Artículo de método

Uso de Caenorhabditis elegans como sistema modelo para estudiar la homeostasis de proteínas en un organismo multicelular

DOI:

10.3791/50840

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18 de diciembre de 2013

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1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para estudiar la relación entre la homeostasis de las proteínas, el estrés y el envejecimiento, monitoreamos los cambios en el plegamiento de las proteínas siguiendo la disfunción de las proteínas, la localización de las proteínas en la célula y la estabilidad de las proteínas a nivel de organismo, celular y proteína, utilizando el metazoo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans como sistema modelo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El plegamiento y ensamblaje de las proteínas es esencial para la función de las proteínas, la salud a largo plazo de la célula y la longevidad del organismo. Históricamente, la función y regulación del plegamiento de proteínas se ha estudiado in vitro, en células aisladas de cultivo de tejidos y en organismos unicelulares. Estudios recientes han descubierto vínculos entre la homeostasis de las proteínas (proteostasis), el metabolismo, el desarrollo, el envejecimiento y la detección de la temperatura. Estos hallazgos han llevado al desarrollo de nuevas herramientas para monitorear el plegamiento de proteínas en el organismo metazoario modelo Caenorhabditis elegans. En nuestro laboratorio, combinamos ensayos de comportamiento, imágenes y enfoques bioquímicos utilizando proteínas metaestables sensibles a la temperatura o que se producen naturalmente como sensores del entorno de plegamiento para monitorear el plegamiento incorrecto de las proteínas. Los ensayos conductuales que se asocian con el plegamiento incorrecto de una proteína específica proporcionan una lectura simple y poderosa para el plegamiento de proteínas, lo que permite la detección rápida de genes y condiciones que modulan el plegamiento. Del mismo modo, dicho mal plegamiento puede estar asociado con la mala localización de proteínas en la célula. Por lo tanto, el seguimiento de la localización de proteínas puede poner de manifiesto los cambios en la capacidad de plegamiento celular que se producen en diferentes tejidos, en diversas etapas de desarrollo y frente a condiciones cambiantes. Por último, utilizando herramientas bioquímicas ex vivo, podemos monitorizar directamente la estabilidad y conformación de las proteínas. Por lo tanto, mediante la combinación de ensayos de comportamiento, imágenes y técnicas bioquímicas, podemos monitorear el mal plegamiento de proteínas a la resolución del organismo, la célula y la proteína, respectivamente.

Introducción

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La interacción de los diversos pasos de la biosíntesis de proteínas, como la transcripción, el procesamiento y la traducción del ARNm, así como el plegamiento, la translocación y el ensamblaje/desensamblaje de proteínas, determina la carga de proteínas metaestables que dependen de los mecanismos de control de calidad de las proteínas celulares para su función1. La ausencia o mal funcionamiento de los mecanismos de control de calidad de las proteínas puede, por lo tanto, resultar en el deterioro funcional de diversos tipos de maquinarias celulares y en la aparición de enfermedades de mal plegamiento de proteínas2-7. Cuando la capacidad de las maquinarias de plegamiento y eliminación de proteínas se equilibra con la carga de proteínas metaestables, se logra la homeostasis de las proteínas (proteostasis), un estado que en última instancia evita la acumulación de proteínas mal plegadas y la agregación dentro de las células6. Se cree que la acumulación de proteínas mal plegadas es la señal que activa los factores de transcripción inducibles por estrés, como el factor de choque térmico (HSF-1), y da lugar a la activación de respuestas citoprotectoras al estrés6,8.

