FtsZ Polimerización Ensayos: Protocolos simples y Consideraciones

Resumen

La polimerización de FtsZ es esencial para la división celular bacteriana. En este informe, detallamos protocolos simples para monitorear la actividad de polimerización de FtsZ y discutimos la influencia de la composición del tampón. Los protocolos se pueden utilizar para estudiar la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras o fármacos antibacterianos que afectan a la polimerización de FtsZ.

Resumen

Durante la división celular bacteriana, la proteína esencial FtsZ ensambla en el medio de la célula para formar el llamado anillo Z. FtsZ polimeriza en largos filamentos en presencia de GTP in vitro, y la polimerización se regula por varias proteínas accesorias. Polimerización de FtsZ ha sido ampliamente estudiado in vitro usando métodos básicos incluyendo dispersión de la luz, sedimentación, ensayos de hidrólisis de GTP y microscopía electrónica. Las condiciones del tampón influir tanto en las propiedades de polimerización de FtsZ, y la capacidad de FtsZ para interactuar con proteínas reguladoras. A continuación, describimos los protocolos para los estudios de polimerización de FtsZ y validar las condiciones y controles utilizando Escherichia coli y Bacillus subtilis FtsZ como proteínas modelo. Un ensayo de sedimentación baja velocidad se introduce que permite el estudio de la interacción de FtsZ con proteínas que agrupan o tubulate polímeros de FtsZ. Un protocolo de ensayo GTPasa mejorado se describe que permite realizar pruebasde la hidrólisis de GTP en el tiempo utilizando diferentes condiciones en una configuración de placa de 96 pocillos, con tiempos de incubación estandarizadas que suprimen la variación en el desarrollo de color en la reacción de detección de fosfato. La preparación de las muestras para los estudios de dispersión de luz y microscopía electrónica se describe. Varios buffers se usan para establecer pH adecuado y la concentración de sal para los estudios de polimerización de FtsZ. Una alta concentración de KCl es la mejor para la mayoría de los experimentos. Nuestros métodos proporcionan un punto de partida para la caracterización in vitro de FtsZ, no sólo a partir de E. coli y B. subtilis pero a partir de cualquier otra bacteria. Como tal, los métodos pueden ser utilizados para estudios de la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras o las pruebas de fármacos antibacterianos que puedan afectar a la polimerización de FtsZ.

Introducción

La proteína bacteriana esencial FtsZ es la proteína mejor caracterizada de la maquinaria de división celular bacteriana. FtsZ es el homólogo procariota de la tubulina y se polimeriza in vitro de forma dependiente de GTP. FtsZ es un objetivo muy atractivo para nuevos antibióticos debido a su naturaleza conservada y su singularidad frente a las bacterias^1,2. Al comienzo de la división celular, FtsZ forma un anillo citocinético en la célula media, que sirve como andamio para el ensamblaje de otras proteínas de división celular. La formación del anillo Z es crucial para la correcta localización del plano de división. La dinámica de ensamblaje de FtsZ está regulada por varias proteínas accesorias, como (dependiendo de la especie bacteriana) MinC, SepF, ZapA, UgtP y EzrA². La polimerización de FtsZ se ha estudiado intensamente in vitro y se han descrito muchas estructuras diferentes, incluidos protofilamentos rectos, protofilamentos curvos, láminas de filamentos, haces de filamentos y tubos de filamentos, en función del tampón de ensamblaje, el nucleótido y las proteínas adicionales incluidas en el ensayo³. La arquitectura de los protofilamentos FtsZ in vivo aún no se comprende completamente, aunque los experimentos de criotomografía electrónica en Caulobacter crescentus sugieren que el anillo Z se ensambla a partir de protofilamentos individuales relativamente cortos y no continuos sin un agrupamiento extenso⁴.

In vitro, las propiedades de polimerización de FtsZ y la interacción de FtsZ con proteínas reguladoras son sensibles a la composición del tampón de reacción. Por ejemplo, recientemente describimos el sitio de interacción para SepF en el extremo C de FtsZ y mostramos que un truncado de terminal C de FtsZ_Bs∆16 ya no se une a SepF⁵. En un estudio previo sobre la interacción SepF-FtsZ_Bs, un truncado similar de FtsZ_Bs∆16 todavía cosedimentado con SepF, lo que sugiere que SepF se une a un sitio secundario en FtsZ⁶. La diferencia entre estos estudios fue la composición de los tampones de reacción: a pH 7.5 no hubo cosedimentación de SepF con el truncado de FtsZ, mientras que a pH 6.5 hubo cosedimentación. Gündoğdu et al. observó que el SepF no es funcional y precipita a pH 6.5⁷, lo que muestra que la cosedimentación observada a pH 6.5 probablemente sea causada por la precipitación de SepF en lugar de la interacción con el truncado FtsZ_Bs∆16 C-terminal. La influencia de la concentración de pH y KCl en la polimerización de FtsZ ha sido examinada previamente. Los polímeros de E. coli FtsZ (FtsZ_Ec) a pH 6,5 son más largos y abundantes que los formados a pH^{neutro 8,9}. Tadros y cols. han estudiado la polimerización de FtsZ_Ec en presencia de cationes monovalentes, observando que la unión de K⁺ está vinculada a la polimerización de FtsZ_Ec y es crucial para la actividad de FtsZ¹⁰. El pH es más crítico cuando se estudia la interacción de FtsZ con otras proteínas, como se muestra en el ejemplo anterior de SepF, y la dependencia del pH del efecto inhibidor de MinC sobre FtsZ¹¹. Dado que tanto el pH como la concentración de sal pueden influir en la interacción de FtsZ con otras proteínas, es importante elegir las condiciones y los controles adecuados para los estudios de polimerización de FtsZ.

