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Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

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DOI:

10.3791/50880

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18 de noviembre de 2013

 , 
1Department of Medicine, University of Dresden, 2Center for Regerative Therapies Dresden

En este artículo

Resumen

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Resumen

Un trabajo reciente demuestra que el sistema nervioso central (SNC) la regeneración y la tumorigénesis involucra poblaciones de células madre (SCS) residentes en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos de estas células normalmente quiescentes emplean para garantizar el buen funcionamiento de las redes neuronales, así como su papel en la recuperación de la lesión y la mitigación de los procesos neurodegenerativos son poco comprendidos. Estas células residen en las regiones a que se refiere como "nichos" que ofrecen un ambiente sustentable que implica señales moduladoras tanto de la vascular y el sistema inmunológico. El aislamiento, el mantenimiento, y la diferenciación de las SC SNC bajo condiciones de cultivo empleadas que excluyen factores desconocidos, los hace accesibles a tratamiento por medios farmacológicos o genéticos, lo que proporciona una idea de su comportamiento in vivo. Aquí le ofrecemos información detallada sobre los métodos para la generación de culturas de las SC SNC desde distintas regiones del cerebro adulto y enfoques para evaluar su dpotencial ifferentiation en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro. Esta técnica produce una población de células homogénea como un cultivo en monocapa que se puede visualizar para estudiar las SC individual y su progenie. Además, se puede aplicar a través de diferentes sistemas de modelos animales y muestras clínicas, siendo utilizado previamente para predecir respuestas regenerativas en el sistema nervioso adulto dañado.

Introducción

El dogma central de la neurobiología, establecido por las observaciones fundamentales de la citoarquitectura cerebral realizada por Ramón Y. Cajal hace más de un siglo, sostuvo que la neurogénesis es poco probable después de la adolescencia debido a la complejidad de las redes neuronales que se encuentran en el sistema nervioso central 1. A pesar del trabajo de Altman en la década de 1960, y más tarde de Kaplan, lo que demuestra que 3 H-timidina se pudo encontrar en neuronas maduras que indican que, de hecho, las neuronas se generaban en distintas áreas del cerebro adulto, el dogma continuó manteniendo 2, 3. Evidencia continuó creciendo con la investigación de Nottebohm describiendo los cambios estacionales en el número de neuronas presentes en los cerebros de pájaros cantores 4. No fue sino hasta 1999, cuando Gould et al. Trabajo publicado en la generación de neuronas en el hipocampo aumenta con el desempeño de las tareas de aprendizaje asociativo, en la rata, así como las observaciones de Kornack y Rakic ​​demostraciónTing continuó la neurogénesis en el macaco adulto que el concepto de un cerebro menos rígida, más plástico, se reconoció 5, 6.

La búsqueda de la fuente celular para estas neuronas generadas de novo condujo al descubrimiento de una discreta población de células madre (SCS) que residen en áreas del cerebro conocida como nichos 7. La zona subventricular y la zona granular sub del hipocampo se considera que son las dos principales regiones neurogénicas 8,9. Las células aisladas de estos lugares muestran la característica clásica de las SC derivados embrionarios o fetales, la auto-renovación y diferenciación potencial. En el caso de las células madre neurales (NSC), que pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Además, estos SC tinción positiva para los marcadores NSC fetales, tales como la proteína de los filamentos intermedia nestina 10. Trabajos más recientes destaca que las SC no puede estar limitada a estos two áreas, y están, de hecho, localizada en el cerebro como una población en gran parte inactiva de células estrechamente asociadas con la vasculatura 11.

