La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Summary

Se describe aquí cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas, y proporcionar algunos consejos útiles. Esperamos que este documento ayudará a cada uno para evaluar el grado de acoplamiento celular debido a uniones gap funcionales. Todo lo descrito aquí podría ser, en principio, adaptado a otros colorantes fluorescentes con peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Abstract

Las uniones gap son canales intercelulares que permiten la comunicación de las células vecinas. Esta comunicación depende de la contribución de un hemicanal por cada célula vecina para formar la unión gap. En las células de mamíferos, el hemicanal está formado por seis conexinas, monómeros con cuatro dominios transmembrana y un terminal C y N dentro del citoplasma. Las uniones gap permiten el intercambio de iones, segundos mensajeros y metabolitos pequeños. Además, tienen un papel importante en muchas formas de comunicación celular dentro de los procesos fisiológicos, como la transmisión sináptica, la contracción del corazón, el crecimiento y la diferenciación celular. Detallamos cómo realizar una microinyección unicelular de Lucifer Yellow para visualizar la comunicación celular a través de uniones gap en células vivas. Se espera que en las uniones de brecha funcional, el tinte se difunda desde la celda cargada a las celdas conectadas. Es una técnica muy útil para estudiar las uniones gap ya que se puede evaluar la difusión de la fluorescencia en tiempo real. Discutimos cómo preparar las células y la micropipeta, cómo usar un micromanipulador e inyectar un colorante fluorescente de bajo peso molecular en una línea celular epitelial.

Introduction

Gap cruces son canales intercelulares que permiten la intercomunicación entre las células vecinas ^1. Esta comunicación se conecta dos o más células vecinas, donde cada uno contribuye con una conexón o hemicanal para formar el canal intercelular. En células de mamíferos, la conexón está formado por seis conexinas, monómeros con cuatro dominios transmembrana y una C y N terminal dentro del citoplasma ^2. Gap cruces no sólo permiten el flujo de iones, segundos mensajeros y pequeños metabolitos, sino que también contribuyen a muchas formas de comunicación celular en muchos procesos fisiológicos, tales como la transmisión sináptica, la contracción del corazón, el crecimiento y la diferenciación celular ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Además las uniones comunicantes se han asociado conmuchas enfermedades incluyendo el cáncer de ^{9, 10,} atrofia muscular ^11, algunas enfermedades genéticas y enfermedades desmielinizantes ^12.

Este tipo de diafonía intercelular se puede evaluar mediante varios métodos ^{13, 14, 15, 16.} En este artículo se muestra cómo realizar una microinyección de una sola célula de Lucifer amarillo para visualizar la comunicación celular a través de las uniones gap-en las células vivas. Se discute cómo preparar las células y la micropipeta, el uso de la micromanipulador y la inyección de un colorante amarillo Lucifer en una línea de células epiteliales del timo. Por lo general, este procedimiento experimental podría ser analizado por el promedio de células conectadas a la célula de carga con colorante. Además, este método podría ser utilizado con otros colorantes fluorescentes con peso molecular por debajo de la brechauniones de corte que es de aproximadamente 1.000 daltons.

Protocol

1. Preparación de las células

1. Mantener un cultivo de una línea celular epitelial del timo (IT76M1) o células a ensayar en una incubadora (37 ° C / 5% de CO _2).
2. Se lavan las células con PBS 1x (repetir este artículo 3x).
3. Añadir tripsina a las células durante 5 min.
4. Añadir medio (dos veces del volumen de tripsina añadida en el punto 1.3) con 10% de FBS (suero bovino fetal) a las células con tripsina y se centrifuga (800 x g durante 5 min).
5. Contar las células en un hemocitómetro.
6. Ajuste la densidad de células de acuerdo con el tipo de célula como las células tienen que estar en estrecho contacto entre sí para permitir el acoplamiento. Nota: En nuestro caso, hemos utilizado 3 x 10 ⁵ células por 35 mm placa de Petri.

