Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.
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Artículo de método
Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores
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Resumen
Resumen
Un trabajo reciente demuestra que el sistema nervioso central (SNC) la regeneración y la tumorigénesis involucra poblaciones de células madre (SCS) residentes en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos de estas células normalmente quiescentes emplean para garantizar el buen funcionamiento de las redes neuronales, así como su papel en la recuperación de la lesión y la mitigación de los procesos neurodegenerativos son poco comprendidos. Estas células residen en las regiones a que se refiere como "nichos" que ofrecen un ambiente sustentable que implica señales moduladoras tanto de la vascular y el sistema inmunológico. El aislamiento, el mantenimiento, y la diferenciación de las SC SNC bajo condiciones de cultivo empleadas que excluyen factores desconocidos, los hace accesibles a tratamiento por medios farmacológicos o genéticos, lo que proporciona una idea de su comportamiento in vivo. Aquí le ofrecemos información detallada sobre los métodos para la generación de culturas de las SC SNC desde distintas regiones del cerebro adulto y enfoques para evaluar su dpotencial ifferentiation en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos in vitro. Esta técnica produce una población de células homogénea como un cultivo en monocapa que se puede visualizar para estudiar las SC individual y su progenie. Además, se puede aplicar a través de diferentes sistemas de modelos animales y muestras clínicas, siendo utilizado previamente para predecir respuestas regenerativas en el sistema nervioso adulto dañado.
Introducción
El dogma central de la neurobiología, establecido por las observaciones fundamentales de la citoarquitectura cerebral realizada por Ramón Y. Cajal hace más de un siglo, sostuvo que la neurogénesis es poco probable después de la adolescencia debido a la complejidad de las redes neuronales que se encuentran en el sistema nervioso central 1. A pesar del trabajo de Altman en la década de 1960, y más tarde de Kaplan, lo que demuestra que 3 H-timidina se pudo encontrar en neuronas maduras que indican que, de hecho, las neuronas se generaban en distintas áreas del cerebro adulto, el dogma continuó manteniendo 2, 3. Evidencia continuó crecien....
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Protocolo
El trabajo se adhiere a la Declaración de Helsinski y la Declaración Animal ARVO. Los animales fueron utilizados para la recogida de tejido y se siguieron todos los procedimientos pertinentes de acuerdo con las instrucciones del Bioterio de la Universidad de Dresde. Los animales fueron tratados y acomodados de acuerdo con las pautas federales alemanes para el uso y cuidado de animales de laboratorio, y el estudio fue aprobado por el Landesdirektion Dresden. Por favor, consulte con la política veterinaria de su institución (IACUC o el otro tablero) con respecto a la metodología de la eutanasia apropiada.
Títulos concretos y las concentraci....
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Resultados
Identificación de la región de interés de la que para cosechar las células madre neurales es el primer paso crítico y definirá la cantidad de tiempo que tarda en llegar una placa confluente de células. Por ejemplo, la SVZ es una zona neurogénica clásico y por lo tanto tiene una mayor proporción relativa de células madre neurales. Sin embargo, la técnica presentada aquí se puede utilizar con otras regiones no reconoce a menudo como teniendo un potencial neurogénica robusto durante la edad adulta. A los fines de este prot.......
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Discusión
Muchos de los pasos críticos de éxito en el aislamiento, expansión y diferenciación de las células madre neurales del cerebro adulto se comparten en común con las técnicas de cultivo de tejidos. El objetivo a tener en cuenta es que los comités directivos nacionales aisladas del cerebro adulto deben mantener la mayor cantidad de sus características in vivo como sea posible (Figura 2J). A menudo, un equilibrio entre la necesaria cautela y velocidad adecuada necesita ser golpeado. Cuidado con el a.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado (en parte) por el Helmholtz Alianza ICEMED - Imágenes y Enfermedades Metabólicas de curado ambiental, a través del Fondo de Iniciativa y Red de la Asociación Helmholtz, una beca de la Fundación Else Kroener-Fresenius, y una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Las células en los tejidos).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos | BD Biosciences | 353934 | |
| Poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P-3655 | 5 mg/ml solución madre preparada en agua bidestilada (estable durante varios meses a -20 & grados; C). Concentración de trabajo 0,5 mg/ml en agua (estable durante 1 mes a 4 & grados; C). |
| Fibronectina | R& D Systems | 1030-Fn | No agite la solución madre |
| Aparato | de filtración Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | Consulte la nota a continuación para la preparación completa de los medios de N2 |
| Apo-transferrina | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| Putrescina | Sigma-Aldrich | P-5780 | Solución madre de 1 M en ddH2O (estable a 20 & grados; C durante 6 meses) |
| Selenito de sodio | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 y micro; Solución madre M en ddH2O (estable a -20 ° C durante 6 meses) |
| Progesterona | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µ M solución madre en etanol (estable a -20 ° C durante 6 meses) |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Mediatech | 21-040-CV | |
| Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) | R& D Systems | 233-FB Concentración de | trabajo 20 ng/ml |
| Delta4 (Dll4) | R& D Systems | 1389-D4 Concentración de | trabajo 500 ng/ml |
| Angiopoetina 2 (Ang2) | R& D Systems | 623-AN | Concentración de trabajo 500 ng/ml |
| Inhibidor de JAK | Calbiochem 420099 | Concentración de trabajo 200 nM | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| Tubos cónicos de 15 y 50 ml | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| Otros artículos necesarios incluyen: Instrumentos generales de disección, incluyendo cuchilla de afeitar y pinzas, Rata adulta (3-6 meses de edad; Sprague-Dawley o Long Evans), cámara de intoxicación de CO2, Campana de flujo laminar para cultivo celular e incubadora Incubadora (humidificada, 37 ° C, 5% CO2, 5% O2). Nota: Para una preparación completa de medios N2, a un frasco de DMEM/F-12 (500 ml) agregue 0,05 g de apotransferina, 0,0125 g de insulina (recién disuelta en 1 ml de 10 mM de NaOH), 50 μ l de putrescina, 30 μ l de selenito de sodio, 100 μ l de caldo de progesterona y 5 ml de solución de penicilina/estreptomicina. Ajuste el pH a 7.2, si es necesario. Filtre-esterilice y almacene a 4 ° C hasta por 3 semanas y proteger de la luz. | |||
| Tabla de reactivos de inmunofluorescencia | |||
| Paraformaldehído | Microscopía Electrónica Ciencias | 15719 | |
| Suero de burro normal (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solución en metanol |
| Tabla de anticuerpos primarios | |||
| Nestina | Chemicon | MAB353 | Factor de dilución: 1:400 Especie: Ratón IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | Factor de dilución: 1:100 Especie: Conejo IgG |
| Sox2 | R& D Systems | MAB2018 | Factor de dilución: 1:100 Especie: Ratón IgG2a |
| CNPasa | Chemicon | MAB326 | Factor de dilución: 1:200 Especie: Ratón IgG1 |
| β-tubulina III (TUJ1) | R& D Systems | MAB1195 | Factor de dilución: 1:500 Especie: Ratón IgG2a |
| Proteína ácida fibrilar glial (GFAP) | Dako North America | Z0334 | Factor de dilución 1:500 Especie: Conejo |
| Tabla de anticuerpos secundarios | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | Factor de dilución: 1:200 Especie: Cabra anti ratón IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | Factor de dilución: 1:200 Especie: Cabra anti ratón IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | Factor de dilución: 1:200 Especie: Cabra anti Conejo |
Referencias
- Cajal, R. Y. Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , Harvard University. (1899).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
- Kaplan, M. S.....
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Reimpresiones y permisos
