En los últimos 15 años, los vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) han demostrado su eficacia para transducir células in vitro e in vivo y son ampliamente utilizados para la vacunación y la terapia génica. En este trabajo describimos un procedimiento para construir, producir y purificar vectores CAV2, dando lugar a suspensiones virales de alto título.
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Artículo de método
Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados
En este artículo
Resumen
Resumen
Los vectores derivados de adenovirus (Ad) se han utilizado ampliamente para la transferencia de genes a corto o largo plazo, tanto para aplicaciones de terapia génica como de vacunas. Debido a la frecuente inmunidad preexistente contra el adenovirus humano tipo 5 utilizado clásicamente, el adenovirus canino tipo 2 (CAV2) se ha propuesto como un vector alternativo para la transferencia de genes humanos. La biología bien caracterizada de CAV2, junto con su facilidad de manipulación genética, ofrece importantes ventajas, especialmente para la transferencia de genes al sistema nervioso central o para inducir una amplia gama de respuestas inmunitarias protectoras, desde la inmunidad humoral hasta la celular. Hoy en día, CAV2 representa uno de los adenovirus no humanos más atractivos para su uso como vector vacunal. Este protocolo describe un método simple para construir, producir y titular vectores CAV2 recombinantes. Después de clonar el casete de expresión del gen de interés en un plásmido lanzadera, el plásmido genómico recombinante se obtiene por recombinación homóloga en la cepa bacteriana E. coli BJ5183. A continuación, el plásmido genómico resultante se transfecta en células de riñón canino que expresan los genes CAV2-E1 complementarios (DK-E1). Una amplificación viral permite la producción de un gran stock viral, que se purifica por ultracentrifugación a través de gradientes de cloruro de cesio y se desala por diálisis. La suspensión viral resultante tiene habitualmente un título de más de 1010 partículas infecciosas por ml y puede administrarse directamente in vivo.
Introducción
En las últimas décadas, los vectores derivados de adenovirus (Ads) han demostrado su eficacia para la terapia génica y la vacunación, así como en la viroterapia oncolítica 1. Los ADS son virus icosaédricos sin envoltura de la familia Adenoviridae, que se han aislado de mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Desde su descubrimiento en 1953, los Ads se han estudiado intensamente como modelos para estudiar las interacciones virus/célula y, más recientemente, como sistemas de entrega de genes basados en vectores 2. De hecho, los vectores basados en anuncios ofrecen muchas ventajas, como su amplia gama de huéspedes y su biología bien ca....
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Protocolo
1. Construcción de un plásmido de genoma CAV2 no replicativo
Nota: todos los plásmidos descritos en este protocolo han sido descritos anteriormente7 y están disponibles bajo petición.
- Clonar el GOI en el plásmido pShuttle, utilizando las enzimas de restricción adecuadas, para generar pShuttle-GOI (Figura 1A).
- Resumen 2 μg de pShuttle-GOI de AscI/PacI. La digestión libera el fragmento Shuttle-GOI (~2,9 kbp + secuencia GOI ORF) de la columna vertebral del plásmido (2,8 kbp).
- Purifique el fragmento de Shuttle-GOI después de la electroforesis ....
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Resultados
La producción de vectores recombinantes de CAV2 depende de técnicas básicas pero importantes de biología molecular. Antes de producir los vectores virales, es necesario construir un genoma recombinante de CAV2 que contenga un casete de expresión para el transgén. Esta construcción implica dos pasos: primero, el gen de interés (GOI) se clona en un plásmido vehículo como un casete de expresión (es decir, con promotor y señal de poliadenilación). Este elemento funcional está flanqueado por dos secuencias genómicas .......
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Discusión
El método simple descrito en este documento, adaptado de la tecnología Ad5 bien documentada, permite la producción eficiente de vectores CAV2 no replicativos con una capacidad de clonación típica de ~ 4.2 kbp. En cuanto a las consideraciones de tiempo, un genoma CAV2 recombinante generalmente se genera en dos semanas, mientras que tomará 5 semanas adicionales amplificar, purificar y valorar las suspensiones virales.
Aunque la producción del primer lote de vectores derivados de CAV2 puede parec.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado financieramente por subvenciones del INSERM, el CNRS, la Fondation pour la Recherche Médicale y la Agence Nationale pour la Recherche (ANR- 10-Blanc-1322) a D.G-D; el Séptimo Programa Marco de la Comisión Europea para B.K.; M.S. fue apoyado por una beca postdoctoral del FRM (programa "Equipe FRM 2009"); C.B. contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la UE, bajo el acuerdo de subvención número 245266 (Orbivac).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Enzimas de restricción | New England Biolabs | Varios | |
| kit de transfección Jet Prime | Polyplus | 114-01 | |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 10567014 | |
| E. coli bacterias BJ5183 Columna | desalinización Agilent | 200154 | |
| PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| EmeraldAmp polimerasa | Takara | RR320A Kit de | |
| Macherey-Nagel | 740558.250 | ||
| NucleoSpin Gel y PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| tubos de 14 ml, Ultra Clear | Beckman | 344060 |
Referencias
- Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
- Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
- Zak, D. E., et al.
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Reimpresiones y permisos