Las observaciones de que las SC se movilizan en respuesta a la lesión sugiere la posibilidad de ser capaz de utilizar estas células con fines regenerativos para ayudar en la recuperación de los trastornos neurodegenerativos y los accidentes cerebrovasculares 12, 13. Esto no es a diferencia de la función que las células madre mesenquimales (MSCs) juegan en la curación de los tejidos conectivos, que se encuentran como células perivasculares que tienen el potencial de convertirse en osteoblastos, condrocitos, y células de tejido adiposo 14. Sin embargo, NSC no pueden ser cosechadas en la misma forma que las MSC de la médula ósea por aspiración de rutina y técnicas de centrifugación en gradiente de densidad y posteriormente utilizados en terapias basados ​​en células autólogas. Como consecuencia, otras fuentes de células, tales como el uso de NSC fetales o precursores neuronales derivadas de embcélulas madre ryonic han explorado extensivamente en enfermedades de los animales y modelos de lesión con diversos grados de éxito 15. Tecnologías de células madre pluripotentes inducidas que utilizan fuentes de células somáticas ofrecen otra vía potencial para la producción de terapias basadas en células terapéuticamente útiles para una amplia gama de aplicaciones, la superación de la limitada disponibilidad y preocupaciones éticas con respecto al uso de células embrionarias y tejidos fetales 16. Sin embargo, la traducción clínica de estos hallazgos ha demostrado ser una tarea difícil, como se demuestra en las luchas de el tratamiento de diversas enfermedades neurológicas con terapéutica basada en SC enfoques 17,18, así como un camino tortuoso a la aprobación regulatoria. Como un enfoque alternativo, la introducción de los tratamientos farmacológicos específicos puede modular los números de NSC y facilitar la recuperación en los modelos de la enfermedad de Parkinson y accidente cerebrovascular 19. Cualquiera que sea la estrategia podría ser, entendiendo cómo manipular eficazmente estas célulasrequiere un sistema accesible in vitro.

Culturas del NSC se pueden realizar ya sea como agregado culturas, también conocidos como neuroesferas, o como una monocapa 8,20. Ambas técnicas se han utilizado ampliamente, lo que permite el establecimiento de condiciones de cultivo definidos, es decir, el uso de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) como una fuente de mitógeno, que proporcionan para la expansión de precursores multipotentes. Mientras que los cultivos de neuroesferas pueden ser más adecuados para el estudio de la capacidad de propagación clonal de un tipo de célula aislada, el sistema se ha demostrado que produce una población mixta de células durante la expansión 21. Además, la estructura cerrada de neuroesferas hace que la manipulación farmacológica de las células poco práctico, y la interpretación de la influencia de estos factores pueden tener podría ser confundido por el microambiente establecido dentro de la propia neuroesfera. Los cultivos monocapa, por otro lado, pueden serempleado en las pantallas de alto rendimiento de bibliotecas de pequeñas moléculas, que proporciona una poderosa herramienta para explorar los mecanismos de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación SC y se abre la oportunidad de descubrir nuevos compuestos que se dirigen específicamente a esta población celular.

Como consecuencia, la capacidad de generar de forma reproducible culturas de NSC adultos de diferentes regiones de interés en el cerebro se puede utilizar en un amplio espectro de aplicaciones de investigación, que van desde los estudios del desarrollo del sistema nervioso central (SNC) para explorar enfoques de medicina regenerativa nuevos . El protocolo presentado aquí muestra cómo diseccionar y evaluar el potencial de diferenciación de las SC SNC aislados del cerebro de roedores adultos.

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Protocolo

El trabajo se adhiere a la Declaración de Helsinski y la Declaración Animal ARVO. Los animales fueron utilizados para la recogida de tejido y se siguieron todos los procedimientos pertinentes de acuerdo con las instrucciones del Bioterio de la Universidad de Dresde. Los animales fueron tratados y acomodados de acuerdo con las pautas federales alemanes para el uso y cuidado de animales de laboratorio, y el estudio fue aprobado por el Landesdirektion Dresden. Por favor, consulte con la política veterinaria de su institución (IACUC o el otro tablero) con respecto a la metodología de la eutanasia apropiada.

Títulos concretos y las concentraciones de trabajo de los reactivos se pueden encontrar en las Tablas de reactivos que acompañan este protocolo.