Aquí describimos protocolos para estudiar la polimerización de FtsZ y la actividad de GTPasa mediante dispersión de luz, microscopía electrónica, sedimentación y ensayos de GTPasa. La dispersión de luz en ángulo recto es un método estándar para estudiar la polimerización de FtsZ en tiempo real¹². Introdujimos algunas mejoras en el ensayo de sedimentación y GTPasa. Presentamos en detalle cómo preparar muestras para dispersión de luz y microscopía electrónica. Se probaron varios tampones utilizados en la literatura para estudiar la polimerización de FtsZ y describimos las mejores condiciones para cada experimento. También mostramos qué controles se deben introducir para obtener los mejores datos.

Estos métodos permiten un estudio rápido de la polimerización, actividad e interacción de FtsZ con otras proteínas utilizando métodos y equipos simples que están disponibles en la mayoría de los laboratorios. Existen métodos más sofisticados para estudiar la polimerización de FtsZ, pero a menudo requieren acceso a equipos más especializados y/o la modificación de FtsZ con etiquetas fluorescentes^8,13,14. Los métodos simples descritos en este artículo se ilustran utilizando FtsZ de B. subtilis y E. coli, los organismos modelo Gram+ y Gram- más comunes. Los protocolos se pueden adaptar a cualquier otra proteína FtsZ. Sobre la base de los ensayos preliminares con estos nuevos FtsZ, pueden ser necesarios ligeros cambios en el tiempo, el tampón o la temperatura de incubación para obtener un resultado óptimo. Los experimentos descritos aquí deberían ayudar a encontrar estas condiciones óptimas.

Protocolo

Las proteínas FtsZ sin marcar se purificaron como se describió anteriormente^11,15, se dializaron contra 20 mM de Tris/HCl (pH 7,9), 50 mM de KCl, 1 mM de EGTA, 2,5 mM de MgAc y 10% de glicerol y se almacenaron a -80 °C. En esas condiciones, la proteína puede almacenarse durante más de 2 años sin pérdida significativa de actividad. La proteína debe almacenarse en alícuotas de 100 μl para evitar la descongelación y congelación de la muestra. Después de la descongelación, la muestra puede mantenerse a 4 °C durante un máximo de una semana. FtsZ es soluble en altas concentraciones y puede almacenarse en 7-10 mg/ml. Es importante mantener alta la concentración de proteínas para evitar efectos no deseados de los componentes del tampón de almacenamiento en experimentos posteriores. Por lo tanto, la concentración de almacenamiento debe permitir una dilución de FtsZ de al menos 10x para reducir la concentración de glicerol por debajo del 1% y minimizar la concentración de los otros componentes del tampón de diálisis en la mezcla de reacción. La polimerización de FtsZ también puede verse afectada por la presencia de altas concentraciones de sodio⁹ o imidazol, por lo que estos componentes deben eliminarse del tampón de polimerización. El SepF se purificó como se describe⁷ y se almacenó en tampón de elución a -80 °C. En la Tabla 1 se resumen los procedimientos alternativos publicados para la purificación de FtsZ a partir de E. coli y B. subtilis, así como las referencias a los procedimientos para la purificación de FtsZ a partir de diferentes fuentes (véase la sección de resultados representativos).

1. Preparación de la muestra

1. Preparar tampones de polimerización:

   1	50 mM Hepes/ NaOH, pH 7.5
   número arábigo	25 mM PIPES/ NaOH, pH 6,8
   3	50 mM MES/NaOH, pH 6,5
   4	50 mM Hepes/NaOH, pH 7,5; 50 mM KCl
   5	25 mM PIPES/NaOH, pH 6,8; 50 mM KCl
   6	50 mM MES/NaOH, pH 6,5; 50 mM KCl
   7	50 mM Hepes/NaOH, pH 7.5; 300 mM KCl
   8	25 mM PIPES/NaOH, pH 6,8; 300 mM KCl
   9	50 mM MES/NaOH, pH 6,5; 300 mM KCl

2. Filtro Esterilice todos los tampones con un filtro de membrana de 22 μm.
3. Prepare 100 mM GTP, GDP y MgCl₂ soluciones madre en cada tampón de polimerización de (1).
4. Precleare las proteínas girando a 100.000 x g durante 20 minutos a 4 °C para todos los experimentos.

2. Ensayo de sedimentación FtsZ

1. Prepare la mezcla de reacción mediante la adición de MgCl₂ y FtsZ a uno de los tampones de polimerización (consulte el punto de preparación de la muestra 1) en tubos compatibles con la centrifugación de alta velocidad. El volumen total debe ser de 49 μl, con MgCl₂ a 10 mM y FtsZ a 12 μM a 50 μl de volumen final.
2. Coloque el tubo en una incubadora con función de agitación, incube durante 2 minutos a 30 °C a 300 rpm (alternativamente, la muestra puede agitarse suavemente y microfugarse brevemente seguido de un precalentamiento a 30 °C).
3. Inicie la polimerización añadiendo 1 μl de solución madre de GTP o GDP en el mismo tampón que se utilizó en el experimento (concentración final de 2 mM). Incubar durante 10 o 2 min (para tampones con 50 mM de KCl y 300 mM de KCl, respectivamente) a 30 °C a 300 rpm (o en una incubadora con función de agitación).
4. Transfiera los tubos a un rotor ultracentrífugo y gire durante 10 minutos a 350.000 x g (89.700 rpm para el rotor TLA 120.1) a 25 °C.
5. Después de girar, retire con cuidado los tubos del rotor e inmediatamente transfiera el sobrenadante a un tubo limpio. Prepare las muestras para SDS-PAGE añadiendo 20 μl de sobrenadante a 20 μl de tampón de muestra 2x. Hervir durante 10 min a 98 °C.
6. Añada 50 μl de tampón de muestra 2x a la fracción de pellets que contiene polímeros FtsZ. Coloque el tubo de ultracentrífuga en un tubo de 2 ml. Vuelva a suspender el pellet hirviendo durante 10 min a 98 °C, luego agregue 50 μl de H₂O desmineralizado para que la muestra tenga la misma dilución 2x que la muestra sobrenadante.
7. Coloque el tubo de ultracentrífuga boca abajo en el tubo de 2 ml y gírelo durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a 18.000 x g. Retire el tubo de ultracentrífuga del tubo de 2 ml.
8. Cargue 10 μl de cada sobrenadante y muestra de pellets uno al lado del otro en un gel SDS-PAGE al 10%. Ponga el gel a 150 V.
9. Teñir el gel con Coomassie Brilliant Blue G-250 y guardar para la cuantificación.

