Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Los métodos para la modulación y Análisis de NF-KB dependiente de la neurogénesis adulta

13.2K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/50870

⸱

13 de febrero de 2014

En este artículo

Resumen

Se describen métodos para la manipulación y análisis de NF-kappa B dependiente de neurogénesis en el hipocampo adulto. Un protocolo detallado se presenta para una prueba de comportamiento circunvolución dentada-dependiente (denominado el patrón espacial de separación-Barnes laberinto) para la investigación de resultado cognitivo en ratones. Esta técnica también debería ayudar a permitir investigaciones en otros parámetros experimentales.

Resumen

El hipocampo desempeña un papel fundamental en la formación y consolidación de los recuerdos episódicos, y en la orientación espacial. Históricamente, el hipocampo adulto ha sido vista como una región anatómica muy estática del cerebro de los mamíferos. Sin embargo, hallazgos recientes han demostrado que el giro dentado del hipocampo es un área de enorme plasticidad en los adultos, con la participación no sólo de las modificaciones de los circuitos neuronales existentes, sino también la neurogénesis adulta. Esta plasticidad está regulada por redes de transcripción complejas, en la que el factor de transcripción NF-kB desempeña un papel prominente. Para estudiar y manipular la neurogénesis adulta, un modelo de ratón transgénico para la inhibición neuronal del cerebro anterior-específica de la actividad de NF-kappa B puede ser utilizado.

En este estudio, se describen métodos para el análisis de la neurogénesis NF-KB dependiente, incluyendo sus aspectos estructurales, la apoptosis neuronal y la proliferación de células progenitoras, y la significación cognitiva, which se evaluó específicamente a través de un giro dentado (DG) dependiente de la prueba de comportamiento, el patrón espacial de separación-Barnes laberinto (SPS-BM). El protocolo de MSF-BM podría ser simplemente adaptado para su uso con otros modelos de animales transgénicos diseñados para evaluar la influencia de los genes particulares en la neurogénesis del hipocampo adulto. Además, MSF-BM podría ser utilizado en otros entornos experimentales destinados a investigar y la manipulación de aprendizaje DG-dependiente, por ejemplo, el uso de agentes farmacológicos.

Introducción

Ontológicamente, el hipocampo es una de las estructuras cerebrales anatómicas más antiguos conocidos. Es responsable de diversas tareas complejas, como las funciones clave en la regulación de la memoria a largo plazo, la orientación espacial y la formación y consolidación de la memoria respectiva. Anatómicamente, el hipocampo consiste en capas de células piramidales (estrato piramidal), incluyendo el cuerno de Ammonis (CA1, CA2, CA3, CA4 y) regiones y la circunvolución dentada (dentatus circunvolución), que contiene las células granulares y unos progenitores neuronales dentro de su zona subgranular . Las células granulares proyectan hacia la región ....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Declaración de Ética

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las normas del comité uso cuidado de los animales y gubernamental, LANUV del estado Renania del Norte-Westfalia, (Düsseldorf, Alemania). Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por LANUV, Düsseldorf bajo el número de licencia 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la angustia y el número de animales necesarios para el estudio.

1. Cuidado de Animales y Vivienda

  1. Todos los animales utilizados en los protocolos descritos en el presente documento deben mantenerse en condicion....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El cruzamiento de las IkB / - líneas de ratones transgénicos y TTA conduce a la inhibición condicional de la actividad de NF-kappa B en el hipocampo.

Para investigar la expresión de la IκBα-AA1-transgén en el ratón transgénico doble (Figura 1A), se aislaron, cryosectioned y se tiñeron utilizando un anticuerpo frente a GFP (proteína verde fluorescente) cerebros. Microscopía confocal de barrido láser reveló una alta expresión del transgén en las regiones CA1 y.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Neurogénesis adulta, y la posibilidad de su manipulación a través de la inhibición de NF-kB en las neuronas, y su reactivación posterior a través de la doxiciclina, ofrece un sistema fascinante para la investigación de las neuronas recién nacidas en el cerebro adulto, así como en la neuronal, y de re-generación . La belleza de este sistema es que la inhibición de la vía de señalización NF-kB en las neuronas no sólo se traduce en cambios en la muerte neuronal celular, la proliferación de progenitores y la migración, y se.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Damos las gracias a Angela Kralemann-Köhler por su excelente apoyo técnico. El trabajo experimental descrito en este documento se llevó a cabo en nuestro laboratorio y el apoyo de subvenciones del Consejo de Investigación Alemana (DFG) a CK y BK y una subvención del Ministerio alemán de Investigación y Educación (BMBF) de BK.

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Moria MC17 Cuchara perforada FST10370-18extracción de los cerebros
Microscopio de disecciónCarl ZeissStemi SV8extracción de los
cerebros Tijeras quirúrgicas FST14084-08extracción de los cerebros
Tijeras quirúrgicas FST14381-43extracción de los cerebros Pinza
Dumont #5FST11254-20de los
cerebros SuperFrost SlidesCarl Roth1879portaobjetos para inmunohistoquímica
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
fijador Compuesto TissueTek OCTSakura Finetek1004200018incrustación de los cerebros
Suero normal de cabraBloqueo de Jackson Immunolabs005-000-001en IHQ
Suero normal de conejoJackson Immunolabs011-000-001en IHQ
Suero normal de burroJackson Immunolabs017-000-001Bloqueo en IHC
anticuerpo anti-Neurofilamento-MEstudios del desarrollo Banco de hibridomas2H3IHC, dilución 1:200
anti-Doublecortin  anticuerposc-8066Santa CruzIHC, Dilución 1:800
anticuerpo anti-GFPAbcamab290IHC, Dilución 1:2.000
anticuerpo anti-BrdUOBT0030GAccurate ChemicalsIHC, Dilución 1:2.000 
Fluoro-Jade CFJ-CHistoChemDeterminación de la muerte celular neuronal
BetadineMundipharmaD08AG02 desinfectante
CriomicrótomoLeicaCM1900preparación de cortes de cerebro
Heparina sal sódicaSigma-AldrichH3393perfusión
Placa circular de plástico duro (diámetro 120 cm)Hecho enlaboratorioningunaplaca para SPS-BM, diámetro 120 cm
Buraton desinfectante rápido Schü lke Mayr113 911desinfectante
Sistema de seguimiento de video TSE VideoMot 2 con paquete de software VideoMot2Sistemas TSE302050-SW-KITseguimiento y análisis de SPS-BM
Triton X-100 Sigma AldrichT8787permeabilización/IHC
CryotomeReichert Jung/LeicaFrigomobil 1206preparación de 40 µ m Cortes de cerebro
Mowiol 4-88Carl RothArt.-Nr. 0713Incrustación de las diapositivas
SYTOX verdeInvitrogenS7020Tinción nuclear
Pellets de alimentos (Kellog's Froot Loops)Kellog'sSPS-BM
Prism, versión 3.0Graph Pad Software, San Diego, EE. UU.Evaluación estadística del software SPS-BM
Zen 2008 o Zen 2011Carl ZeissSoftware (Microscopio confocal)
D.P.XSigma-Aldrich317616medio de montaje para la tinción de Fluoro-Jade C
extracción

Referencias

  1. Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
  2. Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brai....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

NF-kappa Bseparación de patrones espacialeslaberinto de Barnesmicroscopía confocalanálisis histológicoratones transgénicosgiro dentadopruebas conductualestinción por inmunofluorescencia