El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Resumen

Este trabajo muestra una metodología original basada en el accionamiento a distancia de las partículas magnéticas sembradas en una biopelícula bacteriana y el desarrollo de las pinzas magnéticas específicas para medir in situ las propiedades mecánicas locales de la materia viva complejo construido por los microorganismos en las interfases.

Resumen

La adhesión bacteriana y el crecimiento en las interfaces conducen a la formación de estructuras tridimensionales heterogéneos llamados biopelículas. Las células que habitan en estas estructuras se mantienen juntas por interacciones físicas mediadas por una red de sustancias poliméricas extracelulares. Los biofilms bacterianos impactan muchas actividades humanas y la comprensión de sus propiedades es fundamental para un mejor control de su desarrollo - el mantenimiento o la erradicación - en función de su resultado adverso o beneficioso. En este trabajo se describe una nueva metodología con el objetivo de medir in situ las propiedades físicas locales de la biopelícula que había sido, hasta ahora, el examen sólo desde una perspectiva de material macroscópico y homogénea. El experimento descrito aquí implica la introducción de partículas magnéticas en un biofilm creciente a las semillas sondas locales que pueden ser accionados de forma remota sin molestar a las propiedades estructurales de la biopelícula. Pinzas magnéticas fueron dedicados devellado para ejercer una fuerza definida sobre cada partícula incrustado en la biopelícula. La instalación se monta en el escenario de un microscopio para permitir la grabación de imágenes con lapso de tiempo del período de partículas de arrastre. Las trayectorias de las partículas se extraen entonces de la secuencia de tracción y los parámetros viscoelásticos locales se derivan de cada curva de desplazamiento de partículas, proporcionando de este modo la distribución-3D espacial de los parámetros. Obtener conocimientos sobre el perfil mecánico biofilm es esencial desde el punto de vista de un ingeniero para el control de la biopelícula, sino también desde una perspectiva fundamental para aclarar la relación entre las propiedades arquitectónicas y la biología específica de estas estructuras.

Introducción

Los biofilms bacterianos son comunidades de bacterias asociadas a superficies biológicas o artificiales ^1-3. Se forman por un mecanismo de adhesión-crecimiento, junto con la producción de matriz extracelular rica en polisacáridos que protege y estabiliza el edificio ^4,5. Estos biofilms no son simplemente conjuntos pasivos de células pegadas a las superficies, pero los sistemas biológicos complejos dinámicos organizados y. Cuando las bacterias cambian de estilo de vida planctónica biofilm, no se observan cambios en la expresión genética y la fisiología celular, así como una mayor resistencia a los antimicrobianos y el anfitrión defensas inmunológ....

Protocolo

1. Cultura de las bacterias y Suspensión Preparación

1. Elige una colonia recién crecido de una placa de agar Lisogenia caldo (LB), inocular en 5 ml de medio LB líquido que contiene 100 μ g / ml ampicilina y 7,5 μ g / ml de tetraciclina y se incuba durante 5-6 horas a 37 ° C en una plataforma de agitación.
2. A continuación, añadir 100 μ l de cultivo bacteriano en 5 ml de medio mínimo (M63B1) suplementado con 0,4% de glucosa y las mismas concentraciones de antibióticos. Incubar este cultivo durante la noche recién diluido a 37 ° C en una plataforma de agitación.
3. Después de 16 horas de incubación, se añaden 100 l de ....

Resultados

Un análisis típico proporcionará la distribución espacial de los parámetros viscoelásticos en la escala de micras en una biopelícula que viven sin molestar a su disposición original. Los resultados típicos se muestran en la Figura 7, donde los valores de J ₀ - se dan como una función del eje z a lo largo de la profundidad y de la eje y a lo largo de una dimensión lateral de la biopelícula - el cumplimiento elástica. Cada punto corresponde a una perla que el análisis de la curva de fluencia ha.......

Discusión

Esta partícula magnética de la siembra y tirando experimento habilitado en la cartografía 3D in situ de los parámetros viscoelásticos de un biofilm creciente en su estado original. Este enfoque reveló la heterogeneidad mecánica de la E. coli biofilm crecido aquí y dio pistas para señalar los componentes de biopelículas que soportan las propiedades físicas del biofilm, lo que sugiere fuertemente una implicación fundamental de la matriz extracelular y con mayor precisión su grado de reticulación.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tabla 1: Reactivos y células
Partículas magnéticas	Life technologies	14307D	Partícula magnética micrométrica, 2.8 y micro; m diámetro
Ampicilina (Antibiótico)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetraciclina (Antibiótico)	Sigma-Aldrich	87128
Cepa bacteriana MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, Francia		Produce F pili en su superficie, resistente a la ampicilina y a la tetraciclina.
Tabla 2: Capilares y tubos
Filtros para perfusión pediátrica	Capilares Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Metal	Composite Scientific	8280-100	Fabricado en vidrio de borosilicato. Cuadrado 0,8 mm x 0,8 mm
Tubo peróxido de silicona	VWR international	228-0512	Diámetro 1 mm
Tubo peróxido de silicona	VWR international	228-0700	Diámetro 3 mm
Mesa 3: Crecimiento de biofilm Solución de
caldo de lisogénia (LB)	Amresco-VWR	J106-10PK	Medio estándar utilizado para cultivar bacterias.
Solución M63B1	Medio mínimo estándar casero		utilizado para cultivar bacterias.
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Se utiliza para fabricar el medio M63B1 con un 0,4% de glucosa.
Tabla 4: Cámara electrónica
EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Controlador de calentador	Instrumentos de precisión mundial	300354
Generador de funciones	Agilent technologies	33210A Amplificador
potencia	Hecho en		Da una señal de corriente con amplitudes de hasta 4 A.
Bombas de jeringa	Kd Scientific	KDS-220
Obturador	Vincent Associates	Uniblitz T132
Pinzas magnéticas	Hecho		en casa Dos polos electromagnéticos, cada uno hecho de una bobina de cobre con 2.120 vueltas de alambre de cobre de 0,56 mm de diámetro y núcleos de aleación magnética blanda (Supra50-Arcelor Mittal, Francia) de forma cuadrada según el plano que se muestra en Figura 10. Los dos núcleos están montados en el polo norte orientados hacia el polo sur, con el fin de generar una fuerza magnética en una dirección a lo largo de la longitud del capilar. Vea los detalles del cableado de la bobina en Figura 11.
Tabla 5:
Óptica Microscopio invertido	Objetivo Nikon	TE-300
S Fluor x40 (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		Este es un objetivo de larga distancia de trabajo que permite la observación de la biopelícula en la profundidad.
Filtros de epifluorescencia: 1) para fluorescencia verde: Exc 480/20 nm; 495 DM; EM 510/20  2) para fluorescencia roja: Exc 540/25 nm; 565 DM; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	El desplazamiento de las partículas tras la aplicación de la fuerza se registra utilizando el bloque de filtro de fluorescencia roja.
Tabla 6: Análisis de imágenes
ImageJ	NIH - plugin

de casa de seguimiento de partículas