Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

Resumen

En los últimos 15 años, los vectores derivados del adenovirus canino tipo 2 (CAV2) han demostrado su eficacia para transducir células in vitro e in vivo y son ampliamente utilizados para la vacunación y la terapia génica. En este trabajo describimos un procedimiento para construir, producir y purificar vectores CAV2, dando lugar a suspensiones virales de alto título.

Resumen

Los vectores derivados de adenovirus (Ad) se han utilizado ampliamente para la transferencia de genes a corto o largo plazo, tanto para aplicaciones de terapia génica como de vacunas. Debido a la frecuente inmunidad preexistente contra el adenovirus humano tipo 5 utilizado clásicamente, el adenovirus canino tipo 2 (CAV2) se ha propuesto como un vector alternativo para la transferencia de genes humanos. La biología bien caracterizada de CAV2, junto con su facilidad de manipulación genética, ofrece importantes ventajas, especialmente para la transferencia de genes al sistema nervioso central o para inducir una amplia gama de respuestas inmunitarias protectoras, desde la inmunidad humoral hasta la celular. Hoy en día, CAV2 representa uno de los adenovirus no humanos más atractivos para su uso como vector vacunal. Este protocolo describe un método simple para construir, producir y titular vectores CAV2 recombinantes. Después de clonar el casete de expresión del gen de interés en un plásmido lanzadera, el plásmido genómico recombinante se obtiene por recombinación homóloga en la cepa bacteriana E. coli BJ5183. A continuación, el plásmido genómico resultante se transfecta en células de riñón canino que expresan los genes CAV2-E1 complementarios (DK-E1). Una amplificación viral permite la producción de un gran stock viral, que se purifica por ultracentrifugación a través de gradientes de cloruro de cesio y se desala por diálisis. La suspensión viral resultante tiene habitualmente un título de más de 10¹⁰ partículas infecciosas por ml y puede administrarse directamente in vivo.

Introducción

En las últimas décadas, los vectores derivados de adenovirus (Ads) han demostrado su eficacia para la terapia génica y la vacunación, así como en la viroterapia oncolítica ¹. Los ADS son virus icosaédricos sin envoltura de la familia Adenoviridae, que se han aislado de mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Desde su descubrimiento en 1953, los Ads se han estudiado intensamente como modelos para estudiar las interacciones virus/célula y, más recientemente, como sistemas de entrega de genes basados en ^{vectores 2}. De hecho, los vectores basados en anuncios ofrecen muchas ventajas, como su amplia gama de huéspedes y su biología bien caracterizada, junto con la facilidad con la que pueden manipularse y amplificarse genéticamente para la producción a gran escala.

Con el fin de superar las dificultades clínicas relacionadas con la inmunidad preexistente en las poblaciones humanas hacia los vectores derivados de los Ads ³ humanos, nosotros y otros comenzamos a derivar vectores de los Ads ⁴ no humanos. Además, los vectores adenovirales no humanos parecen estar más adaptados para la vacunación masiva en medicina veterinaria que el adenovirus tipo 5 (Ad5) de uso clásico, ya que deberían cumplir mejor los requisitos de seguridad y protección durante la evaluación de riesgos por parte de las autoridades reguladoras nacionales. A finales de la década de 1990, describimos el primer CAV2 recombinante como una alternativa no humana a los vectores derivados de Ad5 ⁵. Desde entonces, numerosos estudios han confirmado el potencial de los vectores CAV2 para la transferencia de genes terapéuticos o antigénicos (para revisiones ^6,7). Al igual que otros Ads, los vectores derivados de CAV2 son estables y se pueden producir a títulos altos, lo que facilita su uso in vivo. También son seguros, ya que no son integrativos, aunque permiten la expresión transgénica de larga duración in vivo (>1 año) ⁸. Sorprendentemente, y mejor que los serotipos Ads humanos, se ha demostrado que los vectores CAV2 son altamente neurotrópicos, con un transporte retrógrado muy eficiente en los axones ^9,10. Esta propiedad intrínseca trajo la idea de utilizar vectores CAV2 recombinantes para transducir neuronas de áreas específicas del cerebro que son difícilmente accesibles para los vectores lentivirales, hasta ahora comúnmente utilizados para la transferencia de genes al sistema nervioso central ¹¹.

