Este estudio demuestra la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia in vivo sin la generación de teratomas. Utilizamos la inyección hidrodinámica de ADN plásmido en la vena de cola que codifica los factores Yamanka para inducir la reprogramación in vivo de hepatocitos adultos en células de mayor pluripotencia.
Artículo de método
En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka
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Resumen
Resumen
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) que resultan de la reprogramación de células somáticas a un estado pluripotente mediante la expresión forzada de factores definidos están ofreciendo nuevas oportunidades para la medicina regenerativa. Tales aplicaciones clínicas de las células iPS han sido limitadas hasta ahora, principalmente debido a la escasa eficiencia de las metodologías de reprogramación existentes y al riesgo de que las células iPS generadas formen tumores tras la implantación.
Planteamos la hipótesis de que la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia podría lograrse in vivo mediante la transferencia génica de factores de reprogramación. Con el fin de reprogramar eficientemente las células in vivo, es necesario expresar altos niveles de los factores de transcripción Yamanaka (OKSM) en el tejido diana. Esto se puede lograr mediante el uso de diferentes vectores genéticos virales o no virales dependiendo del tejido objetivo. En este estudio en particular, se utilizó la inyección hidrodinámica de ADN plasmídico en la vena de cola (HTV) para administrar los factores OKSM a los hepatocitos de ratón. Esto proporcionó una prueba de evidencia de la reprogramación in vivo de células somáticas adultas hacia un estado pluripotente con alta eficiencia y cinética rápida. Además, no se observó formación de tumores ni teratomas in situ.
Se puede concluir que la reprogramación de células somáticas in vivo puede ofrecer un enfoque potencial para inducir una mayor pluripotencia de forma rápida, eficiente y segura en comparación con los protocolos realizados in vitro y puede aplicarse a diferentes tipos de tejidos en el futuro.
Introducción
Las preocupaciones éticas sobre el uso de células madre embrionarias han sido una de las limitaciones en el desarrollo de la investigación con células madre. Sin embargo, el descubrimiento por parte de Yamanaka y sus colegas de que la expresión forzada de cuatro factores de transcripción (a saber: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) podría conducir a la reprogramación in vitro de células somáticas en células pluripotentes, llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS), ha abierto nuevas oportunidades. La transferencia de genes virales1-5 y no virales6-10, la translocación citoplasmática de proteínas11,12 y la transfección de miRNA13-16 se encuentran entre los diversos métodos utilizados hoy en día para generar células iPS. Sin embargo, estas metodologías de reprogramación adolecen de diversos problemas que están restringiendo su traslación a la clínica, tales como: a) severas limitaciones en la eficiencia de la reprogramación celular; b) el uso predominante de vectores virales; c) protocolos largos y de varias etapas de las condiciones de cultivo; y d) el riesgo de tumorigénesis por implantación de las células iPS generadas in vitro 17-20.
La transferencia génica de factores de transcripción definidos3-5 por retrovirus es el método más utilizado para reprogramar células somáticas. Sin embargo, contiene los riesgos derivados de la posibilidad de mutagénesis insercional, transducción estable y expresión de protooncogenes a largo plazo21,22. También se han explorado vectores de transferencia de genes no virales, como el ADN plasmídico6,7,23 o la administración de ARN10 mediante liposomas o electroporación. Si bien son más seguros en comparación con los virus, estos vectores ofrecen una eficiencia de transducción y reprogramación significativamente limitada24,25 .
Uno de los dogmas centrales de este campo emergente es que la implantación in vivo de células iPS conducirá a su diferenciación incontrolada y a la formación de una masa similar a un tumor (teratoma), compuesta por varios tejidos de las tres capas germinales diferentes. Por lo tanto, el concepto de reprogramación a pluripotencia se ha centrado principalmente en las manipulaciones in vitro de las células somáticas primarias extraídas (más comúnmente fibroblastos). Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, este principio adolece de largos y complejos protocolos de cultivo celular, que incluyen múltiples rondas de tratamiento (transferencia de genes, factores de crecimiento, antibióticos, antioxidantes) que pueden aumentar los riesgos de formación de teratomas u otras formas de tumorigénesis tras la implantación de las células24-28.