3. Ensayo de sedimentación FtsZ a espín lento

1. Prepare la solución de polimerización como en el paso 2, agregue SepF y/o FtsZ (concentración final de 12 μM). Estos experimentos se pueden realizar en tubos desechables Beckman de 1,5 ml en combinación con un rotor TLA-55.
2. Coloque el tubo en una incubadora con función de agitación e incube durante 2 minutos a 30 °C a 300 rpm.
3. Iniciar la polimerización mediante la adición de 1 μl de GTP o GDP a partir de una solución madre (concentración final 2 mM), incubar durante 20 min a 30 °C a 300 rpm.
4. Centrifugar durante 15 minutos a 24.600 x g (20.000 rpm para el rotor TLA 55) a 25 °C.
5. Retire el sobrenadante y transfiéralo a un tubo limpio, tome 20 μl y transfiéralo a 20 μl de tampón de muestra 2x. Hervir durante 10 min a 98 °C.
6. Añadir 50 μl de tampón de muestra 2x a la fracción de pellets que contiene polímeros y resuspender hirviendo durante 10 min a 98 °C, añadir 50 μl de H₂O desmineralizado.
7. Cargue 10 μl de cada sobrenadante y muestra de pellets uno al lado del otro en un gel SDS-PAGE al 10%. Ponga el gel a 150 V.
8. Teñir el gel con Coomassie Brilliant Blue G-250 y guardar para la cuantificación.

4. Cuantificación de los ensayos de sedimentación FtsZ

1. Tome una foto del gel teñido de Coomassie utilizando un sistema de documentación de gel (por ejemplo, LAS-4000, Fujifilm).
2. Abra la imagen de gel en un programa adecuado para el análisis densitométrico de geles (por ejemplo, el programa analizador de imágenes AIDA (Raytest)) y describa el análisis en este programa a continuación.
3. Haga clic en el botón "Evaluación" en la barra de herramientas.
4. Seleccione la "Densitometría 2D" de la lista y haga clic en Aceptar.
5. En el menú principal, haga clic en "Evaluación" y elija la entrada "Determinación de la región".
6. Para crear una región en el gel, haga clic en el símbolo de la herramienta Contorno automático en la caja de herramientas Determinación de región.
7. Haga clic en la esquina superior izquierda de la banda de proteínas en el gel, mantenga presionado el botón del mouse y arrástrelo al extremo inferior derecho deseado de la banda y suelte el botón del mouse.
8. Marque cada banda FtsZ/SepF de la misma manera.
9. Toda la información sobre la evaluación de las regiones asignadas se puede encontrar en el Informe de Regiones. Para obtener el informe de región, haga clic en el botón "Mostrar informe de región" en la caja de herramientas Determinación de región.
10. Para exportar el informe, en el menú principal, haga clic en Archivo y elija la entrada "Exportar informe de región 2D".
11. En el informe de región, se debe encontrar la intensidad de cada región creada. Calcule el porcentaje de proteína (FtsZ, proteína reguladora) en el pellet utilizando los valores de intensidad del informe.

5. Dispersión de luz de 90°

1. Encienda un espectrómetro de fluorescencia (por ejemplo, AMINCO-Bowman Series 2), deje que la lámpara se caliente durante varios minutos para evitar fluctuaciones térmicas y encienda un baño de agua circulante para mantener la temperatura de la cámara de la cubeta a 30 °C.
2. Defina los parámetros de funcionamiento del espectrómetro: detector de alto voltaje 300 V, longitud de onda de emisión y excitación: 350 nm, ancho de rendija: 4 nm. Tenga en cuenta que muchos espectrómetros ajustan automáticamente la señal al comienzo de un experimento a un cierto porcentaje (por ejemplo, el 60%) del máximo. Esto hace que una señal de dispersión salga del rango tan pronto como se agrega GTP para polimerizar FtsZ. Es aconsejable establecer primero la amplificación de señal correcta (detector de alto voltaje) para la máxima polimerización antes de comenzar una serie de experimentos.
3. Programe un protocolo de adquisición de datos. Elija la adquisición basada en el tiempo, con una duración de 3.600 segundos.
4. Limpie cuidadosamente una cubeta de fluorescencia con agua y etanol, si es necesario, sonique en baño de agua a temperatura ambiente durante 5 min. En este protocolo, se utilizaron cubetas con una longitud de paso de 1 cm y un volumen de 200 μl y se almacenaron en solución de almacenamiento (0,5-1% Hellmanex). Como alternativa, se pueden utilizar cubetas de plástico de un solo uso compatibles con los rayos UV (UVette, Eppendorf).
5. Prepare 294 μl de una mezcla maestra del tampón de polimerización (ver punto de preparación de la muestra 1) con 10 mM MgCl₂ y 12 μM FtsZ como concentración final calculada para 300 μl, y vórtice.
6. Transfiera 196 μl del tampón de polimerización a la cubeta y colóquelo en el espectrómetro. Incubar durante 2 min a 30 °C.
7. Inicie la adquisición de datos y espere 90 segundos para verificar que la señal es estable.
8. Añadir 4 μl de 100 mM GTP o GDP (concentración final: 2 mM) para lograr un volumen de reacción final de 200 μl, pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de mayor volumen para mezclar y reanudar la adquisición.