Nuestra comprensión de las funciones de las redes de proteostasis en los metazoos se ha derivado principalmente de estudios de reconstitución in vitro y de observaciones realizadas con células de cultivo de tejidos y organismos unicelulares9. Por ejemplo, la investigación sobre las chaperonas moleculares que previenen y resuelven el daño de las proteínas se ha centrado en estudios bioquímicos y biológicos celulares de los mecanismos de plegamiento, desagregación y translocación de proteínas mediadas por chaperonas10-13. En comparación, solo se dispone de información limitada sobre la función integrada de varios componentes de la proteostasis en las diferentes células y tejidos de los metazoos en condiciones de crecimiento "normales" y en respuesta al estrés11. El descubrimiento de que en C. elegans, el control de la calidad de las proteínas celulares también puede ser regulado por las células de forma no autónoma, como se refleja en los experimentos que muestran que las mutaciones en las dos neuronas que perciben la temperatura pueden bloquear la activación de la respuesta de choque térmico y reducir la termotolerancia, demostró la necesidad de estudiar la regulación de la proteostasis en organismos pluricelulares14-17. Lo que falta, sin embargo, es una imagen cohesiva de cómo funcionan las redes de proteostasis, como las diversas familias de chaperonas moleculares, en los tejidos de un metazoo intacto y qué tan dinámicas son estas redes durante el desarrollo y el envejecimiento. Para cumplir este objetivo, se necesitan sensores fiables para monitorizar el mantenimiento del proteoma en animales vivos con el fin de determinar la capacidad proteostática de diferentes células de un organismo multicelular durante el curso del desarrollo y el envejecimiento.

Para que una proteína dada funcione como un sensor de proteostasis celular, debe responder a los cambios en el entorno de plegamiento celular mientras interfiere mínimamente con el plegamiento de proteínas no relacionadas en la célula. Para explorar el mantenimiento y la recuperación de la proteostasis celular en un organismo vivo, se pueden adoptar dos enfoques complementarios que dependen de los sensores de plegamiento. El primero se basa en sensores de plegamiento diseñados, basados en proteínas metaestables identificadas experimentalmente que se sabe que dependen de la maquinaria de proteostasis, como la luciferasa de luciérnaga18-20 o GFP marcada con un degron21-24. En el segundo enfoque, se rastrean las proteínas metaestables endógenas, como las proteínas agregantes sensibles a la temperatura o dependientes de la edad que responden a cambios incrementales en el entorno celular25-27. Los sensores plegables diseñados no cumplen ninguna función biológica esencial, pero ofrecen la ventaja de ser detectables mediante potentes ensayos de notificación, como las proteínas marcadas con GFP, y pueden emplearse con muchos modelos celulares y animales diferentes18. Sin embargo, debido a que la introducción de una sola proteína extraña puede afectar el entorno de plegamiento27, tales polipéptidos pueden sobrecargar la maquinaria de proteostasis celular. Alternativamente, los sensores de plegamiento diseñados que no son nativos de la célula sobre la que informan pueden no verse afectados por los cambios en la capacidad de proteostasis de la célula. Por ejemplo, un sustrato reportero de proteasoma marcado con GFP requirió que ~90% del proteasoma fuera inhibido antes de que se pudiera detectar un fenotipo23. Por el contrario, las proteínas metaestables endógenas que dependen de los mecanismos de proteostasis de la célula ofrecen la ventaja de estar dentro del rango de sensibilidad celular. Sin embargo, la pérdida de función asociada con el mal plegamiento de dichas proteínas también puede afectar la función celular y la viabilidad del organismo. Aquí, nos centraremos en el uso de sensores de plegamiento endógenos de C. elegans.