Proponemos que la reprogramación de células somáticas adultas in vivo por la sobreexpresión transitoria de los factores de transcripción OKSM no conduce a la formación posterior de teratomas29. El método para lograrlo dependerá de lograr altos niveles de expresión del factor de transcripción dentro del tejido diana de la manera más segura posible. En este estudio, seleccionamos una tecnología de transferencia de genes libre de virus establecida que ha demostrado dirigirse de manera eficiente al hígado para reprogramar las células a la pluripotencia in vivo. Esta tecnología implica la inyección hidrodinámica rápida y de gran volumen de ADN plasmídico de ADN plásmido30,31. Se pueden lograr altos niveles de expresión de genes transfectados en hepatocitos adultos siguiendo este método de transferencia de genes no virales. Además, esta tecnología minimiza los riesgos potenciales del uso de vectores virales (por ejemplo, inserción genómica permanente, mutagénesis insercional).
Protocolo
1. Reprogramación in vivo de tejido hepático por HTV Administración de ADNp
- Permita que los ratones hembra Balb/C, de 6 semanas de edad, se aclimaten a la instalación de animales durante una semana antes de realizar cualquier procedimiento.
- Preparar solución salina al 0,9% en agua destilada y filtrar a través de un microfiltro de 0,22 μm.
- Prepare una solución con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de ADN plasmídico pCX-cMyc en 1,5 ml de solución salina al 0,9% por ratón. nota: El volumen total de inyección debe estar entre el 8 y el 10% del peso corporal total.
Nota: antes de la inyección, mantenga los ratones en una cámara de calentamiento a 37 °C hasta que las venas de la cola puedan visualizarse fácilmente y parezcan dilatadas. - Inducir la anestesia con isoflurano antes (en la cámara de calentamiento) y durante la inyección (con una máscara anestésica).
- Administrar la solución de ADNp o el control salino con una jeringa de 27 G mediante inyección de HTV. Nota: para que la transfección sea exitosa, el volumen total debe inyectarse en no más de 5-7 segundos.
- Vigilar que los animales se recuperen adecuadamente de la inyección.
2. Perfusión hepática y aislamiento de hepactocitos primarios para estudios qRT-PCR
- En diferentes momentos, incluidos 2, 4, 8, 12 y 24 días después de la inyección de HTV, induzca anestesia profunda con isoflurano.
- Rocíe etanol al 70% en el abdomen del animal, haga una incisión a través de la piel en la línea media ventral con tijeras quirúrgicas y diseccione la capa muscular abdominal para exponer las vísceras.
- Corta el diafragma para exponer la cavidad torácica con unas tijeras y sujeta la vena cava con pinzas de bloqueo.
- Desplazar las vísceras hacia la derecha y los lóbulos hepáticos de forma que tanto la cava inferior como la vena porta sean fácilmente accesibles.
- Cánula de la vena cava inferior con un catéter de 22 G y cortar la vena porta para evitar el exceso de presión.
- Iniciar la perfusión con 10 ml de tampón HBSS (libre de Ca2+ y Mg2+, con bicarbonato), precalentado a 37 °C. Perfundir lentamente el tampón con una jeringa de 10 ml, hasta que el hígado se blanquee (3 min).
- Continuar la perfusión con Liver Digest Medium, precalentado a 37 °C, a un caudal de 0,6 ml/min (durante 15 min) hasta que el hígado se hinche y se afloje. nota: La digestión y perfusión excesivas pueden dañar los hepatocitos o las células reprogramadas.
- Continúe el experimento a 4 °C.
- Extraer el hígado con pinzas después de cortar los ligamentos falciformes y coronarios y lavarlo con Hepatocyte Wash Medium, mientras lo pasa por un colador de células de 100 μm para obtener una suspensión celular.
- Recoja la suspensión celular en tubos de 50 ml y ajuste el volumen a 15 ml con el medio de lavado de hepatocitos.
