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Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

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DOI:

10.3791/50881

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9 de octubre de 2013

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1Department of Hematology and Oncology, University of Göttingen, 2Institute of Neuropathology, University of Göttingen, 3Institute of Anatomy and Cellbiology, University of Halle

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

Resumen

Los pacientes con metástasis cerebrales de los carcinomas tienen un mal pronóstico. Sin embargo, el proceso en el lugar de la metástasis apenas se ha investigado, en particular, el papel de las células del estroma (residente). Los estudios en los carcinomas primarios demuestran la influencia del microambiente en la metástasis, incluso en 1,2 pronóstico. Especialmente los macrófagos asociados a tumores (TAM) la migración de apoyo, la invasión y proliferación 3. Curiosamente, los principales sitios diana de la metástasis poseen los macrófagos específicos de tejido, tales como células de Kupffer en el hígado o la microglía en el SNC. Por otra parte, los sitios metastásicos también poseen otras células específicas de tejido, como astrocitos. Recientemente, los astrocitos se demostraron para fomentar la proliferación y la persistencia de las células cancerosas 4,5. Por lo tanto, las funciones de estos tipos de células específicas de tejido parecen ser muy importante en el proceso de 6,7 metástasis cerebral.

A pesar de estas observaciones,Sin embargo, hasta ahora no hay una adecuada modelo vivo / in vitro disponible en para visualizar directamente las reacciones gliales durante la formación de la metástasis cerebral, en particular, mediante microscopía de campo claro. Reciente en vivo de imágenes en vivo de las células de carcinoma demostraron su comportamiento colonización cerebral 8. Sin embargo, este método es muy laborioso, costoso y técnicamente compleja. Además, este tipo de experimentos con animales se limitan a series pequeñas y cuentan con un considerable estrés para los animales (por implantación de la placa de vidrio, la inyección de las células tumorales, la anestesia repetitivo y fijación a largo plazo). Además, imágenes in vivo hasta ahora se limita a la visualización de las células de carcinoma, mientras que las interacciones con las células residentes aún no se han ilustrado. Por último, las investigaciones de las células de carcinoma humano en animales inmunocompetentes son imposibles 8.

Por estas razones, hemos establecido un sistema de co-cultivo consipicadura de un corte de cerebro de ratón y células epiteliales organotípico incrustado en matrigel (esfera de células en 3D). Las esferas celulares de carcinoma de 3D se colocaron directamente junto al borde de cortes de cerebro con el fin de investigar la invasión del tejido cerebral vecino. Esto nos permite visualizar los cambios morfológicos y de las interacciones entre las células gliales y las células de carcinoma de fluorescencia e incluso por microscopía de campo claro. Después del experimento de cocultivo, el tejido cerebral o los esferoides de células 3D pueden ser recogidos y utilizados para otros análisis moleculares (por ejemplo, QRT-PCR, IHC, o inmunotransferencia), así como para investigaciones por microscopía confocal. Este método se puede aplicar para controlar los eventos dentro de un tejido cerebral para vivir día sin efectos perjudiciales a los cortes de cerebro. El modelo también permite la supresión selectiva y la sustitución de las células residentes por las células de un tejido de un donante para determinar el impacto diferenciado de un determinado genotipo. Por último, el modelo de cocultivo es una alternativa posiblea in vivo enfoques al probar manipulaciones farmacológicas específicas.

Protocolo

Este nuevo modelo es una adaptación de un enfoque de cortes de cerebro organotípicos del hipocampo publicado previamente 9-12. Las modificaciones y adiciones se introdujeron para optimizar las interacciones de tejido de cáncer de células cerebrales y para garantizar la reproducibilidad. El estudio fue revisado y aprobado por el comité de ética local. Los animales fueron tratados cuidadosamente de acuerdo con las directrices para el cuidado de animales de la Medicina de la Universidad de Gotinga. El organotípico cocultivo de cortes de cerebro se puede subdividir en dos pasos. El primer paso es la preparación de la rebanada de cerebro organotípicos. Paso dos comprende la preparación de células tumorales y la deposición en el modelo de cocultivo.