1. Dish Cultura Preparación

  1. Platos capa con un volumen suficiente de 75 mg / ml de poli-L-ornitina (es decir, 2 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos) durante la noche en la incubadora de cultivo celular 2 días antes de la fecha programada de disección.
  2. Aspirar el poli-L-ornitina el siguiente día y lavar cada pocillo 2 veces con 3 ml de PBS durante 5 min.
  3. Retire el lavado final, a continuación, agregar la fibronectina (diluido 1:250, 4 g / ml en PBS) a la placa y colocar los platos en la incubadora durante la noche.
  4. Aspirar la fibronectina en el día de la disección y lavan los platos 2x con PBS. Vuelva a poner las placas todavía contienen la PBS de lavado final a la incubadora hasta que el tejido disociado está listo para el cultivo. En ese tiempo, retirar el PBS antes de la galjanoplastia del tejido.
  5. Placas tienda recubiertos con poli-L-ornithinein la incubadora durante un máximo de 3 semanas. Las placas recubiertas con fibronectina pueden almacenarse hasta por 1 semana. Recubrimiento fibronectina se puede hacer en tan sólo 2 horas en caso de urgencia. La fibronectina es susceptible a la desnaturalización; no agitar la solución o permiten secado de la vajilla.

2. Disección / Revestimiento

  1. Este protocolo se aplica a la utilización de 3 ratas adultas (3-6 meses de edad).
  2. ChilL el cerebro de seccionamiento de bloques en hielo antes de la eutanasia de la rata.
  3. Colocar un tubo Falcon de 15 ml que contiene 5 ml de medio N2 con adición de bFGF en hielo.
  4. La eutanasia a las ratas de acuerdo con la política veterinaria de su institución.
  5. Retire el cerebro contra el cráneo al hacer una incisión en la línea media de la cabeza. El uso de fórceps para despegar el hueso que permite al cerebro a extraer con cuidado.
  6. Coloque el cerebro en un plato de Petri de 10 cm que contiene hielo frío PBS. Esto eliminará cualquier pelo residual y sangre. (Figura 1A)
  7. Coloque el cerebro en el bloque de corte frío. (Figura 1B)
  8. Inserte una nueva hoja de afeitar limpia en el bloque como se muestra en la Figura 1C.
  9. Inserte una segunda mm caudal de afeitar limpia hoja 3 a la primera, como se ilustra en la Figura 1D.
  10. Levante con cuidado las hojas de la manzana, llevando con ellos la sección de interés.
  11. Flote el secCIÓN fuera de la hoja por inmersión en PBS. (Figura 1)
  12. Tejido de cosecha de la zona de interés (en este ejemplo se utiliza la comisura anterior, (anterior) ACA, Figura 1F) usando # 5 pinzas y recoger en un tubo cónico de 15 ml que contiene 1 ml de medio N2 contiene bFGF.
  13. Mueva el tubo en una campana de cultivo de células de flujo laminar, continua el resto del protocolo en condiciones estériles.
  14. Mecánicamente disociar el tejido usando una punta de pipeta de 1 ml unido a una pipeta P1000. De pipeta arriba y abajo varias veces (aproximadamente 20x a una velocidad de 1 ciclo de pipeteado por segundo) mientras presiona la abertura de la punta de la pipeta contra la parte inferior del tubo cónico (Figuras 1G 1-3). Deja de trituración cuando la solución se vuelve homogénea.
  15. Deje que la solución repose durante 2 min para permitir que cualquier tejido no disociada grandes se asienten en el fondo. (Figura 1G 4)
  16. Recoger el homogeneous sobrenadante y colocar en un tubo cónico que contiene 8,5 ml de medio N2 más 20 ng ml bFGF /, 500 ng ml Dll4 /, 500 ng / ml Ang2 y 200 nMJAK inhibidor.
  17. Placa de ellos en 3 pocillos de una placa de 6 pocillos usando 3 ml de solución diluida de células / pocillo.
  18. Colocar la placa en un incubador de células humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2, 5% de O 2.