6. Microscopía electrónica de transmisión

1. Prepare las muestras como para el ensayo de sedimentación FtsZ (el volumen se puede reducir a 10 μl de volumen final para ahorrar material).
2. Después del tiempo de incubación, aplique 2 μl de la muestra en una rejilla de cobre recubierta de carbono de malla 400 descargada por brillo y cocine durante 15 segundos.
3. Seque la rejilla tocando o arrastrando suavemente la rejilla paralela o perpendicular a un trozo de papel de filtro.
4. Teñir la rejilla con 4 μl de una solución de acetato de uranilo al 2%. Seque la rejilla como se describe en el paso 6.3.
5. Vea la cuadrícula en un microscopio electrónico Philips CM120 que funciona a 120 kV con un aumento de 39.200X.

7. Ensayo de hidrólisis GTP

La configuración del experimento está diseñada de tal manera que la hidrólisis GTP de FtsZ se detiene después de varios tiempos de reacción mezclando la reacción con verde de malaquita. De esta manera, el tiempo de desarrollo del color verde malaquita es el mismo para cada muestra.

1. Prepare 1,5 ml 2 mM GTP en uno de los tampones de polimerización (véase la preparación de la muestra, punto 1).
   Prepare una dilución estándar de fosfato de 0-40 μM en un tampón de polimerización y prepare el reactivo de trabajo verde de malaquita como se describe en el kit POMG-25H (Bio ensayos). Alternativamente, los reactivos de trabajo se pueden preparar internamente de acuerdo con los protocolos descritos por Lanzetta et al.¹⁶
2. Preparar mezclas maestras en un volumen total de 360 μl:

   Yo	24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, tampón de polimerización
   Ii	12 μM FtsZEc, 20 mM MgCl2, tampón de polimerización
   III (control 1)	24 μM FtsZBs, 2 mM EDTA, tampón de polimerización
   IV (control 2)	12 μM FtsZEc, 2 mM EDTA, tampón de polimerización

3. Pipetear 20 μl de alícuotas de las mezclas maestras, 100 μl de patrones de fosfato y 180 μl de 2 mM de GTP en una placa qPCR de 96 pocillos en el siguiente orden:

   	un	B	C	D	E	F	G	H
   1	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   número arábigo	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   3	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   4	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   5	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   6	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   7	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   8	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   9	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D
   10	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D
   11
   12	GTP	GTP	GTP	GTP	GTP	GTP	GTP	GTP

   
   PS - estándar de fosfato
4. Coloque la placa qPCR en una máquina de PCR con el programa ajustado a un ciclo de 40 minutos a 30 °C.
5. Prepare 20 μl de alícuotas de reactivo de trabajo verde de malaquita en una placa de 96 pocillos. Agregue 60 μl del tampón de polimerización del experimento a los carriles 1'-8'. La muestra se diluirá 4 veces en comparación con el estándar de fosfato, tenga en cuenta este hecho durante los cálculos finales.

   	un	B	C	D	E	F	G	H
   1'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   2'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   3'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   4'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   5'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   6'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   7'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   8'	Iii	Iii	Yo	Yo	Iv	Iv	Ii	Ii
   9'	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D
   10'	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D	P.D

6. Añadir 20 μl de GTP al carril 1, pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar, temporizador de inicio (este es el punto de tiempo de inicio de la reacción de 30 minutos).
7. Después de 10 minutos y 30 segundos, agregue GTP al carril 2, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 20 minutos).
8. Después de 16 minutos, agregue GTP al carril 3, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 15 minutos).
9. Después de 21 minutos y 30 segundos, agregue GTP al carril 4, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 10 minutos).
10. Después de 25 minutos, agregue GTP al carril 5, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 7 minutos).
11. Después de 27 minutos y 30 segundos, agregue GTP al carril 6, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 5 minutos).
12. Después de 29 minutos, agregue GTP al carril 7, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 4 minutos).
13. Después de 30 minutos, transfiera 20 μl del carril 1 al carril 1', pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (punto de partida del desarrollo del color verde malaquita para la reacción de 30 minutos).
14. Después de 30 minutos y 30 segundos, transfiera 20 μl del carril 2 al 2', pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (punto de partida del desarrollo del color verde malaquita para la reacción de 20 minutos).
15. Repita el paso para los carriles 3-7 cada 30 segundos.
16. Después de 33 minutos y 30 segundos, agregue 20 μl de GTP al carril 8, pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transfiera 20 μl al carril 8', pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (reacción de 0 minutos y punto de tiempo de inicio para el desarrollo del color verde malaquita para la reacción).
17. Después de 34 minutos, agregue 80 μl desde el carril 9 hasta el 9', pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (el punto de tiempo de inicio para el desarrollo del color verde malaquita para el estándar de fosfato 1).
18. Después de 34 minutos y 30 segundos, transfiera 80 μl del carril 10 al 10', pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar (el punto de tiempo de inicio para el desarrollo del color verde malaquita para el estándar de fosfato 2).
19. Retire todas las burbujas de aire de las muestras e incube la placa a temperatura ambiente durante otros 25 minutos y 30 segundos.
20. Coloque la placa en un lector de placas de 96 pocillos.
21. Después de 60 minutos, mida la placa 10 veces cada 30 segundos a una longitud de onda de 630 nm (el desarrollo del color verde malaquita ahora es de 30 minutos para la primera reacción). Cada medición corresponde a cada punto de tiempo de los pasos 7.6-7.12 y 7.16 y debe calcularse por separado durante un análisis de datos.
22. Calcule el fosfato libre en cada muestra utilizando la curva de calibración estándar de fosfato.
23. Trace los datos como liberación de fosfato a lo largo del tiempo y calcule la actividad de hidrólisis FtsZ GTP a partir del rango lineal de la curva.