- Centrifugar la suspensión celular a 50 g durante 4 min. Mantener la temperatura a 4 °C. Deseche el sobrenadante (que contiene Kupffer y células epiteliales) y vuelva a suspender el pellet celular (que contiene los hepatocitos) en 10 ml de medio de lavado de hepatocitos. nota: El pellet celular debe resuspenderse con mucho cuidado, los hepatocitos son células muy frágiles.
- Repita el procedimiento de centrifugación un total de tres veces y vuelva a suspender el pellet final en 10 ml de medio de lavado de hepatocitos.
- Calcule el número de células utilizando un microscopio óptico y un hemocitómetro.
- Preparar alícuotas de 2 x 106 células, centrifugar a 300 x g para recuperar todas las células y desechar el sobrenadante.
- En este punto, el pellet celular puede congelarse y mantenerse a -20 °C hasta su posterior procesamiento o utilizarse inmediatamente para la extracción de ARN.
3. Estudio de la expresión génica de hepatocitos aislados para la regulación positiva de genes pluripotentes
- Extraiga el ARN de 2 x 106 células con un kit de columna de centrifugación siguiendo las instrucciones del proveedor.
- Utilice 1 μg del ARN extraído para realizar la qRT-PCR en dos pasos siguiendo las instrucciones del proveedor.
- Utilice los hepatocitos de los animales inyectados con solución salina como control para corregir la expresión génica relativa de los marcadores de reprogramación, pluripotencia y hepatocitos.
4. Análisis de citometría de flujo de pluripotencia mejorada a nivel de proteínas
- En los días 1 y 4 después de la inyección, realizar la perfusión hepática y aislar los hepatocitos primarios como se indicó anteriormente.
- Ajuste la densidad celular a 1 x 107 células/ml y prepare alícuotas de 100 μl.
- Fije las células con el tampón de fijación BD Cytofix y permeabilice con 1x tampón BD Perm/Wash.
- Incubar las células con OCT4-PerCP-Cy5.5 anti-ratón o Nanog-PE anti-ratón durante 30 minutos.
- Incluye controles negativos e isotipos.
- Analice las células teñidas con el citómetro de flujo de investigación de alto rendimiento CyAn ADP.
5. Inmunotinción de secciones hepáticas para marcadores de pluripotencia
- Cuatro días después de la inyección, perfundir el hígado como se indicó anteriormente, pero solo con tampón HBSS para eliminar la sangre del tejido hepático.
- Cortar un trozo de tejido hepático y sumergirlo en 2-metilbutano (preenfriado en nitrógeno líquido) para continuar con la criosección.
- Los tejidos congelados pueden mantenerse a -80 °C o cortarse directamente en secciones de 14 μm de espesor con un criostato.
- Secar al aire las secciones de papel durante 1 hora a temperatura ambiente y colocarlas posteriormente con metanol, preenfriadas a -20 °C durante 10 min. Secar al aire durante 15 min y luego lavar las secciones dos veces con PBS (5 min cada una).
- Incubar las secciones en tampón de bloqueo (5% de suero de cabra-0,1% Triton en PBS pH 7,3) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de dos pasos de lavado con tampón de lavado (1% BSA-0,1% Triton en PBS, pH 7,3).
- Incubar las secciones de tejido durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios anti-OCT4, anti-SOX2 y anti-Nanog.
- Al día siguiente, lavar las secciones 3 veces (5 min cada una) con tampón de lavado e incubarlas durante 1,5 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario.
- Lave las secciones de hígado con PBS (3 veces de 5 minutos cada una) y móntelas en un medio que contenga DAPI y antidecoloración.
- Visualice los portaobjetos bajo un microscopio de epifluorescencia.
6. Tinción de fosfatasa alcalina (ALP) de secciones de tejido hepático
- Obtener secciones de tejido hepático como se describió anteriormente.
- Calentar las secciones de tejido a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de realizar la tinción.
- Fijar con paraformaldehído al 4% durante 2 min. Nota: un tiempo de fijación excesivo puede disminuir la actividad de la fosfatasa alcalina.
- Secar las secciones al aire durante 30 min y luego incubar con sustrato líquido BCIP/NBT a 37 °C durante 30 min.