1. Organotípicos Cerebro Slice

  1. Preparar el medio de disección que consiste en medio esencial mínimo (MEM), suplementado con glutamina 0,2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 4,5 mg / ml de glucosa.
  2. Decapita a los ratones de cualquier cepa de ratón entre el día postnatalseis y ocho (P6-8).
  3. Retire el cerebro rápidamente desde el cráneo bajo condiciones asépticas y la transfiere a un medio de disección enfriado con hielo.
  4. Retire el polo frontal y el cerebelo de toda la sección del cerebro.
  5. Fijar y estabilizar el cerebro en una etapa con pegamento crio y 5% de agarosa.
  6. Cortar las secciones del cerebro horizontalmente hasta un espesor de 350 micras utilizando un vibratome.
  7. Recoger cinco y cincuenta y seis rebanadas de todo el cerebro de un solo cerebro de ratón, dependiendo de la especie y la edad.
  8. Preparar el medio de cultivo que consiste de 50% MEM, solución salina equilibrada de 25% de Hanks (HBSS), 25% de suero de caballo normal (NHS), glutamina 0,2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (Sigma, Múnich, Alemania), y glucosa 4,5 mg / ml.
  9. Ponga cada pedazo de cerebro organotípicos en un m policarbonato transwell inserto de membrana 0.4 en una placa de seis pocillos con 1 ml de medio de cultivo en el menor también.
  10. Organotípico Cultura rebanadas del cerebro durante la noche en una humidified atmósfera con 5% de CO2 a 37 ° C incubadora.

2. El Modelo Slice Coculture

  1. Incrustar 10 5 de tumor de GFP-transfectadas u otras células (por ejemplo, células MCF-7-GFP) en 20 l matriz de gel, que consta de 15% medio RPMI y 85% en gel de ECM.
  2. Coloque la mezcla matriz de células MCF-7-gel en un espaciador metálico estéril (3,8 mm de diámetro) directamente adyacente a la región cortical de la rebanada de cerebro organotípicos y se incuba durante 2 hr.
  3. Retire el espaciador y deje que el esferoide tumor 3D para co-cultivo con la rebanada organotípicos de 24-96 h.
  4. Cambie el medio de cultivo cada dos días.

3. Inmunofluorescencia tinción de astrocitos y Microglial en el cerebro organotípicos rebanada Coculture

  1. Fijar el organotípico cocultivo de cortes de cerebro con 4% paraformaldehido durante 8 horas a 4 ° C.
  2. Lavar el cocultivo rebanada con PBST (PBS con 0,5% de Triton X-100) durante 5 min.
  3. Bloquee las sejemplos con suero normal de cabra en PBST (01:20) a temperatura ambiente durante 1 h.
  4. Teñir los astrocitos mediante la incubación de la co-cultivo de cortes de cerebro con fibrilar glial anti-anticuerpo monoclonal proteína ácida (GFAP, 1:200 en PBST) durante 36 horas a 4 ° C seguido de cabra anti-ratón-TRITC (1:100 en PBST) tinción durante 1 hora a temperatura ambiente.
  5. Lavar las muestras con PBST tres veces durante 5 min.
  6. Tinción de las células de la microglía con ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 en PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente.
  7. Contrateñir el cocultivo de cortes de cerebro con DAPI (1:1000) durante 3 min a temperatura ambiente.
  8. Monte y cubreobjetos cocultivo de cortes de cerebro con medio de montaje DAKO fluorescente.
  9. Evaluar el grado de invasión del tumor basado en el siguiente sistema de puntuación: 0 = ninguna de las células; + <1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 de las células invadidas (primera medir la longitud de la sección de contacto entre el tapón del tumor y la rodaja, y luego medir el fraccionamienton de contacto detectable por las células invasoras).

4. Imágenes en vivo de la interacción entre células gliales y tumorales

  1. Lleve a cabo el experimento en una Leica DMI 6000B invertida microscopio a 10X lente de aumento y una cámara CCD 350 FX Leica DFC.

Resultados

En primer lugar, todas las células de carcinoma utilizados (humanos: MCF-7 y murinos: 410,4) invadieron la de cortes de cerebro organotípicos de ratón. La invasión fue por lo tanto en especies independientes (Figura 1A), lo que indica una amplia gama de aplicaciones en una especie de forma independiente. Además, la microglia, así como los astrocitos acumuladas en la interfase como se describe anteriormente en vivo y en muestras de pacientes 13. Proyección de imagen de lapso de tiempo durante un período prolongado de tiempo no sólo reveló la viabilidad de la rebanada, pero también ofrece una buena plataforma para observar las interacciones celulares. Por experimentos de lapso de tiempo, se registraron las células microgliales para entrar en la esfera 3D celular mientras, a su vez, las células cancerosas también invadieron el corte de cerebro (Figuras 1B1-B2). Por otra parte, hemos demostrado previamente la capacidad de la microglia para el transporte de células de carcinoma mediante un mecanismo todavía enigmática para ayudar de ese modo en la invasión de carcinoma. El uso de técnicas de marcaje de inmunofluorescencia, nosco-localizaciones de las células tumorales y las células del estroma (por ejemplo, astrocitos y microglia), tanto en el tejido cerebral y en el enchufe de células tumorales (Figuras 1C-D), lo que sugiere una interacción estrecha entre estas células durante el proceso de invasión descrito. Se obtuvieron resultados comparables cuando rodajas de cerebro de ratón se cocultured ya sea con (Figuras 1D1-D3) células de carcinoma humano (Figuras 1C1-C3) o murino - que muestra la amplia gama de aplicaciones para el estudio de células de diferentes especies, genotipos y cepas.