Resultados

La purificación de FtsZ a partir de diferentes fuentes bacterianas se ha descrito en la literatura y se resume en la Tabla 1.

fuente	método	modificación	Rendimiento obtenido [mg/L de cultivo]>	Referencias
B. subtilis	1) Precipitación de sulfato de amonio/cromatografía de intercambio iónico	No	40	Esta obra, 11,15
2) Cromatografía de afinidad	Su etiqueta	Nd	17
E. coli	1) Precipitación de sulfato de amonio/cromatografía de intercambio iónico	No	35	Esta obra, 11,15
2) Precipitación de calcio, cromatografía de intercambio iónico	No	40	18
Methanococcus jannaschii	1) Cromatografía de afinidad en condiciones de desnaturalización/repliegue/precipitación de sulfato de amonio/filtración en gel	Su etiqueta	1.3	19
2) Cromatografía de afinidad / filtración en gel	Su etiqueta	Nd	20
Thermotoga maritima	Cromatografía de intercambio iónico/filtración en gel	No	6.7	19
Pseudomonas aeruginosa	Cromatografía de afinidad/filtración en gel	Estreptococo-tag, His-tag	Nd	21
Mycobacterium tuberculosis	1) Cromatografía de afinidad/intercambio iónico	No	Nd	22
2) Cromatografía de afinidad / filtración en gel	No	30	23
Aquifex aeolicus	Cromatografía de afinidad/filtración en gel	His-tag, truncamiento C-terminal (331-367)	Nd	24
Caulobacter crescentus	Cromatografía de intercambio iónico/precipitación de sulfato de amonio/filtración en gel	No	Nd	25

Tabla 1. Protocolos de purificación de FtsZ descritos. ND: no determinado.

Sedimentación de polímeros FtsZ

Inicialmente, utilizamos dos velocidades diferentes para hacer girar los polímeros FtsZ. Encontramos que solo a una velocidad de 350,000 x g se centrifugan polímeros individuales de FtsZ_Ec (Figura 1), mientras que a 190,000 x g solo están presentes haces de FtsZ_Bs en la fracción de gránulos (datos no mostrados). Por lo tanto, se utilizaron 350.000 x g en nuestros experimentos posteriores. El porcentaje de FtsZ_Ec y FtsZ_Bs polimerizados es similar a 50 mM KCl, a pesar de que los experimentos de dispersión de luz revelaron una señal de dispersión mucho mayor para FtsZ_Bs. Esto se debe a los haces formados por FtsZ Bs que dispersan más luz que los_polímeros individuales de FtsZ_Ec. No fue posible obtener una gran cantidad de polímeros FtsZ en la fracción de pellets en el experimento con KCl de 300 mM tanto para FtsZ_Ec como para FtsZ_Bs (Figura 1). Atribuimos esto a una combinación de desmontaje rápido de las estructuras FtsZ y disminución del agrupamiento de los filamentos.

Sedimentación de túbulos FtsZ-SepF

Para analizar la interacción de FtsZ con ciertos activadores, se pueden realizar ensayos de sedimentación a velocidades de centrifugación más bajas. A esta velocidad sólo se pueden peletizar grandes estructuras de FtsZ, por ejemplo, los grandes túbulos formados por anillos de SepF y^filamentos 5 de FtsZ_Bs, o los haces formados por FtsZ y ZapA. Utilizamos una centrifugación más baja (24.600 x g) para demostrar la viabilidad de este enfoque para los túbulos formados por FtsZ y SepF. FtsZ se recuperó en el pellet por encima de los niveles de fondo solo cuando tanto SepF como GTP estaban presentes en la muestra (Figura 2), y la presencia de SepF no influye en^{la actividad 7} de la GTPasa de FtsZ, lo que demuestra que FtsZ está completamente activo en presencia de SepF. La sedimentación específica de SepF y FtsZ es aproximadamente el 45% del SepF total y el 15% del total de FtsZ (en comparación con la sedimentación de material cuando se agrega el GDP). Esto muestra que los túbulos SepF-FtsZ contienen más SepF que FtsZ. Esto puede deberse a que muchos anillos SepF organizan los túbulos FtsZ-SepF^5,7. Se desconoce la estequiometría exacta de SepF-FtsZ en estos túbulos, pero nuestros resultados sugieren que hay más SepF presente que FtsZ.

FtsZ_Ec y FtsZ_{Bs propiedades de} polimerización y agrupación

Para caracterizar la eficiencia de polimerización de FtsZ_Bs y FtsZ_Ec en diferentes tampones, analizamos ambas proteínas mediante dispersión de luz en ángulo de 90°. A 50 mM KCl, FtsZ_Bs proporciona una señal de dispersión de luz 20-40 veces mayor que FtsZ_Ec dependiendo del pH del tampón (Figuras 3A y B), lo que confirma los resultados de Buske et al. ²⁶ El aumento de la concentración de KCl en el tampón no influyó significativamente en la señal de dispersión de luz de FtsZ_Ec (Figura 3D), pero la señal de FtsZ_Bs disminuyó ~ 80 veces a pH 7.5, ~ 30 veces a pH 6.8 y ~ 45 veces a pH 6.5 en 300 mM KCl (Figura 3C) en comparación con los tampones con 50 mM KCl (Figura 3A). El desmontaje de los polímeros FtsZ es más rápido a una concentración más alta de KCl para ambas proteínas (Figuras 3C y D). Los estudios de Pacheco-Gómez et al. muestran que la polimerización y agrupación de E. coli FtsZ depende del pH. Estos autores encontraron que en un tampón con 50 mM KCl la señal de dispersión de luz de la polimerización de FtsZ fue mayor, y el desmontaje de FtsZ tomó más tiempo a pH 6.0 en comparación con pH 7.0 ⁸. Estos resultados no concuerdan con nuestros datos de polimerización de FtsZ_Ec a 50 mM KCl (Figura 3B), pero hay que tener en cuenta que hemos utilizado tres tampones diferentes (HEPES, MES y PIPES) donde Pacheco-Gómez et al. solo se utiliza MES. Por lo tanto, no solo el pH, sino también la composición del tampón (fuerza iónica) afecta la cinética de los polímeros FtsZ a 50 mM KCl. Sin embargo, a 300 mM de KCl, ni la composición del tampón ni el pH influyeron en el ensamblaje de FtsZ_Ec de manera detectable.