C. elegans es un modelo de metazoos bien establecido para el estudio tanto del desarrollo como del envejecimiento que utiliza muchas vías biológicas conservadas y se puede utilizar para seguir el plegamiento de proteínas en la célula, utilizando una combinación de biología celular, enfoques bioquímicos y genéticos. Empleamos proteínas metaestables como sondas de capacidad proteostática mediante el seguimiento de cambios en su fenotipo, localización y estabilidad. Además, se puede estudiar una variedad de funciones de proteínas mediante un simple análisis del comportamiento. Del mismo modo, se produce una mala localización sustancial de las proteínas cuando las redes de control de calidad de las proteínas celulares no se ajustan a las demandas celulares. Las proteínas se pueden visualizar fácilmente en células de animales vivos utilizando proteínas marcadas con fluorescencia o mediante inmunotinción. Por último, utilizando métodos ex vivo, es posible monitorizar la expresión y la estabilidad de las proteínas. Esto permite un cribado rápido y sencillo de los cambios conductuales y fisiológicos, junto con un análisis en profundidad de la localización y la estabilidad de las proteínas, lo que permite el seguimiento de los modificadores de la proteostasis. Al combinar estos diferentes métodos, se puede obtener una visión amplia del entorno de plegamiento de proteínas de una célula. De hecho, esta estrategia se ha utilizado con éxito para monitorear la perturbación de la proteostasis en C. elegans, levaduras, cultivos de tejidos y bacterias15,25-35.

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Protocolo

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Uso de ensayos de comportamiento para monitorear el plegamiento de proteínas en un organismo vivo

1. Sincronización de animales para ensayos de comportamiento

  1. Siga los métodos estándar para el mantenimiento de C. elegans36, incluida la preparación de medios y placas, la preparación de alimentos y las condiciones de crecimiento del animal. Controle cuidadosamente las condiciones de cultivo, incluida la temperatura (15-25 °C), el tamaño de la población y la disponibilidad de alimentos. Deseche cualquier placa que muestre contaminación bacteriana o fúngica.
  2. Elija de 15 a 30 embriones, transfiéralos a nuevas placas y crezca a la temperatura deseada (15-25 °C) durante la duración del experimento. Alternativamente, coloque de 10 a 20 adultos grávidos en un plato, déjelos poner huevos durante 30 a 60 minutos y luego retírelos del plato. Tanto la selección directa de los embriones como la formación de adultos grávidos darán cierta variabilidad en la edad (±6 horas). Para reducir esta variabilidad, elija embriones en una etapa específica, por ejemplo, en etapa de coma, o establezca de 10 a 20 adultos que recién comienzan a poner huevos (día 2 de la edad adulta). Evite la sincronización por blanqueo siempre que sea posible, dado que este tratamiento es estresante y puede afectar a la proteostasis.
  3. Elija los animales sincronizados, transfiéralos a una placa de ensayo para marcarlos y luego deséchelos.

2. Ensayo de movimiento

Elija los animales sincronizados y transfiéralos a una placa limpia a la temperatura deseada para la puntuación de movimiento (15-25 °C). Para cada réplica biológica, marque >20 animales y repita el ensayo al menos 3 veces por condición experimental. Utilice la prueba de suma de rangos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar dos condiciones experimentales independientes.

  1. Para determinar si hay un deterioro leve del movimiento, coloque de 5 a 7 animales juntos en el centro de un césped bacteriano limpio y permita que los animales se muevan en el plato durante 2 minutos. Este intervalo de tiempo se determinó en función del tiempo que tardó el 90% de los animales de tipo salvaje en despejar un círculo de 1 cm.
  2. Cuente el número de animales que no superaron un círculo de 1 cm (por ejemplo, que permanecieron dentro de un radio de 1 cm desde el punto en el que se colocaron) dentro de 2 minutos como descoordinados.
  3. Para determinar si hay un deterioro grave del movimiento, coloque a los animales en un césped bacteriano limpio.
  4. Fotografíe varios animales en el tiempo cero (t=0) y de nuevo 5 min más tarde (t=5). Puntúe a los animales que no se movieron una longitud del cuerpo después de 5 minutos como paralizados.

