Establecimiento de la concentración bactericida mínima de un agente antimicrobiano para las células planctónicas (MBC-P) y las células de biopelícula (MBC-B)

Resumen

Este protocolo permite una comparación directa entre la resistencia planctónica y la de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula in vitro utilizando una placa de microtíter de 96 pozos. Las bacterias planctónicas o de biopelículas están expuestas a diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección. La viabilidad se ensa prueba por el crecimiento en placas de agar.

Resumen

Este protocolo permite una comparación directa entre la resistencia planctónica y la de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula in vitro. Las bacterias se inoculan en los pozos de una placa de microtíter de 96 pozos. En el caso del ensayo planctónico, se añaden diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección a las suspensiones bacterianas. En el ensayo de biopelícula, una vez inoculadas, las bacterias se dejan formar una biopelícula durante un período de tiempo determinado. Las células no unidas se eliminan de los pocillos, se reponen los medios y se añaden diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección. Después de la exposición al agente antimicrobiano, las células planctónicas se ensayan para el crecimiento. Para el ensayo de biopelícula, el medio se actualiza con medios frescos que carecen del agente antimicrobiano y las células de la biopelícula se dejan recuperar. La viabilidad de las células de biopelículas se ensaya después del período de recuperación. El MBC-P para el agente antimicrobiano se define como la concentración más baja de droga que mata las células en el cultivo planctónico.  En contraste, el MBC-B para una cepa se determina exponiendo biopelículas preformadas a concentraciones crecientes de agente antimicrobiano durante 24 horas. El MBC-B se define como la concentración más baja de agente antimicrobiano que mata las células en el biofilm.

Introducción

Los ensayos de resistencia a los antibióticos se desarrollaron inicialmente para probar la resistencia de los cultivos planctónicos (de natación libre) de bacterias. Dado que muchas infecciones bacterianas involucran biopelículas (células adheridas a la superficie), estábamos interesados en desarrollar un método para ensayar la resistencia a los antibióticos específicos de la biopelícula. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de resistencia a los antibióticos son poco adecuados para medir la resistencia de las biopelículas. Por ejemplo, la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) es el patrón oro para determinar la resistencia a los antibióticos de ....

Protocolo

1. MBC-B

1. Cultivo de un biofilm (adaptado de O'Toole⁹).
   1. Cultivar un cultivo de tipo salvaje cepa de interés y cepa mutante durante 16 horas en un medio rico a 37 °C.
   2. Diluir los cultivos saturados durante la noche 1:100 en un medio fresco para ensayos de resistencia a los antibióticos. Un medio estándar para P. aeruginosa es el medio mínimo M63 suplementado con sulfato de magnesio y arginina (ver Tabla 1). Este medio estimula la formación de un biofilm más robusto.
   3. Añadir 100 μl de dilución por pozo en una antena parabólica de microtiter de 96 pozos (ver

Resultados

Se realizaron ensayos MBC-P y MBC-B, comparando la sensibilidad del tipo salvaje PA14 con PA14 ∆ndvB. La tobramicina se utilizó como antibiótico. Se presentan los resultados correspondientes a los pasos 1.4.4 (Figura 1) y 2.3.4 (Figura 2). PA14 y ∆ndvB fueron inoculados en los ensayos MBC-P y MBC-B por triplicado. Después de completar los pasos 1.0-1.4 del protocolo MBC-B y los pasos 2.0-2.3 del protocolo MBC-P, las células viables fueron plateadas sobre una placa de ag.......

Discusión

La resistencia a los antibióticos en las células planctónicas se define como un aumento en la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico debido a un cambio permanente en las células(por ejemplo, una mutación). Los mecanismos de resistencia o tolerancia específicos de la biopelícula que se han identificado hasta la fecha son el resultado de la expresión de genes de tipo salvaje dentro de las biopelículas. Por lo tanto, la definición clásica de resistencia no se aplica a las biopelículas. Sin embargo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x  M63			Prepare como un 5x  Culata M63 disolviendo 15 g de KH2PO4, 35 g de K2HPO4 y 10 g (NH4)2SO4 en 1 L de agua. Este stock no necesita ser esterilizado en autoclave y se puede almacenar a temperatura ambiente. Diluir 5 veces  stock 1:5, autoclave, enfriar, luego agregue los componentes deseados.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Sulfato de magnesio	Fisher	M63-500	Añadir a 1 mM de concentración final.  Preparar como un stock de 1 M en agua y autoclave.
Tobramicina	Sigma		Preparar 50 mg/m  acción. Alícuota y almacenar en -20°C.
Arginina	Sigma	A5131	Añadir hasta una concentración final del 0,4%.  Preparar como un 20% de caldo en agua y filtrar esterilización. Esta fuente alternativa de carbono/energía puede reemplazar la glucosa y los ácidos casamino
placas de microtitulación de 96 pocillos	Corning	3595	Estéril, de fondo plano, de baja evaporación
Tranferpette (pipeta multicanal)	BrandTech	2703610	8 canales, 20-200 μ l
Dispositivo multiclavija	Dan-Kar	MC48	48 clavijas encajan en ½ de una placa de microtitulación de 96 pocillos