Un experimento de dispersión de luz de FtsZ_Bs en tampones sin KCl no fue posible debido a la precipitación de la proteína en estas condiciones. Cuando la concentración de FtsZ_Bs se redujo a 3 μM, no se produjo precipitación. Sin embargo, 3 μM no es la concentración fisiológica de FtsZ en la célula. En las cubetas de plástico, los FtsZ_{Bs no} precipitaron a 12 μM a pH 7,5, pero a pH 6,8 y 6,5 FtsZ aún precipitaron en ausencia de KCl.

Morfologías de estructuras FtsZ de E. coli y B. subtilis

Las estructuras formadas por FtsZ fueron inspeccionadas por TEM. FtsZ Bs ensamblados en_polímeros compactados estrechamente que cubrían toda la rejilla en todos los tampones con bajo contenido de sal (Figuras 4A-C). FtsZ_Ec formó filamentos largos, cables y haces en todos los tampones con bajo contenido de sal (Figuras 4D-F). Sin embargo, la cantidad observable de polímeros formados por FtsZ_Ec fue menor que la cantidad formada por FtsZ_Bs. En tampones de alta sal, los FtsZ_Bs formaron protofilamentos monocatenarios más largos que no se asociaron en haces (Figuras 4G-I). Mientras que los protofilamentos FtsZ_Bs cambiaron de estructura a una mayor concentración de sal, FtsZ_Ec formó estructuras indistinguibles de las del tampón de baja sal (Figuras 4J-L). No se observó una influencia del pH en la polimerización de FtsZ_Ec, pero FtsZ Bs forma más haces a pH 6.5 que son_{visibles como polímeros} y láminas compactados estrechamente (Figura 4B). Estos resultados están de acuerdo con nuestros experimentos de dispersión de luz y el trabajo TEM publicado anteriormente^8,11,26.

La actividad GTPasa de FtsZ a altas y bajas concentraciones de KCl

La actividad de hidrólisis GTP de FtsZ se midió en diferentes condiciones utilizando un ensayo colorimétrico para fosfato libre. Como se informó anteriormente¹⁵ la actividad de GTPasa de FtsZ aumentó con el aumento de la concentración de KCl: dependiendo del tampón utilizado FtsZ_Bs. mostró un aumento de 3 a 7 veces, y FtsZ_Ec mostró un aumento de 1,5 a 2,5 veces en la actividad de GTPasa a 300 mM KCl en comparación con 50 mM KCl. La reducción de la actividad de la GTPasa a 50 mM de KCl se debe a la agrupación de los filamentos FtsZ_Bs. A 50 mM KCl, FtsZ_Ec tuvo una actividad GTPasa 3-6 veces mayor que FtsZ Bs debido al desmontaje más rápido de los_polímeros FtsZ_Ec. La diferencia en la actividad de hidrólisis de GTP entre FtsZ_Bs y FtsZ_Ec se redujo a 300 mM KCl, posiblemente debido a la reducción de la agrupación de filamentos FtsZ_Bs (Figura 5).

Figura 1. Cuantificación de la polimerización de FtsZ por sedimentación. (A) Se polimerizaron 12 μM de FtsZ en presencia de 2 mM GTP o GDP a pH 7,5 (barras negras), 6,8 (barras grises) o 6,5 (barras blancas). La cantidad de proteína peletizada se determinó mediante análisis densitométrico de geles teñidos con Coomassie. El PIB sirvió como control para una sedimentación específica y el porcentaje de FtsZ sedimentado con PIB se restó del porcentaje de FtsZ sedimentado con GTP para obtener los valores trazados en el gráfico. A la izquierda: FtsZ sedimentado a 50 mM KCl, a la derecha: FtsZ sedimentado a 300 mM KCl. (B) Resultados representativos de geles teñidos con Coomassie. Polimerización de FtsZ_Bs (gel superior) y FtsZ_Ec (gel inferior) a 50 mM KCl. (S) sobrenadante, (P) fracciones de pellets del experimento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Sedimentación de túbulos SepF/FtsZ a baja velocidad. (A) 12 μM FtsZ_Bs se polimerizaron con 2 mM GDP (barras blancas) o GTP (barras negras). La cantidad de proteína peletizada se determinó mediante análisis densitométrico de geles teñidos con Coomassie. Los signos + y - debajo del eje x indican la presencia o ausencia de FtsZ y SepF en la reacción. (B) Resultados representativos de un gel teñido con Coomassie. Polimerización de FtsZ_Bs en presencia y ausencia de SepF. Como control se utilizó SepF sin FtsZ. La polimerización se llevó a cabo con GTP y GDP. (S) sobrenadante, (P) fracciones de pellets del experimento. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Dispersión de luz de 12 μM FtsZ_Ec y 12 μM FtsZ_Bs. Los FtsZs se ensamblaron en presencia de 2 mM GTP y la polimerización se monitoreó mediante dispersión de luz en ángulo de 90°. Polimerización de FtsZ_Bs (A) y FtsZ_Ec (B) a 50 mM KCl a pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5. Polimerización de FtsZ_Bs (C) y FtsZ_Ec (D) a 300 mM KCl a pH 7.5, pH 6.8 y pH 6.5. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Estructuras de_polímeros FtsZ Bs y FtsZ_Ec visualizadas por microscopía electrónica. (De la A a la L) Imágenes de 12 μM FtsZ_Bs (A-C y G-I) y FtsZ_Ec (D-F) y (J-L) polimerizados con 2 mM GTP. (A-C) FtsZ_Bs en tampón con 50 mM de KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. (D-F) FtsZ_Ec en tampón con 50 mM de KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. (G-I) FtsZ_{Bs en tampón} con 300 mM de KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. (J-L) FtsZ_Ec en tampón con 300 mM de KCl y pH 7.5, 6.8 y 6.5 respectivamente. Barra de escala: 100 nm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Hidrólisis de GTP durante la polimerización de FtsZ en 6 tampones diferentes. En todos los experimentos se utilizaron 2 mM de GTP. Como muestra control no se utilizó MgCl₂. La actividad de FtsZ sin MgCl₂ se restó de la actividad de FtsZ en presencia de MgCl₂. A la izquierda: Actividad GTPasa de FtsZ a 50 mM KCl, a la derecha: Actividad GTPasa de FtsZ a 300 mM KCl. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discusión

