Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Resumen

Se describen dos métodos para asignar las señales de resonancia magnética nuclear de α y ε-dimetilamina de una lisina N-terminal reductivamente ^{metilada con 13}C. Un método utiliza la selectividad inducida por el pH de la reacción de metilación reductora, y el otro utiliza la aminopeptidasa para eliminar selectivamente la lisina N-terminal.

Resumen

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica probada para estudios dinámicos y de estructura de proteínas. Para estudiar proteínas con RMN, los isótopos magnéticos estables se incorporan metabólicamente para mejorar la sensibilidad y permitir la asignación secuencial de resonancias. La metilación reductiva de ¹³C es un método de etiquetado alternativo para proteínas que no son susceptibles a la sobreexpresión del huésped bacteriano, el método más común de incorporación de isótopos. La metilación reductiva ^{de 13}C es una reacción química realizada en condiciones suaves que modifica los grupos amino primarios de una proteína (grupos ε-amino lisina y el grupo α-amino N-terminal) a ¹³grupos C-dimetilamino. La estructura y función de la mayoría de las proteínas no se ven alteradas por la modificación, lo que la convierte en una alternativa viable al marcaje metabólico. Debido a que la metilación reductiva de ¹³C agrega etiquetas isotópicas dispersas, los métodos tradicionales de asignación de las señales de RMN no son aplicables. Se ha desarrollado un método de asignación alternativo que utiliza espectrometría de masas (MS) para ayudar en la asignación de señales de RMN de proteína ¹³C-dimetilamina. El método se basa en cantidades parciales y diferentes de ¹³C-marcaje en cada grupo de aminoácidos primarios. Una limitación del método surge cuando el residuo N-terminal de la proteína es una lisina porque los grupos α y ε-dimetilamino de Lys1 no se pueden medir individualmente con MS. Para eludir esta limitación, se describen dos métodos para identificar la resonancia de RMN de las ¹³C-dimetilaminas asociadas tanto con la α-amina N-terminal como con la ε-amina de cadena lateral. Las señales de RMN de la α-dimetilamina N-terminal y la ε-dimetilamina de cadena lateral de la lisozima de clara de huevo de gallina, Lys1, se identifican en espectros de coherencia cuántica simple heteronuclear 1 ^H-13C.

Introducción

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) es una valiosa herramienta de elucidación de estructuras para proteínas¹. La espectroscopia de RMN se puede utilizar para determinar la estructura de la solución de una proteína en su estado nativo. Para superar la baja abundancia natural de isótopos magnéticos estables, es necesario incorporar ¹³C y ¹⁵N a la proteína de interés. El método más común empleado es la expresión recombinante en un huésped bacteriano^2-3. Sin embargo, dos desventajas de la sobreexpresión del huésped bacteriano son que no puede producir modificaciones postraduccionales y no funciona para todas ....

Protocolo

1. Metilación reductiva de la lisozima

1. Preparar 500 ml de un tampón de fosfato sódico de 50 mM a pH 7,5. Almacene a temperatura ambiente.
2. Etiquete tres tubos de microcentrífuga de 1 ml para muestra completamente marcada (FLS), muestra parcialmente marcada (LpH) de pH bajo y muestra parcialmente marcada con pH alto (HpH).
3. Pesar 10 mg de lisozima y disolver en 2 ml de tampón de fosfato de sodio para crear una solución acuosa con una concentración de 5 mg/ml. Cubra los tubos con papel de aluminio para proteger el formaldehído de la degradación debida a la exposición a la luz. Añadir 500 μl de solución de lisozima a cada tubo.
4. Pre....

Resultados

Metilación reductiva y pH

Se ha demostrado una reacción quimioselectiva de metilación reductiva inducida por pH con ¹³C en la lisozima. A pH bajo, la reacción prefiere la α-amina del extremo N-terminal sobre las ε-amino de las cadenas laterales, y viceversa a pH alto. En solución, los grupos amino de la proteína existen en equilibrio entre la amina libre y su ácido conjugado, equilibrio que puede ajustarse mediante el pH. El rango óptimo de pH para esta reacción depende del ag.......

Discusión

Es necesario asignar las señales de RMN de ¹³proteínas C metiladas de forma reductiva para utilizar completamente este método de etiquetado isotópico. El uso de MS para ayudar en la asignación de las señales de RMN a través de la correlación de los datos parciales de ^{incorporación de 13}C es una técnica prometedora. La ventaja de esta técnica sobre otros métodos de asignación es que solo se necesita la secuencia primaria de aminoácidos. El método de asignación asistida por MS está limitado cuando el .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetonitrilo	Sigma	34851
Amicon Ultra Filtro centrífugo de 4 ml (3k MWCO)	Fisher Scientific UFC800308	(8pk)
Aminopeptidasa	Creative Biomart	Aminopeptidasa-86A
Bicarbonato de amonio	Sigma	A6141
Sulfato de amonio	Sigma	A5132
Complejo de borano-dimetilamina	Sigma 180238		Prepare una solución fresca de 1 M antes de usar.
Ácido bórico	Sigma	B6768
Insulina de páncreas bovino	Sigma	I5500
C18 Columnas de centrifugado	Thermo Scientific	89870
Óxido de deuterio	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-4-100
1,2-dicloroetano-13C2	Sigma	714321	Solución madre de 80 mM almacenada a -80 °C. Utilizada como referencia en espectros de RMN a 24 mM.
Formaldehído (36.5% wt/wt)	Sigma	33220	Prepare una solución fresca de 1 M antes de usar.
13C-formaldehído (99%)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-806-1	Prepare una solución fresca de 1 M antes de usar.
Lisozima (clara de huevo de gallina)	Sigma	L6376
Fosfato de sodio (heptahidrato dibásico)	Sigma	S9390
Fosfato de sodio (monobásico)	Sigma	S9638
Tricina	Sigma	T0377
Ácido trifluoroacético	Sigma	302031
700 MHz Varian VNMRS con sonda HCN 5922 de 5 mm	Agilent Tecnologías
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF	Bruker