2. Preparación Micropipeta

1. Tirar de la micropipeta como se especifica a partir de una micropipeta capilar de vidrio (1,5 mm de diámetro) a una final 0,2 micras de diámetro a fin de alcanzar una resistencia final de aproximadamente 30 mOf "> ^{17, 18.}
   NOTA: Como alternativa, las pipetas de inyección se pueden comprar. La resistencia depende del tamaño de célula, por ejemplo, sería necesario que las células acinares pancreáticas un microelectrodo de mayor resistencia, por ejemplo (100-150 mO) ^19. Un problema común que podría ocurrir es la precipitación de Lucifer Yellow solución que puede obstruir la micropipeta y puede requerir filtración o centrifugación antes. Antes de la inyección, la micropipeta debe ser analizado bajo el microscopio para detectar si hay una obstrucción o cualquier tipo de interrupción ^13. La micropipeta puede ser probada mediante la inyección de LY con la punta de la micropipeta en el interior de una solución salina.

3. Prueba de la Micropipeta

1. Preparar la solución de Amarillo Lucifer (5%) en 150 mmol / L LiCl y cargar la micropipeta utilizando una jeringa o por el relleno (poner en él LY Solution).
2. Coloque el micropipeTTE sobre el 35 mm placa de Petri con las células IT76M1 en la estación de trabajo microinyección y sumergir la punta de la micropipeta de vidrio en el medio celular. Centrarse en la micropipeta y realizar una prueba de tinte fluye mediante la aplicación de un pulso.

4. Una sola célula Amarillo Lucifer Microinyección

1. Enfocar el microscopio justo encima de la capa de células utilizando una alta fi cación Magni (40X), luego baje lentamente la pipeta a las células utilizando el micromanipulador.
2. Perfore la célula diana cuando la punta está lo suficientemente cerca como para tocar la membrana celular, y aplicar un pequeño pulso de hiperpolarización para introducir el LY en la célula. El voltaje aplicado dependerá de la carga neta del colorante a inyectar. Alternativamente, algunos otros tintes podrían ser utilizados con esta técnica, como se muestra en la Tabla 1.
   Nota: En principio cualquier colorante hidrófilo con MW inferior a 1 kDa podría ser utilizado. Sin embargo, la tasa de transferencia podría variar de acuerdo con el peso y de hidrofilicidad. Además, unspecific transferencia del colorante utilizado debe ser evaluado.
3. Capturar imágenes de células 3 min después de la inyección de tinte o hacer una pequeña película con microscopía de lapso de tiempo (30 fps).
   NOTA: Un enfoque similar podría ser visto en Hitomi et al (2015) ^20. Para evitar la comunicación por puentes intercelulares (mitosis incompleta), un co-inyección de dextrano rodamina (de 2 a 10 KDa), que no pasa a través de uniones sino que pasa a través de puentes intercelulares y ciertos tipos de nanotubos se recomienda como se muestra en la Figura 2 .

Results

Línea de células epiteliales del timo IT-76MI se utilizaron para evaluar tinte de acoplamiento por uniones comunicantes como se describen estas células para expresar uniones gap funcionales formados por conexinas 43 ^21. La Figura 1 muestra la inyección de Lucifer Yellow cuando se aplica en la célula debajo de la punta de la pipeta. Después de algunos minutos, las células se vuelven conectados fluorescente (asteriscos) que indica la difusión del colorante fluoresce...

Discussion

Con el fin de verificar la presencia de brecha de la salida intercelular funcional, el uso de trazadores, que son de la membrana impermeable, aunque permeable por canales intercelulares se requieren ^16. Fluoresceína, el primer tinte fluorescente para observar célula a célula de acoplamiento ^22, es permeable entre las membranas no de unión ³ y por lo tanto ha sido sustituido por Lucifer colorante amarillo ^15. En la actualidad,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifer amarillo	Sigma	L0259
Cloruro de litio	Sigma	L4408
PBS tabletas Sigma		P4417
RPMI	Sigma	R4130
Suero fetal bovino	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
mesa con aislamiento de vibraciones	Newport	VH3036W-OPT	Se necesita una mesa aislada de vibraciones para proteger los experimentos de las vibraciones y evitar daños en las células
Micromanipulador	Narishige	MMO-203	Este equipo permite ajustes de precisión de la micropipeta, que es necesaria para la microinyección de células.
Generador de corriente	Digitimer	DS2	Para producir el flujo de tinte a través de la micropipeta, se administró una corriente inferior a un nanoamperio utilizando un generador de corriente con un electrodo dentro de la micropipeta o un amplificador que tiene un circuito de compensación de capacitancia (electrómetro antiguo) o funciones de inyección de corriente de nuevos amplificadores de pinza de parche, y el cable de tierra sumergido en el plato de placa. Alternativamente, el tinte puede ser inyectado por un microinyector neumático, siguiendo las recomendaciones de fábrica.