3. Termorresistencia

  1. Elija >20 animales sincronizados y transfiéralos a una placa de 24 pocillos que contenga 450 μl de tampón de choque térmico (HS) (Tabla 1). Para cada réplica biológica, marque >20 animales y repita el ensayo al menos 4 veces por condición experimental.
  2. Transfiera la placa de 24 pocillos a un baño caliente. La temperatura y la duración del HS dependen en gran medida de las condiciones de crecimiento, en particular, de la temperatura de cultivo.
  3. Complemente el tampón HS con 9 μl de naranja SYTOX.
  4. Evalúe la supervivencia de los animales mediante el control de la absorción de colorantes, utilizando un estereoscopio fluorescente con un filtro TXR. Los animales que absorbieron el tinte están muertos. Utilice la prueba de suma de rangos de Wilcoxon Mann-Whitney para comparar dos condiciones experimentales independientes.

Uso de inmunotinción y proteínas marcadas para monitorear el plegamiento de proteínas en células específicas

4. Monitorizar la localización de proteínas mediante inmunotinción

  1. En la etapa requerida, transfiera al menos 30 animales a un tubo Eppendorf que contenga tampón M936.
  2. Lave a los animales varias veces con tampón M9 realizando un paso de centrifugación corto a baja velocidad (3.000 rpm/900 x g, 2 min) y resuspendiéndolos.
  3. Coloque los tubos sobre hielo durante unos minutos para que se enfríen.
  4. Retire el exceso de líquido e incube con 500 μl de solución helada de paraformaldehído al 4% (Tabla 2). El tiempo de incubación debe calibrarse para cada proteína examinada y debe ser de alrededor de 5-30 minutos a temperatura ambiente. También se puede realizar una incubación prolongada a 4 °C, pero esto puede afectar la permeabilización de la muestra.
  5. Lavar animales fijos 3 veces con tampón PBS-Tween (pH 7,2) por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min). Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.
  6. Recoger los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min).
  7. En la campana, retire la mayor parte del sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de solución de β-mercaptoetanol (β-ME) (Tabla 2).
  8. Incubar a 37 °C durante la noche con un suave balanceo en un nutator.
  9. En la capucha, lave a los animales 3 veces con tampón PBS-Tween (pH 7,2).
  10. Vuelva a suspender los animales en 50-100 μl de PBS-Tween (pH 7,2). Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.
  11. Recoja los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min) y elimine la mayor parte del tampón PBS-Tween.
  12. Añadir 100-150 μl de solución de colagenasa a cada tubo e incubar a 37 °C con una fuerte agitación (utilizando un termomezclador o una incubadora agitadora).
  13. Examine a los animales frecuentemente bajo un microscopio estereoscópico, comenzando después de 5 minutos de incubación. Cuando el 20% de los animales estén rotos, detenga la reacción colocando el tubo sobre hielo. ¡Este paso es muy sensible! La duración del tratamiento depende de las condiciones de fijación y puede variar ampliamente entre cepas. Una incubación prolongada podría resultar en la degradación completa de los animales. Las condiciones deben calibrarse para cada lote de enzimas utilizado y la degradación debe controlarse cuidadosamente.
  14. Lave a los animales dos veces en PBS-Tween (pH 7.2) y luego recoja los animales por centrifugación (3,000 rpm, 1-2 min) y elimine la mayor parte del tampón PBS-Tween.
  15. Añadir 1 ml de solución de AbA (Tabla 2) e incubar con un suave balanceo durante 1 hora a temperatura ambiente. Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.
  16. Recoger los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min) y resuspender en 200 μl de AbA.
  17. Agregue el anticuerpo primario diluido a 1:100-1:1,000 en solución de AbA e incube con un balanceo suave. La temperatura y la duración de la incubación pueden variar entre los anticuerpos y deben calibrarse para cada proteína examinada. Comenzamos con una incubación nocturna a temperatura ambiente.
  18. Lavar a los animales por centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min).
  19. Añadir tampón AbA (1 ml) e incubar mezclando suavemente durante 15-60 min a temperatura ambiente. Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.
  20. Opcional: La muestra también se puede teñir con tintes fluorescentes. Para ello, añada el colorante (por ejemplo, DAPI (2 mg/ml) o Phalloidin (1:100)) a 200 μl de AbA e incube con un suave balanceo durante un máximo de 1 hora. Este paso se puede realizar durante uno de los pasos para lavar el anticuerpo secundario.
  21. Lave a los animales 3 veces repitiendo los pasos 4.18-4.19.
  22. Añadir 100 μl de AbA con el anticuerpo secundario adecuado marcado con fluorescencia, diluido 1:100.
  23. Mantenga las muestras cubiertas (o en un tubo oscuro) e incube con balanceo durante varias horas a temperatura ambiente.
  24. Lavar a los animales 3 veces incubándolos en tampón AbA (1 ml) con una mezcla suave durante 15-60 min a temperatura ambiente seguido de centrifugación (3.000 rpm, 1-2 min). Los animales pueden almacenarse en esta etapa a 4 °C durante algunas semanas.
  25. Para montar animales en portaobjetos, retire todo el líquido y vuelva a suspender en 10 μl del mismo tampón.
  26. Corte el extremo de la punta de la pipeta para evitar el corte de los animales y transfiera 1-2 μl de la muestra a un portaobjetos.
  27. Agregue medio de montaje en una proporción de 1:1.
  28. Cubra el portaobjetos suavemente con un cubreobjetos y séllelo con esmalte de uñas. Si el portaobjetos no se supervisa inmediatamente, los portaobjetos pueden almacenarse a -20 °C durante un período prolongado de tiempo.