Describimos un conjunto de métodos que permiten un análisis rápido de la actividad de FtsZ y su interacción con otras proteínas. Los ensayos de dispersión de luz, sedimentación y GTPasa, así como la microscopía electrónica, se han utilizado ampliamente para estudiar la polimerización de FtsZ. Hemos realizado algunas mejoras en los protocolos existentes, mostramos la influencia de diferentes condiciones en el ensamblaje de FtsZ y proponemos controles que deben incluirse en los estudios de FtsZ.

Introducimos la centrifugación a baja velocidad para distinguir las grandes estructuras formadas por la asociación entre FtsZ y sus proteínas que interactúan de los polímeros FtsZ. Este método muestra dos ventajas sobre el ensayo de sedimentación estándar. En primer lugar, los polímeros FtsZ no forman fondo en la fracción de pellets, ya que no se centrifugan a 24.600 x g. En segundo lugar, la cantidad de FtsZ presente en la estructura formada con una proteína que interactúa se puede calcular a partir del gel. Dos pasos críticos en este método son el tiempo de incubación y la concentración de GTP. Es importante centrifugar la estructura de proteína grande cuando está completa, pero antes de que se desmonte cuando todo el GTP esté hidrolizado. El mejor control para este estudio es la polimerización de FtsZ con GDP. Existe una limitación potencial del ensayo. FtsZ forma un complejo estable con SepF, que se puede girar fácilmente a 24,600 x g. Si se realiza la sedimentación con otro activador o un fármaco que agrupa polímeros FtsZ, puede ser necesario adaptar el ensayo. Se puede hacer cambiando el tiempo de incubación o aumentando la velocidad de centrifugación.

La preparación adecuada de la muestra es lo más importante para los experimentos de dispersión de luz. Las proteínas deben eliminarse previamente mediante centrifugación y todos los tampones deben filtrarse antes de su uso. Si hay agregados presentes en la muestra, interrumpirán una señal estable obtenida de polímeros FtsZ. Para el análisis de las estructuras FtsZ mediante microscopía electrónica, el paso principal es la preparación de una cuadrícula. El tiempo de incubación de la muestra en la rejilla tendrá el efecto de producir polímeros más o menos compactados. Para los haces de FtsZ_B, el tiempo de incubación debe ser más corto que para FtsZ_Ec y FtsZ_Bs a alta concentración de KCl. Utilizamos una concentración de 12 μM para cada muestra para poder comparar los resultados. Sin embargo, para FtsZ_Bs a 50 mM KCl se debe utilizar una concentración de FtsZ más baja, ya que 12 μM dieron lugar a una saturación completa de la cuadrícula. Esto hace que los polímeros estén muy compactados y sean difíciles de detectar. Los polímeros menos compactados son mejores para detectar en EM.