- Lave las correderas con agua destilada y móntelas con medios de montaje acuosos.
- Captura de imágenes aleatorias mediante microscopía óptica.
7. Cuantificación de los niveles de albúmina y enzimas hepáticas en suero para evaluar la toxicidad hepática
- En los días 4, 8, 12 y 120 después de la transfección, recoja 300 μl de sangre directamente del ventrículo cardíaco.
- Mantenga la sangre en hielo mientras se recogen las diferentes muestras para evitar la coagulación.
- Una vez que todas las muestras estén listas, incubar durante 30 minutos a 37 °C hasta que la sangre se coagule.
- Centrifugar las muestras a 2.000 x g durante 5 min.
- Pipetear cuidadosamente el suero (en el sobrenadante) en un nuevo tubo Eppendorf y congelar a -80 °C hasta el procesamiento de las muestras.
- Analice los niveles séricos de albúmina, ALT, AST, ALP y GLDH.
8. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y ácido peryódico-Schiff (PAS) de secciones hepáticas para evaluar la toxicidad hepática
- En diferentes momentos, incluidos 2, 4, 8, 12, 24, 50 y 120 días después de la inyección de HTV, realice la perfusión hepática con tampón HBSS solo como se describió anteriormente.
- Cortar un trozo de tejido hepático y fijarlo en paraformaldehído al 4%.
- Incrustar el tejido hepático en bloques de parafina, seccionar y teñir con tinción H&E o PAS.
- Captura de imágenes aleatorias mediante microscopía óptica.
Resultados
Figura 1 muestra una visión general del procedimiento que implica la transferencia génica de plásmidos que codifican OKSM al hígado de ratones y las diferentes técnicas realizadas para observar la reprogramación celular in vivo. Tras la inyección HTV de los plásmidos, se observó un aumento significativo en la expresión génica de los factores de reprogramación transfectados (Oct3/4, Sox2, Klf4 y cMyc) a nivel de ARNm el día 2 después de la inyección. La expresión de estos factores disminuye con el tiempo tras la inyección, como se muestra en la Figura 2a. En cuanto a la expresión de marcadores endógenos de pluripotencia (Nanog, Ecat1 y Rex1), sus niveles se incrementaron significativamente en comparación con los de hepatocitos de animales inyectados con solución salina los días 2 y 4 tras la inyección, y regresaron a los niveles basales a partir del día 8 (Figura 2b). Al mismo tiempo, se confirmó la desdiferenciación de la población de hepatocitos mediante la disminución de la expresión de genes específicos de hepatocitos (Alb, Aat y Trf), lo cual fue estadísticamente significativo el día 4 y alcanzó niveles basales a partir del día 8 (Figura 2d).
La expresión de Oct3/4 y Nanog a nivel proteico se investigó mediante citometría de flujo. Como se muestra en Figura 2c, solo Oct3/4 se expresa en el día 1 después de la inyección de HTV, mientras que para la expresión del marcador endógeno de pluripotencia Nanog fue necesario esperar hasta el día 4.
La ocurrencia de la reprogramación celular in vivo se confirmó además mediante análisis inmunohistoquímico de tejidos hepáticos con anticuerpos anti-OCT4, anti-SOX2 y anti-Nanog y mediante tinción específica para la actividad de fosfatasa alcalina (ALP). Células positivas para todos los marcadores y para la actividad enzimática se encuentran de manera reproducible en los tejidos hepáticos de animales inyectados con OKSM, pero no en los controles inyectados con solución salina (Figura 3).
Los posibles efectos secundarios de toxicidad y la formación de teratomas derivados de la reprogramación celular in vivo mediante la inyección de pDNA con HTV se investigaron mediante la cuantificación de los niveles de enzimas hepáticas en suero, así como con tinciones de H&E y PAS de secciones de tejido hepático durante un período de 120 días. Se observaron signos transitorios y no graves de daño tisular hasta el día 2, pero no más allá. No se observó formación de teratomas ni ningún signo de displasia o alteraciones morfológicas durante el período de estudio (Figura 4). No hubo anomalías estructurales ni funcionales hepáticas a lo largo del estudio en ninguno de los animales, lo cual fue confirmado por los niveles de albúmina y enzimas hepáticas, así como por la tinción de glucógeno en secciones de tejido (Figuras 4b y c).