5. Monitorizar la localización de proteínas marcadas

  1. En la etapa requerida, recoja al menos 15 animales en una gota de 10 ml de tampón M9 en un portaobjetos.
  2. Con un "palillo de gusano", mueva a los animales a una gota de 10 ml de solución de paraformaldehído (4%) (Tabla 2) y espere hasta que todos los animales dejen de moverse (aproximadamente 5 min).
  3. Con un "palillo de gusano", coloque a los animales en una gota de 2 ml de tampón M9 y medio de montaje (1:1) (Tabla 2).
  4. Cubra suavemente a los animales con un cubreobjetos y séllelos con esmalte de uñas.

Uso de ensayos ex vivo para monitorizar el plegamiento y la estabilidad de las proteínas

6. Digestión parcial

  1. Lave los animales de 15 platos (60 mm) con 1-2 ml de tampón M9 en un tubo de microfuga. Tenga en cuenta que los animales no deben estar abarrotados y que debe haber suficiente comida disponible durante todo el experimento.
  2. Lavar los animales unas cuantas veces con tampón M9 centrifugando (3.000 rpm, 2 min) y resuspendiendo los animales.
  3. Después del centrifugado final, vuelva a suspender a los animales en tampón M9 de 100 μl.
  4. Congelación instantánea en líquido N2. Las muestras se pueden almacenar a -80 °C.
  5. Usando un mortero refrigerado y un taladro motorizado (también se puede usar un taladro de cultivo de tejidos manual), muela la muestra. Mantenga la muestra en hielo y evite el sobrecalentamiento.
  6. Examine a los animales con frecuencia bajo un microscopio estereoscópico para determinar si la molienda está completa. Si quedan animales intactos, repita el procedimiento.
  7. Calcule el volumen pipeteando el extracto de lombriz.
  8. Agregue una proporción de 1:1 de (2x) solución de lisis de lombrices (Tabla 3). No use inhibidores de la proteasa de ningún tipo.
  9. Incubar en hielo durante 15 min.
  10. Eliminar los residuos por centrifugación (1.000 x g durante 2 min) en una centrífuga preenfriada (4 °C).
  11. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga limpio. Las muestras pueden utilizarse directamente o almacenarse a -80 °C.
  12. Prepare la solución de quimotripsina (Tabla 3) y manténgala en hielo hasta su uso.
  13. Determine la concentración total de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.
  14. Diluir la muestra, si es necesario, de modo que la concentración total de proteínas sea de 3-3,5 mg/ml.
  15. Añadir solución de quimotripsina al lisado total de proteínas (1:1.200).
  16. Para determinar el tiempo de incubación, incube la muestra con quimotripsina durante 60 min. Retire 20 μl de alícuotas de la muestra en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, 0, 5, 20, 40 y 60 min), mezcle inmediatamente con el tampón de muestra SDS y hierva durante 5 min a 96 °C. * Alternativamente, incube la muestra con diferentes concentraciones de quimotripsina y detenga la reacción después de un tiempo específico agregando tampón de muestra SDS y hirviendo durante 5 min a 96 °C.
  17. Ejecute muestras en un gel SDS-PAGE.
  18. Realizar el análisis de Western blot utilizando los anticuerpos adecuados para determinar la estabilidad relativa de la proteína.
  19. Determine las condiciones óptimas (concentración de quimotripsina y tiempo de digestión) que muestran cambios significativos entre muestras y utilice estas condiciones para futuros experimentos.
  20. Determine la intensidad de diferentes productos de digestión (fragmentos de menor peso molecular) utilizando software de densitometría, como el módulo de gel de imagen de los NIH.