El ensayo de GTPasa es el único experimento utilizado para estudiar la actividad en lugar de las estructuras de FtsZ. El Mg²⁺ es necesario para el recambio de GTP en polímeros FtsZ. Por lo tanto, en ausencia de Mg²⁺, FtsZ no hidroliza GTP. Por lo tanto, una muestra sin Mg²⁺ es el control correcto en este ensayo, pero los cationes de Mg están presentes en el tampón de almacenamiento FtsZ. Pueden eliminarse mediante la adición de 1 mM de EDTA a la muestra de control. El paso crítico en este ensayo es el tiempo de incubación. Es importante detener la actividad de FtsZ después de un tiempo determinado. Esto se logra transfiriendo la muestra de FtsZ a una solución verde de malaquita en una placa de 96 pocillos. Sin embargo, el desarrollo del color verde malaquita es un proceso continuo. Por lo tanto, las mediciones deben tomarse al mismo tiempo para cada muestra. Utilizando un protocolo de adición de GTP bien planificado con mediciones tomadas cada 30 segundos de diferencia en un orden establecido, es posible obtener el mismo tiempo de incubación y manipulación de muestras para cada punto de tiempo. Otro paso crítico es elegir la concentración de la proteína para el experimento. En el experimento utilizamos dos concentraciones diferentes para FtsZ_Ec y FtsZ_Bs. La hidrólisis de GTP es mucho más rápida para FtsZ_Ec en comparación con FtsZ_Bs. La actividad de GTPasa de FtsZ_Ec en las condiciones elegidas y a 12 μM es lineal solo durante un máximo de 5 min y después de ese tiempo la tasa de hidrólisis se estabiliza. Por lo tanto, es difícil interpretar los datos del experimento cuando se realiza en estas condiciones. En este caso, FtsZEc debe usarse a una concentración más baja que FtsZ_Bs para poder comparar las actividades de ambas proteínas. La actividad de GTPasa de FtsZs de diferentes fuentes puede variar. Por lo tanto, se debe elegir la concentración correcta. La concentración para la polimerización de FtsZ debe estar muy por encima de la concentración crítica (en general de 2,5 a 10 μM). La dinámica del montaje y desmontaje de FtsZ también es importante. Algunas proteínas muestran un retraso significativo en la polimerización después de la adición de GTP, como se muestra para FtsZB a 50 mM KCl. Es útil realizar el ensayo de dispersión de luz antes del ensayo GTPasa para aproximar el tiempo de montaje y desmontaje de los polímeros FtsZ. Después de eso, se puede elegir el momento de incubación y la concentración de proteínas. Dado que las condiciones elegidas para la polimerización de FtsZ son cruciales, es importante utilizar el pH y la concentración de KCl correctos en cada método. En este trabajo estudiamos 9 tampones diferentes con pH que oscilan entre 6,5 y 7,5 y concentraciones de KCl de 0 M a 300 mM. Notamos que la mejor condición para analizar los FtsZs de B. subtilis y E. coli y su actividad biológica es a un pH cercano al nivel fisiológico (7.5) junto con una alta concentración de KCl. A una alta concentración de KCl, FtsZ tiene una mayor actividad de GTPasa y produce polímeros que son mejor detectables por microscopía electrónica. También confirmamos que el pH fisiológico y una alta concentración de KCl son mejores para el estudio de la interacción entre FtsZ y las proteínas reguladoras que cualquier otro tampón utilizado principalmente para estudiar el ensamblaje de FtsZ. FtsZBs muestra una actividad similar a FtsZEc cuando se estudia a alta concentración de KCl. Además, a baja concentración de sal, la influencia del pH es más visible que en los tampones con alta concentración de sal. FtsZ a veces precipita cuando se usan tampones sin KCl, como resultado, se deben evitar los tampones sin sal. La sedimentación de los polímeros FtsZ es baja cuando se utilizan tampones con altas concentraciones de KCl. Esto puede ser una ventaja cuando se estudian las interacciones entre FtsZ y las proteínas que ensamblan filamentos de FtsZ como SepF y ZapA, ya que estas estructuras de orden superior son fáciles de detectar con centrifugación. En todos nuestros experimentos usamos MgCl₂ a una concentración de 10 mM. Se demostró que una concentración relativamente alta de Mg²⁺ estabiliza los polímeros FtsZ y reduce la actividad GTPasa de FtsZ. En la Tabla 2 se resumen los resultados de varios estudios que describen la polimerización de FtsZ y la actividad de GTPasa a diferentes concentraciones de Mg²⁺ utilizando condiciones tampón idénticas ²⁷. La concentración medida de Mg²⁺ citoplasmático libre es de 0,9 mM³. Debe tenerse en cuenta que GTP quelará una cantidad equivalente de Mg²⁺. Por lo tanto, la concentración óptima de Mg²⁺ para los experimentos de GTPasa es de alrededor de 2-2,5 mM, que está cerca del nivel fisiológico³. Sin embargo, en nuestros experimentos utilizamos MgCl₂ a una concentración de 10 mM para obtener una señal de dispersión de luz fácilmente detectable y estabilizar los polímeros FtsZ durante el ensayo de sedimentación.

Aunque aplicamos nuestros protocolos a FtsZ de los organismos modelo E. coli y B. subtilis, se pueden adaptar a FtsZ de cualquier otro organismo. Debe tenerse en cuenta que el pH fisiológico y las concentraciones de cationes monovalentes y divalentes difieren entre organismos. Por lo tanto, las condiciones óptimas para la polimerización de FtsZ pueden variar. Las diferencias en el tiempo de duplicación y las condiciones de crecimiento de diferentes bacterias pueden dar lugar a diferentes cinéticas de ensamblaje de FtsZ y condiciones óptimas de los experimentos. Sin embargo, nuestro protocolo proporciona un buen punto de partida para los experimentos con FtsZs de otros organismos. Los protocolos deberían ser útiles para el estudio de FtsZ con proteínas reguladoras o el estudio de los efectos de pequeños compuestos y fármacos sobre FtsZ.

Fuente	Polimerización [% de FtsZ sedimentado]	GTPasa [Pi/FtsZ/min]	Concentración de Mg2+ [mM]	Concentración de FtsZ [μM]	Referencias
FtsZEc	~ 28%	~ 2.1	10	12	Este trabajo
	~ 50%	~ 2.4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3.5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4.6	2.5	12.5	27
	ND	~ 5.4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0,8		12	Este trabajo
	~ 52% (con DEAE dextrano)	~ 0.5	10	10	11
	ND	~ 2.25	2.5	5	26

Tabla 2. Efecto sobre el Mg²⁺ sobre la polimerización de FtsZ y GTPasa. Resultados de este trabajo comparados con datos publicados. Todos los experimentos se llevaron a cabo en 50 mM MES/NaOH, pH=6,5, 50 mM KCl.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GTP	Roche	10106399001	Parte 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Tubos de policarbonato de pared gruesa	Beckman Coulter	343776	Parte 2
Optima MAX-XP Ultracentrífuga Beckman	Coulter	393315	Parte 2, 3
Tubo de polialómero con tapa a presión	Beckman Coulter	357448	Parte 3
Paquete biológico AIDA, 1D, 2D, FL	Raytest Isotopenmessgerä te GmbH	15000001	Parte 4
Analizador de imágenes de luminiscencia LAS-4000	Fujifilm		Parte 4
Termo Espectrospectrónico AMINCO-Bowman Espectrómetro de luminiscencia	Spectronic Instruments		Parte 5
Célula de fluorescencia	Hellma Analytics	105-250-15-40	Parte 5
Malla cuadrada 400, cobre, 100/vial	Ciencias de la microscopía electrónica	G400-Cu	Parte 6
Microscopio electrónico CM120 que funciona a 120 kV	Philips		Parte 6
Placa de 96 ml x 0,2 ml	BIOplastics	B70501	Parte 7
Kit de ensayo de fosfato verde de malaquita	Sistema de bioensayo	POMG-25H	Parte 7
Espectrofotómetro de microplaca PowerWave HT	BioTek		Parte 7