Figura 1. Resumen esquemático del procedimiento de reprogramación in vivo y su análisis. El protocolo comprende dos etapas principales: (i) administración de factores de reprogramación in vivo y (ii) extracción del tejido y análisis de muestras. Haga clic aquí para ver la figura ampliada.
Figura 2. Sobreexpresión in vivo de los factores de transcripción de Yamanaka en hígado de ratón adulto. Se inyectaron ratones Balb/C mediante HTV con solo 0,9 % de solución salina, o con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de pCX-cMyc en solución salina al 0,9 %, y en los días 2, 4, 8, 12 y 24 se realizó un análisis mediante RT-qPCR de hepatocitos para determinar la expresión génica relativa de: (a) factores de transcripción transfectados (OKSM) y (b) marcadores endógenos de pluripotencia; (c) análisis mediante citometría de flujo de células positivas para OCT3/4 y positivas para Nanog; (d) expresión génica relativa de marcadores de hepatocitos determinada mediante RT-qPCR. Todos los niveles de expresión génica se normalizaron respecto al grupo inyectado con solución salina mediante HTV. (* p<0,05 indica diferencia estadísticamente significativa en comparación con los grupos inyectados con solución salina mediante HTV, obtenida mediante análisis de varianza y comparación por pares de Tukey). Figura adaptada de Yilmazer et al.29 Haga clic aquí para ver la figura ampliada.
Figura 3. Reprogramación celular in vivo en tejido hepático de ratón adulto mediante inmunohistoquímica. Ratones Balb/C inyectados mediante HTV únicamente con solución salina al 0,9 %, o con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de pCX-cMyc en solución salina al 0,9 %. En el día 4, se recolectaron los hígados y se cortaron secciones de tejido congelado que se tiñeron con anticuerpos anti-OCT4, anti-SOX2 o anti-Nanog para evaluar la inmunorreactividad, o con BCIP/NBT para determinar la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) en el tejido (40X). Las barras de escala representan 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 Haga clic aquí para ver la figura ampliada.
Figura 4. El efecto de la reprogramación celular in vivo sobre la funcionalidad hepática y la histopatología. Ratones Balb/C inyectados mediante HTV con 75 μg de pCX-OKS-2A y 75 μg de pCX-cMyc en solución salina al 0,9 % o solo solución salina al 0,9 %. En los días 2, 4, 8, 12, 50 y 120 se aislaron y procesaron tejidos hepáticos y sueros para: (a) tinción con H&E; (b) niveles de enzimas hepáticas; (c) niveles de albúmina; (d) tinción con PAS. Se obtuvieron imágenes representativas mediante microscopía óptica (10X). Las barras de escala representan 100 μm. Figura adaptada de Yilmazer et al.29 Haga clic aquí para ver la figura ampliada.
Discusión
Este estudio proporciona evidencia de prueba de principio de reprogramación celular in vivo hacia la pluripotencia después de la transferencia eficiente y la sobreexpresión de los factores OKSM al hígado de ratón adulto. Con la ayuda de diferentes técnicas como qRT-PCR, citometría de flujo, IHQ o análisis de suero, se investigó el tejido diana para observar la reprogramación celular in vivo . Muy rápidamente desde la inducción de la sobreexpresión del factor OKSM en el tejido, los marcadores de pluripotencia se regularon al alza a nivel de ARNm y proteína (dentro de las 48 horas). A lo largo de estos experimentos, se demostró que entre el 5 y el 15% de las células extraídas del tejido eran positivas para Nanog y Oct3/4. Además, no se observaron anomalías estructurales o funcionales en el hígado a lo largo de 120 días. La expresión de transgenes por inyección HTV de ADN plasmídico en tejidos distintos del hígado (pulmón, bazo, riñón y corazón) se ha descrito previamente, sin embargo, los niveles de expresión génica fueron al menos 3 órdenes de magnitud más bajos que los de los hepatocitos30. Los datos de este estudio indican que la reprogramación de células somáticas hacia un estado pluripotente in vivo es segura, rápida y eficiente. En vista de la mayoría de las metodologías de reprogramación celular in vitro existentes que generalmente logran la generación de células pluripotentes (iPS) en 3 semanas con menos del 1% de eficiencia32, la reprogramación in vivo a pluripotencia puede ofrecer alternativas muy interesantes. Nuestra hipótesis es que el concepto de reprogramación in vivo a pluripotencia podría aplicarse a varios tipos de células somáticas con alta eficiencia (dependiendo del vector utilizado), sin embargo, será necesario determinar el nivel de pluripotencia funcional alcanzado en las células reprogramadas in vivo . Además, con el desarrollo de protocolos y tecnologías mejorados, las células reprogramadas in vivo podrían extraerse y utilizarse con fines de medicina regenerativa.
