heparina para prevenir la coagulación de la sangre externa.
- Con los pulmones acostados en una bandeja de disección, canula la arteria pulmonar usando un conector Luer hembra con una púa de tamaño adecuado. Asegure la cánula en su lugar con una brida esterilizada con alcohol.
- Deslice una brida estéril alrededor de la tráquea, inserte un conector Luer hembra de 0,250 pulgadas en la abertura traqueal y apriete la brida alrededor de la lengüeta del conector para mantener la tráquea en su lugar alrededor de la lengüeta.
- Eliminar el aire atrapado de los pulmones instilando PBS que contenga 30 U/ml de heparina y 5 μg/ml de nitroprusiato de sodio (SNP). Deje que la solución sea expulsada por el retroceso natural y repita la instilación dos veces más. Después de la tercera instilación, tape la cánula traqueal de Luer con un tapón Luer para retener la solución en los pulmones.
- Cortar el ápice del corazón e irrigar los ventrículos internos con PBS-heparina-SNP para eliminar la sangre residual. Lacerar ambas aurículas para facilitar el drenaje de los circuitos pulmonares tras la perfusión.
- Sumerja el bloque corazón-pulmón en dH2O. Llene una jeringa de 60 ml con la solución de PBS-heparina-SNP. Con fórceps, sumerja la cánula arterial para que todas las burbujas de aire escapen por la abertura vascular. Coloque la jeringa y retire con cuidado el émbolo y permita que el líquido fluya hacia la vasculatura.
- Retire el tapón de la cánula traqueal y permita que el líquido de las vías respiratorias sea expulsado por retroceso natural. Continúe agregando la solución de PBS-heparina-SNP a la jeringa conectada a la cánula vascular para mantener una presión de ~15-20 cm H2O por encima de la arteria. Continúe la perfusión hasta que se extraiga la mayor cantidad de sangre posible de la vasculatura pulmonar.
- Descelularización
- Día 1: Sumerja el bloque corazón-pulmón endH2O. Infle y perfunde el pulmón condH2O utilizando jeringas de 60 ml conectadas a las cánulas traqueales y arteriales sumergidas, respectivamente. Repita los lavados de las vías respiratorias y vasculares con dH2O 4 veces más para un total de cinco enjuagues.
- Retire los pulmones del agua y sumerja el bloque en la solución Triton. Infle y perfunde los pulmones con la solución de Tritón como antes. Repita la instilación por segunda vez e incube los órganos sumergidos en la solución de Triton durante la noche a 4 °C.
- DÍA 2: Después de la incubación durante la noche, retire el bloque pulmonar de la solución Triton, lave externamente con dH2O y luego sumerja el bloque en dH2O fresco. Repita los lavados de dH2O 5 veces como en el paso 1.3.1.
- Retire los pulmones de dH2O y sumérjalos en una solución SDC. Infle y perfunde con la solución SDC de la misma manera que en el paso 1.3.2. Incubar sumergido en solución SDC durante la noche a 4 °C.
- DÍA 3: Lavar de nuevo el pañuelo con dH2O como en 1.3.1.
- Retire el tejido de dH2O y sumérjalo en una solución de NaCl. Inflar y perfundir con la solución de NaCl de la misma manera que en el paso 1.3.2. Incubar sumergido en solución de NaCl durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lave los pulmones de la solución de NaCl con dH2O como en el paso 1.3.1.
- Prepare una "solución de DNasa" fresca (30 μg/ml de DNasa, 1,3 mM de MgSO4, 2,0 mM de CaCl2 en dH2O) Bañe los pulmones en esta solución e instile en las vías respiratorias y la vasculatura como en el paso 1.3.2. Incubar los pulmones en una solución de DNasa durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Prepare una "solución de PBS" fresca (1x PBS + 5x antibiótico/antimicótico). Retire los pulmones de la solución de DNasa y lávelos externamente con una solución de PBS. Sumerja los pulmones en la solución de PBS y lávese con esta solución cinco veces como en el paso 1.3.1.
- Almacene los pulmones en solución de PBS en un recipiente sellado durante la noche a 4 °C. Al día siguiente (DÍA 4), lavar los pulmones en una solución de PBS fresca y helada cinco veces como en el paso 1.3.1 y almacenar en una solución de PBS en un recipiente estéril y sellado a 4 °C hasta su uso.
2. Biorreactor de órgano grande
- Montaje e instalación de tejidos
- Ensamble con anticipación las estructuras del asa respiratoria y del asa vascular, así como los adaptadores de las cánulas traqueales y vasculares (Figura 1). Con la excepción de los filtros de aire estériles y los puertos de jeringa, autoclave todos los componentes del biorreactor.