Aquí, describimos un protocolo simple y clásico para construir, producir y purificar vectores CAV2 no replicativos derivados de la cepa de Manhattan. Los genomas recombinantes de CAV2 se construyen clonando el gen de interés deseado (GOI) en un casete aguas abajo del promotor temprano del citomegalovirus (CMV), que proporciona una expresión ubicua. Los vectores CAV2 tienen una capacidad de clonación de ~4,2 kbp, lo que permite expresar ADNc de gran tamaño. En un segundo paso, este casete de expresión se inserta por recombinación homóloga en lugar de la región E1 del genoma CAV2, lo que conduce a un virus no replicativo (dlE1), como lo describieron inicialmente Chartier et al. ¹² Finalmente, las partículas virales se producen tras la transfección del plásmido genómico en una línea celular de riñón canino que expresa CAV2-E1 (DK-E1) y se amplifican en serie antes de la concentración y purificación de las reservas virales. El método descrito aquí utiliza una ultracentrifugación de dos pasos en gradientes de cloruro de cesio (CsCl), lo que permite el enriquecimiento de partículas infecciosas con un título final alto (generalmente más de 10^{a 10} partículas infecciosas por ml). A continuación, la suspensión viral se desala por cromatografía a través de columnas desechables Sephadex G-25 para que, en última instancia, sea lo suficientemente pura como para ser utilizada directamente in vivo.

Protocolo

1. Construcción de un plásmido de genoma CAV2 no replicativo

Nota: todos los plásmidos descritos en este protocolo han sido descritos anteriormente⁷ y están disponibles bajo petición.

1. Clonar el GOI en el plásmido pShuttle, utilizando las enzimas de restricción adecuadas, para generar pShuttle-GOI (Figura 1A).
2. Resumen 2 μg de pShuttle-GOI de AscI/PacI. La digestión libera el fragmento Shuttle-GOI (~2,9 kbp + secuencia GOI ORF) de la columna vertebral del plásmido (2,8 kbp).
3. Purifique el fragmento de Shuttle-GOI después de la electroforesis en gel de agarosa, utilizando el gel NucleoSpin y el kit de limpieza PCR.
4. En paralelo, digiera 1 μg de plásmido genómico pCAV2 por SwaI. El plásmido pCAV2 contiene un sitio SwaI único ubicado dentro de la región E1 (Figura 1B). Inactivar por calor esta enzima de restricción a 65 °C durante 20 min.
5. Transforme la bacteria competente E. coli BJ5183 con 500 ng de fragmento Shuttle-GOI purificado y 100 ng de plásmido pCAV2 linealizado para recombinación homóloga (Figure 1B). Extienda en placas LB-Amp. Incubar las placas a 37 °C durante al menos 20 horas.
6. Realizar análisis de PCR directamente en colonias bacterianas utilizando la mezcla maestra EmeraldAmp con cebadores directos (5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') e inversos (5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'), en las siguientes condiciones de ciclo: 10 min a 95 °C (para un ciclo), 95 °C para 1 min; 58 °C para 1 min; 72 °C para 1 min/kbp (para 39 ciclos), y finalmente 5 min a 72 °C. Un producto de 1 kbp + secuencia GOI ORF se amplifica a partir de clones positivos para pCAV-GOI, mientras que ningún producto de PCR puede detectarse con clones negativos.
7. Inocular al menos dos colonias positivas durante la noche cada una en un medio LB-amp de 5 ml a 37 °C en un agitador (220 rpm).
8. Extraiga el ADN de los plásmidos utilizando el kit de plásmidos Nucleospin. Transforme la bacteria E. coli DH5α competente con una alícuota de cada preparación de ADN. Extienda la suspensión bacteriana en placas LB-Amp e incube durante la noche a 37 °C.
9. Inocular dos colonias de cada clon positivo durante la noche en 3 ml de medio LB-amp a 37 °C en un agitador (220 rpm). Extraiga el ADN plasmídico utilizando el kit de plásmidos Nucleospina.
10. Digiera el ADN resultante y el plásmido parental pCAV2 (como control) con NdeI. El patrón de restricción de pCAV2 primario es de 14,8 kbp, 9 kbp, 7,9 kbp y 1,6 kbp. El casete de expresión del GOI se inserta dentro del fragmento de 7,9 kbp y contiene al menos un emplazamiento NdeI, es decir, uno en el casete y los emplazamientos potenciales presentes en el GOI.
11. Seleccione las construcciones positivas y continúe con el paso 2 con al menos 2 clones independientes.