Hay algunos pasos críticos a seguir para reprogramar células somáticas adultas in vivo con alta eficiencia. Lograr altos niveles de expresión génica en el tejido diana es un requisito previo. En este estudio, esto se ilustró utilizando la transferencia y expresión eficientes de ADN plasmídico a los hepatocitos mediante inyección de HTV. Los factores más importantes para la inyección de HTV son el volumen, que debe estar entre el 8 y el 10% del peso corporal total del animal, y la velocidad de inyección, que debe realizarse en 5-7 segundos. No se deben usar ratones menores de 6 semanas, ya que la inyección de HTV puede causar más daño tisular en el hígado, lo que puede afectar la eficiencia de la reprogramación celular. El fondo genético de los animales no tuvo ningún impacto en la determinación de la eficiencia de la reprogramación in vivo , ya que hemos informado previamente niveles similares de reprogramación en ratones Balb/C y TNG-A, siendo este último una cepa transgénica que lleva el reportero eGFP insertado en el locus Nanog y se cría en el fondo Sv12929.
Especulamos que la reprogramación celular in vivo a un estado pluripotente (que deberá determinarse) se puede aplicar a otros tipos de tejidos siempre que los factores OKSM se entreguen de manera eficiente a las células diana, lo que permite altos niveles de expresión génica. Se han estudiado una variedad de vectores de administración de genes virales y no virales en ensayos preclínicos y clínicos para dirigirse a diferentes tipos de células y tejidos33. Por ejemplo, para los tejidos neurales u oculares, los virus adenoasociados han sido la opción de vector preferida para una transferencia eficiente de genes in vivo 34-37, mientras que en el tejido muscular se ha demostrado que las inyecciones de ADN plasmídico desnudo dan como resultado niveles relativamente altos de expresión génica38,39. Por lo tanto, el método del vector de transferencia de genes debe seleccionarse cuidadosamente según el tipo de tejido para lograr una reprogramación celular in vivo eficiente y rápida hacia un estado pluripotente.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Consejo de Investigación de Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC, Swindon, Reino Unido) y los programas FP-7 de la Comisión Europea NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) y ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY contó con el apoyo de una beca de doctorado a tiempo completo del Ministerio de Educación (Turquía) e IL reconoce el apoyo parcial del British Council y la Fundación CAIXA (España). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pCX-OKS-2A ADNp | Addgene | 19771 | Obtenido de Addgene como puñalada bacteriana, producción de plásmidos realizada en Plasmid Factory (Alemania) |
| pCX-cMyc | Addgene | 19772 | Obtenido de Addgene como puñalada bacteriana, producción de plásmidos realizada en Plasmid Factory (Alemania) |
| 0.22 μ m filtro | Milliopore | SLGP033RS | |
| Isoflurano | Abbott | B505 | |
| Tampón HBSS | Sigma-Aldrich | H6648 | Ca2+ y Mg2+ libre, con bicarbonato |
| Medio de digestión hepática | Gibco | 17703-034 | |
| Medio de lavado de hepatocitos | Gibco | 17704-024 | |
| 100 & mu; m filtro de células | BD Biosciences | 352360 | |
| Kit de ARN de nucleospina II | Macherey-Nagel | 740955.25 | Kit para el aislamiento de ARN de células y tejidos |
| iScript kit de síntesis de ADNc | Bio-Rad | 170-8890 | |
| iO SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 170-8880 | |
| Oct3/4 cebador directo | Secuencia Sigma | dada en comentarios | TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA |
| Oct3/4 cebador inverso | Secuencia Sigma | dada en los comentarios | CTCAATGCTAGTTCCTCTCTCTCTTC |
| Sox2 cebador delantero Secuencia | Sigma | dada en los comentarios | GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG |
| Sox2 cebador inverso | Secuencia Sigma | dada en los comentarios | TCACATGTGCGACAGGGGCAG |
| C-myc cebador directo | Sigma | dada en los comentarios | CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC |
| C-myc cebador inverso | Sigma | secuencia dada en comentarios | TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG |
| Nanog cebador directo | Sigma | secuencia dada en comentarios | CAGAAAAACCAGTGGGGGAAGACTAG |
| Nanog cebador inverso | Sigma | secuencia dada en comentarios | GCAATGGATGCTGGGATACTC |
| Ecat1 cebador directo | Sigma | dado en los comentarios | TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT |
| Ecat1 cebador inverso | Secuencia Sigma | dada en los comentarios | ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT |
| Rex1 cebador directo | Sigma | secuencia dada en los comentarios | ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA |
| Rex1 cebador inverso | Sigma | secuencia dada en los comentarios | TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT |
| Alb cebador delantero | Sigma | secuencia dada en los comentarios | GTTCGCTACACCCAGAAAGC |
| Alb cebador inverso | Sigma | secuencia dada en los comentarios | CCACACAAGGCAGTCTCTGA |
| Aat cebador directo | Sigma | secuencia dada en los comentarios | CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG |
| Aat cebador inverso | Sigma | secuencia dada en los comentarios | ATGGACAGTCTGGAAGTG |
| Trf cebador delantero | Sigma | secuencia dada en los comentarios | ACCATGTTGTGGTCTCACGA |
| Trf cebador inverso | Sigma | secuencia dada en los comentarios | ACAGAAGGTCCTTGGTGTGTG |
| B cebador directo | Sigma | secuencia dada en los comentarios | GACCTCTATGCCAACACAGT |
| B cebador inverso de actina | Sigma | dada en los comentarios | AGTACTTGCGCTCAGGAGGA |
| BD Tampón de fijación Cytofix | BD Biosciences | ||
| 1x BD Tampón Perm/Wash | BD Biosciences | 560585 | |
| anti-ratón OCT4-PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560585 | |
| anti-ratón Nanog-PE | BD Biosciences | 560585 | |
| 2-Metilbutano | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| X100-Triton | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Suero de cabra | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| conejo pAb anti-OCT4 | Abcam | ab19857 | Uso en una concentración de 3 μ g/ml |
| conejo pAb anti-SOX2 | Abcam | ab97959 | Usar a una concentración de 1 μ g/ml |
| pAb de conejo anti-Nanog | Abcam | ab80892 | Uso a una concentración de 1 μ g/ml |
| mAb de ratón anti-SSEA1 | Abcam | ab16285 | Utilizar a una concentración de 20 μ g/ml |
| IgG anti-conejo con pAb de cabra marcado con Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 111-165-003-JIR: | Úselo a una concentración de 1/250 |
| IgG anti-ratón pAb de cabra marcado con Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-165-003-JIR | Úselo a una concentración de 1/250 |
| Medio de montaje VECTASHIELD con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| BCIP/NBT sistema de sustrato líquido | Sigma | B1911 | |
| Medio de montaje acuoso | Sigma | ||
| 16% La solución madre de paraformaldehído Fisher | AA433689M | es del 16%, úsela al 4% | |
| Hematoxilina y eosina | Sigma | GH53/HT110216 | |
| Tinción PAS | Sigma | 395B |
Referencias
- Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
- Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
- Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
- Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
- Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
- Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
- Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
- Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
- Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
- Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
- Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
- Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
- Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
- Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
- Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
- Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
- Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
- Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
- Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
- Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
- Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
- Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).
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