El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

Resumen

Conformación de la proteína y la dinámica son claves para entender la relación entre estructura y función de proteínas. Intercambio de hidrógeno acoplada a espectrometría de masas de alta resolución es un método versátil para estudiar la dinámica conformacionales de proteínas, así como la caracterización de la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluidas las interfaces de contacto y los efectos alostéricos.

Resumen

Todos los procesos celulares dependen de la funcionalidad de las proteínas. Aunque la funcionalidad de una proteína dada es la consecuencia directa de su secuencia de aminoácidos única, que sólo se realiza por el plegamiento de la cadena de polipéptido en una única disposición tridimensional definido o más comúnmente en un conjunto de conformaciones interconverting. La investigación de la relación entre la conformación de la proteína y su función es, por tanto, esencial para una comprensión completa de cómo las proteínas son capaces de cumplir con su gran variedad de tareas. Una posibilidad para estudiar los cambios conformacionales una proteína experimenta mientras avanza a través de su ciclo funcional es hidrógeno ^H-1/2 H-intercambio en combinación con espectrometría de masas de alta resolución (HX-MS). HX-EM es un método versátil y robusta que añade una nueva dimensión a la información estructural obtenida por ejemplo, cristalografía. Se utiliza para estudiar el plegamiento de proteínas y el despliegue, la unión de pequeña molligandos ecule, las interacciones proteína-proteína, cambios conformacionales ligados a la catálisis enzimática y allostery. Además, HX-MS se utiliza a menudo cuando la cantidad de proteína es muy limitada o la cristalización de la proteína no es factible. Aquí les ofrecemos un protocolo general para el estudio de la dinámica de proteínas con HX-MS y describimos como un ejemplo de cómo mostrar la interfaz de interacción de dos proteínas en un complejo.

Introducción

El número de estructuras cristalinas de proteínas y complejos de proteínas aumentó rápidamente en los últimos años. Presentan instantáneas invaluables de la organización estructural de estas proteínas y proporcionan una base para el análisis de la estructura-función. Sin embargo, la dinámica de las proteínas y los cambios conformacionales, que son esenciales para sus funciones, rara vez se revelaron mediante cristalografía de rayos X. Cryo-microscopia electrónica, por otro lado, es capaz de capturar complejos de proteínas y de proteínas en diferentes conformaciones, pero en general no puede resolver cambios conformacionales a nivel de la estructura secundaria ^1.....

Protocolo

1. Preparación de disoluciones y Proteína muestras

1. Preparar H ₂ O buffer. Tampón estándar Uso Hsp90 (40 mM de HEPES / KOH, pH 7,5, KCl 50 mM, _MgCl2 5 mM, glicerol al 10%) como H ₂ O tampón.
   Nota: Si la muestra se dializó antes del análisis, utilizar el tampón de diálisis como H ₂ O tampón. Es esencial que la junta tampón D ₂ difiere de la H ₂ O tampón sólo en el isótopo de hidrógeno. Tampones volátiles como NH ₄ CO ₃ o NH ₄ componentes de acetato o de amortiguamiento no son adecuados!
2. Preparar _D2O tampón de liofili....

Resultados

Hsp90 es una chaperona molecular en levaduras y miembro de la familia Hsp90 chaperón. Al pasar por un ciclo complejo ATPasa asiste pasos plegables finales de muchos clientes de proteína. De plegado eficiente requiere transferencia de clientes de Hsp70 y la interacción del Sti1/Hop co-chaperona. Sti1 se une directamente a la Hsp90 y facilita cliente de unión por inhibición de la actividad ATPasa de la Hsp90. La interacción de Hsp90 con Sti1 se estudió recientemente usando HX-MS ^23. Aquí presentamos los resulta.......

Discusión

La unión de una pareja de interacción de una proteína inevitablemente provoca cambios en la accesibilidad de disolvente en el sitio de unión. Además, muchas proteínas sufren cambios conformacionales a vinculantes dinámicos, que afectan a otras regiones de la interfaz de unión real. HX-MS es un método robusto para monitorear estos cambios y es incluso capaz de revelar los cambios conformacionales en proteínas en escalas de tiempo que otros métodos no pueden cubrir.

Para llevar a cabo con éxit.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
Válvula de 6 puertos EPC6W con actuador microeléctrico	Valco	#EPC6W
Válvula de inyección (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 medios	Biosystems Aplicados	#1-6029-06
Poros R2	Biosistemas Aplicados	#1-1118-02
Pepsina	Sigma	#P6887	use pepsina fresca
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubos (varios diámetros)	Accesorios IDEX
	IDEX	#PK-110 con PK-100