2. Transfección de plásmido del genoma CAV2 recombinante en células DK-E1

Nota: Los vectores no replicativos derivados de CAV2 son organismos genéticamente modificados clasificados como Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2), mientras que su uso en modelos animales se clasifica como BSL-1. Utilice las medidas adecuadas de contención y manejo de desechos, incluido el equipo de protección personal, y trabaje bajo campanas de flujo laminar BSL-2.

1. Un día antes de la transfección, siembre las células DK-E1 en una placa de 6 pocillos. Cultive células a 37 °C y 5% de CO₂, en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con alto contenido de glucosa, que contiene 7% de suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor, 1 mM de piruvato de sodio y 100 U/ml de penicilina/100 μg/ml de estreptomicina. Las células deben tener un 70-80% de confluentes para la transfección.
2. Digiera 2 μg de plásmido pCAV-GOI con AscI, para liberar la secuencia no viral del plásmido. Compruebe el patrón de restricción resultante mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. La digestión debe producir un fragmento de ~31 kbp que contenga el genoma recombinante y un fragmento de 2 kbp correspondiente a la columna vertebral del plásmido.
3. Mezcle el ADN digerido con 200 μl de tampón Jet Prime mediante vórtice durante 10 segundos. Agregue 4 μl de Jet Prime y mezcle mediante vórtice durante 10 segundos. Gire brevemente para eliminar las gotas e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Agregue la mezcla de transfección gota a gota sobre las celdas. Agite suavemente los platos para distribuir uniformemente la mezcla e incubar a 37 °C.

3. Propagación de CAV2 recombinante

1. Una semana después de la transfección, recoja las células y el medio de cultivo en un tubo de polipropileno de 15 ml. Interrumpa las células en tres ciclos de congelación-descongelación (-80 °C/37 °C) y limpie el lisado mediante centrifugación durante 10 min a 1.800 x g.
2. Recoja el sobrenadante y guárdelo a -20 °C para su posterior propagación del virus.
3. Infectar una monocapa confluente del 80-90% de células DK-E1 cultivadas en un pocillo de placa de 6 pocillos con 0,5 ml del sobrenadante que contiene el virus. Incubar a 37 °C durante 1 hora, bajo una agitación suave. Retire el inóculo y sustitúyalo por 1,5 ml de DMEM completo que contenga un 5% de FCS inactivado por calor.
4. Incubar las células a 37 °C durante 3-4 días. Las células deben ser monitoreadas diariamente para detectar la aparición de un efecto citopático (CPE, Figuras 2A-B). Si no se ve un CPE claro, recoja las células después de 4 días de cultivo y repita los pasos 3.1-3.4.
5. Cuando un CPE claro afecta a la mayoría de las células, generalmente después de 2-4 rondas de amplificación viral, recoja las células con medio de cultivo y congele-descongele 3 veces como se describe anteriormente. Infectar el 80-90% de las células DK-E1 confluentes cultivadas en tres placas de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro, utilizando cada vez 0,5 ml de sobrenadante que contiene virus.
6. Después de 3-4 días (cuando se complete el CPE), recoja las células de estas placas de 10 cm, vuelva a interrumpirlas mediante tres ciclos de congelación y descongelación, limpie el lisado por centrifugación durante 10 minutos a 1.800 x g, recoja el sobrenadante y almacene a -20 °C para la amplificación de CAV2 a gran escala.