3. Cuidado Diario

  1. Sustituya el medio en las placas de cultivo con N2 medio que contiene bFGF, Ang2, Dll4 y JAK inhibidor de 24 horas después de la siembra.
  2. Añadir un bolo de bFGF, Dll4, Ang2, y el inhibidor de JAK en el día siguiente.
  3. Continúe con este proceso de alternancia de los cambios de medios y adiciones de los factores para un total de 10 a 14 días.

4. Inducción de la diferenciación

  1. Retirar bFGF, Dll4, Ang2 y JAK inhibidor que contiene medio y sustituirlo por medio N2 que no contiene ningún factor adicional.
  2. Cambie el medio cada dos días.
  3. Fijar las células después de 10 días y realizar inmunocitoquímica.

5. La detección inmunocitoquímica

  1. Aspirar el medio y fijar placas de cultivo de células con 2 ml de 4% de paraformaldehído durante 20 min.
  2. Lavar 2x con 3 ml de PBS durante 5 min cada uno.
  3. Aspirar PBS, a continuación, permeabilizar las células y bloquear mediante la adición de 2 ml de PBS que contenía 5% de suero normal de burro (NDS) y 0,1% de Triton X-100 durante 20 min.
  4. Preparar la mezcla de anticuerpo primario en PBS que contenía 5% de NDS. El anticuerpo anti-nestina se puede utilizar para la identificación de los SC, mientras que TuJ1 (clase III β-tubulina), los anticuerpos GFAP, y CNPase se puede utilizar junto para un triple tinción de marcadores de diferenciación.
  5. Aspirar la solución de bloqueo y añadir 1,5 ml de la mezcla de anticuerpo primario a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 90 min.
  6. Eliminar los anticuerpos primarios y lavar 2 veces con 3 ml de PBS, y 1x con 3 ml de PBS que contenía 5% de NDS durante 5 min cada uno.
  7. Prepare la secundaria de anticuerpos en PBS que contenía 5% de NDS.
  8. Aspirar el lavado final y añadir 1,5 ml de solución de anticuerpo secundario a cada pocillo. Incubar en la oscuridad durante 40 min a temperatura ambiente.
  9. Retire la solución de anticuerpo secundario y agregar 2 ml de una mancha DAPI recién preparada (500 ng / ml en PBS). Incubar durante 3 min.
  10. Aspirar la solución DAPI luego lavar 3 veces con 3 ml de PBS durante 5 minutos cada uno. Las células pueden ahora ser visualizadas con un microscopio de fluorescencia.

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Resultados

Identificación de la región de interés de la que para cosechar las células madre neurales es el primer paso crítico y definirá la cantidad de tiempo que tarda en llegar una placa confluente de células. Por ejemplo, la SVZ es una zona neurogénica clásico y por lo tanto tiene una mayor proporción relativa de células madre neurales. Sin embargo, la técnica presentada aquí se puede utilizar con otras regiones no reconoce a menudo como teniendo un potencial neurogénica robusto durante la edad adulta. A los fines de este prot...

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Discusión

Muchos de los pasos críticos de éxito en el aislamiento, expansión y diferenciación de las células madre neurales del cerebro adulto se comparten en común con las técnicas de cultivo de tejidos. El objetivo a tener en cuenta es que los comités directivos nacionales aisladas del cerebro adulto deben mantener la mayor cantidad de sus características in vivo como sea posible (Figura 2J). A menudo, un equilibrio entre la necesaria cautela y velocidad adecuada necesita ser golpeado. Cuidado con el a...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado (en parte) por el Helmholtz Alianza ICEMED - Imágenes y Enfermedades Metabólicas de curado ambiental, a través del Fondo de Iniciativa y Red de la Asociación Helmholtz, una beca de la Fundación Else Kroener-Fresenius, y una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Las células en los tejidos).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillosBD Biosciences353934
Poli-L-ornitinaSigma-AldrichP-3655

5 mg/ml solución madre preparada en agua bidestilada (estable durante varios meses a -20 & grados; C).