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Figura 1. Cerebro modelo cocultivo rebanada con un esferoide 3D ​​de ratón y células de carcinoma humano. A) La cuantificación de la invasión de células cancerosas en todo organotypic co-cultivos de sección de cerebro con el cáncer de mama de ratónlínea celular 410.4 o una línea celular de cáncer de mama humano MCF-7. Los datos representan el porcentaje del grado de invasión de células en cortes de cerebro en cada grupo con n ≥ 38. No hubo diferencia significativa entre estos dos grupos (prueba de Kruskal-Wallis). B) imágenes con lapso de tiempo de enteros organotypic co-cultivos de sección de cerebro con células MCF-7-GFP y las imágenes representativas de day2 (B1) y el día 5 (B2) fueron se muestra. imágenes de microscopía CD) confocal mostraron cohortes de carcinomas, astrocitos y microglia. Doble tinción de los astrocitos (anti-GFAP-TRITC, rojo) y microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violeta) de todo el co-cultivo con 350 m de espesor de cortes de cerebro organotípicos y el tapón de células tumorales transfectadas con GFP (verde): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) y 3D-410.4-GFP (D1-D3). Líneas blancas mostraron el borde de la rebanada del cerebro y el frente de la invasión tumoral. Las barras de escala representan 50 micras. La microglia, astrocitos unnd tumores colocalizations (C1 y D1), astrocitos-tumores colocalizations (C2 y D2) y colocalizations microglia-tumorales (C3 y D3) en el co-cultivo rebanada. Haz clic aquí para ver la imagen más grande

Discusión

Investigaciones histológicas previas de la metástasis cerebral demostraron cambios rápidos y drásticos de las células gliales residentes, especialmente de los astrocitos y microglia 13. Para estudiar estos cambios y las interacciones con las células de carcinoma, este novedoso sistema de cocultivo es muy adecuado. Otros campos de investigación ya tienen experiencia de muchos años con cortes de cerebro organotípicos del hipocampo. Una ventaja es que los cultivos de cortes de cerebro organotípicos de hipocampo son viables y efectivamente conservado de días a semanas, lo que es adecuado para los experimentos a largo plazo. Desde la introducción de Stoppini del sistema de cortes de hipocampo organotípicos en 1991, que ha sido ampliamente utilizado, por ejemplo en la investigación de enfermedades degenerativas. Por lo tanto, este sistema de cocultivo innovador representa una modificación de un enfoque bien establecido con una amplia gama de aplicaciones en la biología del tumor 9,11. La modificación nos ofreció un modelo reproducible para evaluar el grado de invasión del tumor afterwards y culturas cultivadas por el método de interfaz son ideales para experimentos que requieren una estructura tridimensional. Varias técnicas se han utilizado para el cocultivo cortes de hipocampo organotípicos con otras células. Estos incluyen un sistema indirecto entre las células de macrófagos y la de cortes de cerebro organotípicos 14, y un cocultivo directo de dos rebanadas diferentes de la región del hipocampo 15. Agregados de glioma también se han cocultivadas con rodajas de cerebro 16. Estos modelos se pueden utilizar para analizar los eventos celulares y moleculares en las rodajas de cerebro, pero no permiten el contacto directo, fisiológica entre las células tumorales, la microglía y el parénquima cerebral. Además, este método permite la observación de la microglia y sin contaminación de óseas derivadas de médula periféricos monocitos / macrófagos. El uso de CCR2 y CX3CR1 modelo de ratón transgénico es una mejora crítico debido al hecho de que es difícil distinguir la microglía residente de la invasión de monocitoscon base en sus propiedades similares 17,18,19. Aunque la inyección intracerebral de células de carcinoma permite la investigación de la progresión del tumor, no puede decir mucho en cuanto a si las células como los macrófagos-rodeadas originan a partir de la población de la microglía residente-cerebro o de la médula derivadas de médula periféricos monocitos / macrófagos 17. El equipo de Kettenmann introdujo un modelo de cortes de cerebro organotípicos que involucró a la inoculación de células de glioma en rodajas de cerebro con un micromanipulador 20. Sin embargo, los gliomas malignos primarios difieren en muchos aspectos de los carcinomas metastásicos. En primer lugar, los gliomas malignos son de origen mesenquimal, no hacen metástasis fuera del sistema nervioso, y migran / invadir las células como simples sin la frontera entre el tumor y el tejido cerebral. Por el contrario, el crecimiento infiltrante es una característica típica patológica, y estos carcinomas generalmente migrar / invaden como cohortes. En segundo lugar, los carcinomas a menudo tratan de reconstruir las estructuras epiteliales en el cerebro, mientras que las células glialestratar de separar el tumor del tejido cerebral por un (pseudo) cápsula. Teniendo en cuenta las características biológicas y morfológicas, glioma maligno y metástasis de carcinomas no son realmente comparables. Por estas razones, hemos modificado y desarrollado un sistema de co-cultivo, donde no nos cocultivo inyectamos pero un tapón celular de carcinoma adyacente a la sección de cerebro. Asimismo, se observó la microglia y la acumulación de los astrocitos en la frontera de la clavija del tumor, lo que significa que la microglia entran en el enchufe del tumor y pueden ser detectadas fácilmente por microscopía de campo brillante y confirmaron posteriormente mediante microscopía confocal. Las células cancerosas invaden el corte de cerebro, que es comparable a la situación real en vivo y para una observación hecha por Baumert y sus colegas, quienes encontraron una zona de infiltración en el 63% de los casos de autopsia con metástasis cerebrales 21.