4. Purificación CAV2 a gran escala

1. Infecta el 80-90% de las monocapas confluentes de células DK-E1 cultivadas en cuarenta placas de cultivo de tejidos de 10 cm de diámetro. Para cada plato, utilice 0,1 ml de sobrenadante que contenga virus diluido en 1 ml de DMEM completo sin FCS. Incubar las células a 37 °C durante 3 a 4 horas bajo una agitación suave. Añadir 5 ml de DMEM completo suplementado con FCS al 5%.
2. Incubar durante 3 días. Recoja las células infectadas de los cuarenta platos de 10 cm en tubos de polipropileno de 50 ml. Pellet cells a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C y resuspenderlos en 15 ml de medio DMEM.
3. Interrumpe las células en tres ciclos de congelación-descongelación (-80 °C/37 °C). Eliminar los restos celulares centrifugando a 1.800 x g durante 10 min y almacenar el sobrenadante a -20 °C antes de la purificación de las partículas virales.
4. Prepare un gradiente discontinuo de CsCl en un tubo Ultra-Clear de 14 ml. En primer lugar, vierta 2 ml de solución de CsCl (1,40 g/ml en solución salina tamponada con fosfato) en el fondo del tubo. A continuación, añadir lentamente 2 ml de solución de CsCl (1,25 g/ml en solución salina tamponada con fosfato) encima de la primera solución.
5. Cargue con cuidado el sobrenadante viral sobre el gradiente de CsCl. Llene el tubo con aceite mineral hasta 2-3 mm de la parte superior. Centrífuga durante 1,5 horas a 130.000 x g y 18 °C en un rotor SW40 oscilante.
6. Después de la centrifugación, dos bandas blancas son claramente visibles en la interfaz entre las 2 capas de solución de CsCl (Figura 2C). Con una aguja de 21 G y una jeringa, recoja mediante punción lateral la banda inferior que contiene partículas CAV2 maduras. Trate en la medida de lo posible de evitar recoger la banda superior, que corresponde a las partículas virales vacías.
7. Prepare un gradiente continuo de CsCl en un tubo transparente de 14 ml mezclando las partículas virales recogidas con una solución de CsCl (1,34 g/ml en solución salina tamponada con fosfato). Llene el tubo con aceite mineral hasta 2-3 mm de la parte superior. Centrífuga durante 18 horas a 130.000 x g y 18 °C en un rotor SW40 oscilante.
8. Después de la centrifugación, recoja la banda blanca que contiene CAV2 mediante una punción lateral con una jeringa como se describe anteriormente. Nuevamente, trate de evitar recoger la banda superior restante. Esto debería ser más fácil en este gradiente continuo, que separa mejor las dos bandas. El volumen total de la suspensión recogida no debe superar los 2 ml.
9. Equilibrar una columna Sephadex G-25 PD-10 con 30 ml de PBS.
10. Cargue la suspensión viral y deseche el flujo continuo.
11. Eluido con fracciones de 500 μl de PBS. Recoja las fracciones 5-7, que generalmente contienen las partículas CAV2 desaladoras. Las fracciones que contienen el virus se pueden identificar fácilmente porque son opalescentes. Añadir 150 μl de glicerol a los 1,5 ml de suspensión de CAV2 y almacenar en alícuotas a -80 °C.

5. Valoración de CAV2 por dilución de punto final

1. Descongele una alícuota de virus purificado en hielo y realice diluciones en serie de 10 veces (que van desde 10-2-10-12) en DMEM sin suero.
2. Agregue 50 μl de cada dilución viral en 5 pocillos de una placa de 96 pocillos. Agregue 1.5 x 10⁴ celdas DK-E1 en cada pocillo. Incubar la placa a 37 °C y 5% de_CO2 durante 5 días.
3. En el día 5 después de la infección, controle la apariencia de CPE mediante observación microscópica (Figuras 2A-B). Los títulos infecciosos se determinan como dosis infecciosas medias de cultivo de tejidos (TCID₅₀), utilizando el método estadístico de Reed y Muench¹³.

Resultados

La producción de vectores recombinantes de CAV2 depende de técnicas básicas pero importantes de biología molecular. Antes de producir los vectores virales, es necesario construir un genoma recombinante de CAV2 que contenga un casete de expresión para el transgén. Esta construcción implica dos pasos: primero, el gen de interés (GOI) se clona en un plásmido vehículo como un casete de expresión (es decir, con promotor y señal de poliadenilación). Este elemento funcional está flanqueado por dos secuencias genómicas ...

Discusión

El método simple descrito en este documento, adaptado de la tecnología Ad5 bien documentada, permite la producción eficiente de vectores CAV2 no replicativos con una capacidad de clonación típica de ~ 4.2 kbp. En cuanto a las consideraciones de tiempo, un genoma CAV2 recombinante generalmente se genera en dos semanas, mientras que tomará 5 semanas adicionales amplificar, purificar y valorar las suspensiones virales.

Aunque la producción del primer lote de vectores derivados de CAV2 puede parec...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Enzimas de restricción	New England Biolabs	Varios
kit de transfección Jet Prime	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli bacterias BJ5183 Columna	desalinización Agilent	200154
PD-10	GE Healthcare	17-0851-01
EmeraldAmp polimerasa	Takara	RR320A Kit de
	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin Gel y PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
tubos de 14 ml, Ultra Clear	Beckman	344060