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Resultados

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Un entorno de plegamiento comprometido puede provocar un mal plegamiento y agregación de proteínas. El mal plegamiento de proteínas se asocia con una conformación alterada y resulta en una pérdida de la función de la proteína. Utilizamos enfoques complementarios para monitorear el plegamiento y la función de las proteínas en animales intactos, células específicas y extractos de proteínas. Una elección inteligente de sensor de plegamiento, basada en fenotipos celulares y de comportamiento fuertes que se asocian con una mu...

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Discusión

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Las sondas de la capacidad de proteostasis celular deben ser altamente sensibles a los cambios en el entorno de plegamiento y ser fácilmente monitoreadas para proporcionar una evaluación en tiempo real de las capacidades de control de calidad del plegamiento de proteínas. Utilizando proteínas metaestables como sondas de capacidad de proteostasis, monitoreamos los cambios en el fenotipo, la localización de proteínas subcelulares y la conformación de proteínas. Los protocolos presentados aquí se centran en los fenotipos as...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Todas las cepas de nematodos utilizadas en este trabajo fueron proporcionadas por el Centro de Genética de Caenorhabditis, que está financiado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) de los NIH. Los anticuerpos monoclonales desarrollados por H.F. Epstein se obtuvieron del Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por el Departamento de Biología de la Universidad de Iowa. N. Shemesh contó con el apoyo del premio Fay y Bert Harbour. A.B.-Z. contó con el apoyo de una beca Alon del Consejo Israelí para la Educación Superior, una beca Marie Curie para la Reintegración Internacional y subvenciones de la Fundación Binacional de Ciencias y la Fundación Israelí de Ciencias (Subvención Nº 91/11).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Paraformaldehído deanticuerpo y fiaxaciónMerc 8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
Colgenasa SigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa AesarA16046
β -MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
  Resumen parcial QuimotripsinaSigmaC4129-250MG
TermorresistenciaSYTOXNaranja InvitrogenS11368
ColesterolAmaresco0433-250G
M165 FC Estereoscopio
Microscopio confocal ConfoCor 3/510 METAZeiss
Granullet MajlesSigmaZ359947-100EA
Granullet Mortle Motor InalámbricoKontesK749540-0000
MicroCL 17 Microcentrífuga SerieTermo 75002455Refrigerada, , 230 V 50/60 Hz, incluye 24x rotor de 1,5/2,0 ml con tapa de biocontención ClickSeal
EQUIPO fluorescente Leica TXR filter EXi Cámara de microscopía de fluorescencia azul QImaging EXI-BLU-R-F-M-14-C

Referencias

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