Concentración de trabajo 0,5 mg/ml en agua (estable durante 1 mes a 4 & grados; C).

FibronectinaR& D Systems1030-FnNo agite la solución madre
Aparatode filtración Corning Life Sciences430769
DMEM/F-12Mediatech10-090-CVConsulte la nota a continuación para la preparación completa de los medios de N2
Apo-transferrinaSigma-AldrichT-2036
InsulinaSigma-AldrichI-0516
PutrescinaSigma-AldrichP-5780Solución madre de 1 M en ddH2O (estable a 20 & grados; C durante 6 meses)
Selenito de sodioSigma-AldrichS-5261500 y micro; Solución madre M en ddH2O (estable a -20 ° C durante 6 meses)
ProgesteronaSigma-AldrichP-8783100 µ M solución madre en etanol (estable a -20 ° C durante 6 meses)
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen15140-122
Solución salina tamponada con fosfatoMediatech21-040-CV
Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)R& D Systems233-FB Concentración detrabajo 20 ng/ml 
Delta4 (Dll4)R& D Systems1389-D4 Concentración detrabajo  500 ng/ml
Angiopoetina 2 (Ang2)R& D Systems623-ANConcentración de trabajo  500 ng/ml
Inhibidor de JAKCalbiochem 420099Concentración de trabajo 200 nM 
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA-2058
Tubos cónicos de 15 y 50 mlCorning Life Sciences430053, 430829
Otros artículos necesarios incluyen: Instrumentos generales de disección, incluyendo cuchilla de afeitar y pinzas, Rata adulta (3-6 meses de edad; Sprague-Dawley o Long Evans), cámara de intoxicación de CO2, Campana de flujo laminar para cultivo celular e incubadora Incubadora (humidificada, 37 ° C, 5% CO2, 5% O2). Nota: Para una preparación completa de medios N2, a un frasco de DMEM/F-12 (500 ml) agregue 0,05 g de apotransferina, 0,0125 g de insulina (recién disuelta en 1 ml de 10 mM de NaOH), 50 μ l de putrescina, 30 μ l de selenito de sodio, 100 μ l de caldo de progesterona y 5 ml de solución de penicilina/estreptomicina. Ajuste el pH a 7.2, si es necesario. Filtre-esterilice y almacene a 4 ° C hasta por 3 semanas y proteger de la luz.
Tabla de reactivos de inmunofluorescencia
ParaformaldehídoMicroscopía Electrónica Ciencias15719
Suero de burro normal (NDS)Sigma-AldrichD-9663
Triton X-100Sigma-AldrichT-8787
4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-AldrichD-84175 mg/ml stock solución en metanol
Tabla de anticuerpos primarios
NestinaChemiconMAB353

Factor de dilución: 1:400

Especie: Ratón IgG1

Hes3Santa Cruzsc-25393

Factor de dilución: 1:100

Especie: Conejo IgG

Sox2R& D SystemsMAB2018

Factor de dilución: 1:100

Especie: Ratón IgG2a

CNPasaChemiconMAB326

Factor de dilución: 1:200

Especie: Ratón IgG1

β-tubulina III (TUJ1)R& D SystemsMAB1195

Factor de dilución: 1:500

Especie: Ratón IgG2a

Proteína ácida fibrilar glial (GFAP)Dako North AmericaZ0334

Factor de dilución 1:500

Especie: Conejo

Tabla de anticuerpos secundarios
Alexa    568InvitrogenA-21124

Factor de dilución: 1:200

Especie: Cabra anti ratón IgG1

Alexa 488InvitrogenA-21131

Factor de dilución: 1:200

Especie: Cabra anti ratón IgG2a

Cy5Jackson ImmunoResearch59883

Factor de dilución: 1:200

Especie: Cabra anti Conejo

Referencias

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