- Ensamble los componentes del biorreactor bajo una campana de flujo laminar de acuerdo con el esquema de la Figura 2. Llene la cámara principal con medio de cultivo que se haya equilibrado a la atmósfera de 5% de CO2 de una incubadora de cultivo celular inmediatamente antes de su uso en el biorreactor.
- Aplique los adaptadores de cánulas traqueales y vasculares a las cánulas pulmonares e instale los órganos en la cámara principal del biorreactor bañando los pulmones en el medio de cultivo y conectando los adaptadores de cánulas a los puertos apropiados en la tapa modificada. Una vez conectado, fije la tapa de forma segura y hermética; La cámara no se volverá a abrir mientras dure la recelularización.
- Llene el depósito traqueal aproximadamente hasta la mitad con medio de cultivo y coloque la tapa modificada.
- Aplique filtros de jeringa estériles de 0,22 μm, tapones Luer y puertos de jeringa en todas las cámaras como se indica.
- Conecte el depósito de tráquea a la cámara principal a través del aparato de bucle de respiración. Conecte el tubo del asa de respiración como se indica.
- Aspire el aire del tubo utilizando los puertos de la jeringa y una jeringa de 60 ml equipada con una aguja de 18 G; mueva la direccionalidad de las llaves de paso de 3 vías para dirigir el flujo de líquido hacia la jeringa.
- Mueva las cámaras de biorreactor selladas y conectadas contiguamente con órganos instalados a una incubadora de cultivo de tejidos para equilibrar la temperatura y el gas. Ventile los pulmones usando una bomba de jeringa conectada a la cámara principal a ~1 "respiración" completa cada 2 min, y perfunde la vasculatura a través de la bomba peristáltica a aproximadamente 10 ml/min durante un total de ~30 min.
- Siembra de vías respiratorias
- Prepare suspensiones de células para sembrarlas en las vías respiratorias a la densidad celular deseada (el volumen dependerá del tamaño del órgano).
- Infle los pulmones con la suspensión celular inyectando suavemente a través del puerto de la jeringa conectado a la llave de paso de tres vías en el circuito de respiración.
- Mantener los pulmones estáticamente a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche sin vías respiratorias ni perfusión vascular para permitir que las células se adhieran a la matriz pulmonar descelularizada.
- Después de la incubación durante la noche, reinicie el programa estándar de ventilación de las vías respiratorias y cultive los órganos durante 3-7 días (u otra duración deseada).
- Siembra vascular
- Prepare suspensiones de cultivos de células endoteliales como se indicó anteriormente para la siembra de células de las vías respiratorias.
- Transfiera la suspensión celular al depósito de siembra endotelial que contiene una pequeña barra de agitación magnética.
- Cambie la direccionalidad de la trayectoria del flujo desde la cámara principal hasta el depósito de siembra endotelial girando la válvula en la llave de paso colocada en el tubo que conecta estos dos compartimentos, y siembre las células endoteliales gradualmente mientras agita suavemente con la bomba peristáltica.
- Cuando se complete la siembra (es decir, el volumen de suspensión de células endoteliales se agote en el depósito de siembra endotelial), detenga la perfusión e incube estáticamente durante ~ 4-6 horas. Reinicie la perfusión vascular con el medio de la cámara principal a una velocidad de ~ 10 ml / min (o la presión deseada si se monitorea).
- Cultivo durante 3-7 días con perfusión vascular continua.
3. Solución de problemas y enfoques alternativos
- Canulación traqueal: Se pueden usar suturas en lugar de una brida para mantener la cánula Luer en su lugar si la tráquea es demasiado pequeña. Una conexión Luer hembra de 1/4 de pulgada actúa como una cánula suficiente para una amplia gama de diámetros de tráquea.
- Extracción de sangre por perfusión de la arteria pulmonar: dado que los tejidos se recolectan de animales cadavéricos, los microtrombos son comunes e impiden que algunas áreas del lecho capilar pulmonar se eliminen por completo de la sangre residual. Sin embargo, durante la descelularización, estos pequeños vasos se vuelven permeables y los reactivos de descelularización lisan y degradan eficazmente estos coágulos. La perfusión predescelularización debe realizarse para eliminar la mayor cantidad de sangre posible, pero no es necesario eliminar todos los rastros de sangre del parénquima.
- Expulsión de líquidos de los pulmones: Los pulmones de los macacos conservan un fuerte retroceso natural ex vivo, incluso cuando están inflados con líquidos. Sin embargo, durante la descelularización, las células se lisan y liberan materiales (incluido el ADN) que aumentan la viscosidad de los fluidos instilados, lo que dificulta su expulsión. La incubación nocturna a 4 °C mientras se está sumergido en el líquido instilado suele ser suficiente para permitir que los pulmones expulsen completamente el líquido viscoso. Alternativamente, permita que se expulse la mayor cantidad de líquido posible de los pulmones y luego proceda con la instilación de las soluciones subsiguientes; La adición de detergentes y lavados con agua desionizada generalmente facilita la eliminación de los fluidos viscosos y permite que la descelularización proceda de manera eficiente.
- Adición de antibióticos a las soluciones detergentes: Los antibióticos y antimicóticos se pueden agregar a las soluciones de lavado con agua desionizada, así como a las soluciones detergentes; sin embargo, la penicilina/estreptomicina precipita en presencia de desoxicolato de sodio, y estos precipitados pueden interferir con los procesos de descelularización y lavado. Además, la presencia de antibióticos/antimicóticos no es necesaria durante la descelularización, ya que los detergentes utilizados en estas concentraciones son capaces de lisar y matar microbios. Después de la descelularización, el enjuague y el almacenamiento con solución de PBS (que contiene 5x penicilina/estreptomicina/anfotericina B) es suficiente para evitar la mayor parte de la contaminación.
- Eliminación de aire de la tubería del biorreactor: El aire se aspira de manera eficiente desde la tubería del biorreactor utilizando una jeringa con una aguja insertada en los puertos de la aguja en las llaves de paso de tres vías. Alternativamente, se puede enjuagar 1x PBS o medio de cultivo a través del tubo antes de instalar los órganos usando una jeringa conectada de la misma manera.
- Ventilación y perfusión de los pulmones durante y después de la recelularización: Si bien los caudales y tiempos indicados en este informe fueron suficientes para la unión celular, así como para la ventilación líquida de las vías respiratorias y la perfusión vascular, estos valores deben ser determinados empíricamente por el usuario. Los tiempos de cultivo también se pueden ajustar en función de las tasas de crecimiento de las células instiladas.
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Resultados
Los resultados mostrados a continuación representan experimentos independientes en los que los compartimentos de la vía aérea o vascular se sembraron con células madre mesenquimales derivadas de médula ósea de macaco rhesus o con células endoteliales microvasculares derivadas del pulmón de macaco rhesus, respectivamente, que fueron aisladas y caracterizadas como se describió previamente16-18.
Durante todo el proceso de descelularización, los pulmones de macaco mostraron un blanqueam...
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Discusión
Los tejidos pueden descelularizarse de manera eficiente y efectiva mediante una serie de métodos que emplean agentes físicos, químicos y enzimáticos12,20. Los desafíos de producir matrices biológicas 3D a partir de órganos grandes incluyen la necesidad de grandes volúmenes de soluciones de descelularización, equipos comerciales costosos (es decir , biorreactores) y una cantidad vertiginosa de perturbaciones metodológicas necesarias para lograr el producto final derivado del tejido. Nuestro método prop...
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los editores de Tissue Engineering por permitir que las imágenes de una publicación anterior se utilicen en este informe.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nitroprusiato de sodio | Sigma-Aldrich | 71778-25G | |
| Sal de heparina sódica | Fisher | BP2425 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Desoxicolato de sodio | Fisher | BP349-100 | |
| Cloruro de sodio | Fisher | 7647-14-5 | |
| DNasa pancreática bovina | Sigma-Aldrich | DN25 | Preparar caldo, alícuota y congelar |
| Sulfato de magnesio | Fisher | 10034-99-8 | |
| Cloruro de calcio | Fisher | C614-500 | |
| PBS (no Ca/Mg) | Gibco, Life Technologies | 10010-031 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Medios | |||
| Alfa MEM | Gibco Life Technologies | 12561-072 | |
| Medio 199 | Gibco Life Technologies | 11150067 | |
| Suero Fetal Bovino Premium | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| L-Glutamina 100x | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| Suplemento de Crecimiento de Células Endoteliales (ECGS) | ScienCell | 1052 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco Life Technologies | 15240062 | |
| Sembrado de células y cultivo de biorreactor Válvulas | |||
| de retención | Cole-Parmer | EW-98553-20 | |
| Conectores en Y | Cole-Parmer | ED-30614-08 | |
| Llaves de paso de 3 vías | Harvard Apparatus 721664 | ||
| MasterFlex L/S 14 tubos | Cole-Parmer | 96420-14 | |
| MasterFlex L/S 16 tubos | Cole-Parmer | 96420-16 | |
| Cerradura macho Luer 1/8 in | Cole-Parmer | EW-45505-04 | |
| Luer hembra 1/8 in | Cole-Parmer | SI-45502-04 | |
| Tapón de bloqueo Luer macho | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Puertos de inyección | Medi-Dose EPS | IV2004 | |
| Tubo de látex | St. Louis Medical Suppy | HN10910 | |
| Abrazadera de manguera | Cole-Parmer | EW-06832-02 | |
| 2 L Tarro de boca ancha | Fisher | 05-719-276 | |
| 60 ml Jeringas | Fisher | NC9035364 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