Debido a la perfusión de la sangre falta, hay sólo residente macrófagos / microglia en esta cultura. Por otra parte, debido a la mIssing células T y, por lo tanto, ausente alo-reactividad, células de carcinoma humano podrían ser utilizados para cocultivo incluso con secciones de cerebro de ratones o ratas inmunocompetentes (NMRI, B6, o Wistar). Esto podría servir como una alternativa al modelo de ratón desnudo. Desde cuatro y cincuenta y seis rebanadas se pueden obtener de cada ratón, se requieren reducidas significativamente el número de animales, en comparación con los modelos de inyección existentes. Además, los animales no sufran durante un largo período de enfermedad metastásica y que no se someten a procedimientos quirúrgicos repetitivamente 22.

Con este sistema de cocultivo, hemos demostrado la activación de la microglia por las células cancerosas y la capacidad de promover la invasión de células de cáncer. Además, esta es la primera vez, a nuestro conocimiento, no se encontraron microglia para transportar activamente células de carcinoma 23.

A pesar de todas estas ventajas, el sistema de co-cultivo tiene, de hecho, también limitaciones. Todavía es un in vitromodelar falta las etapas de la metástasis antes de la colonización. Debido a la falta de perfusión, no es posible estudiar la extravasación. Por lo tanto, la forma alternativa de estudiar la extravasación es utilizar ya sea el modelo in vivo en inyección o el sistema de cámara de Boyden modificada con matriz extracelular, HUVEC y astrocitos para imitar la barrera sangre-cerebro 22,24. El método de cocultivo de cortes de cerebro es todavía un modelo fiable y reproducible con muchas ventajas y un potencial para una amplia variedad de aplicaciones, tales como el análisis de la colonización, en particular, con un enfoque sobre el papel de las células residentes. La combinación con otras técnicas establecidas (como la inmunohistoquímica, microscopía confocal y microscopía de lapso de tiempo) apoya la investigación de las interacciones directas de célula a célula. Es una alternativa y complementación de otras técnicas de fácil y ofrece acceso a la investigación de los indicios y efectos como impuestas por el microambiente metastásico.

Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen Chalid Ghadban por su excelente asistencia técnica, Andreas Wodarz y Stephan ploma por su asesoramiento técnico en relación con confocal y microscopía de lapso de tiempo. No hay conflicto de intereses para cualquiera de los autores. Este trabajo es financiado por el Consejo Alemán de Investigación (DFG) en el Proyecto 2 de Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), por los Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Alemania) y por el Programa de Investigación de la Facultad de Medicina de la Georg-August-Universität Göttingen, Alemania.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hank' s solución salina equilibrada (HBSS)Gibco, Darmstadt,Alemania24020
Medio esencial mínimo (MEM)Gibco, Darmstadt, Alemania32360
RPMI-1640 PAALaboratories Inc., Cö lbe, AlemaniaE15-840
Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Pan Biotech, Aidenbach, AlemaniaP04-36500
Suero normal de caballo (NHS)Invitrogen, Karlsruhe, Alemania16050-122
Suero fetal de ternero (FCS)Invitrogen, Karlsruhe, Alemania10091148
GlucosaB. Braum, Melsungen, Alemania
Solución de L-glutamina-penicilina-estreptomicinaSigma, Steinheim, AlemaniaG1146
VibratomeLeica, Wetzlar, AlemaniaLeica VT1200S
MicrotomoLeica, Wetzlar, AlemaniaLeica SM 2000R
Membrana de policarbonatoBD Falcon, Heidelberg, Alemania353090inserto de membrana transwell (0.4 μ m tamaño de poro)
ECM gelTrevigen, R& D, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania3432-005-01Extracto de membrana basal
Espaciador metálicoKig GmbG, Kirkel, AlemaniaDIN 433
Microscopio confocalZeiss, Gö ttingen, AlemaniaLSM 510
Microscopio y cámara time-lapseLeica, Wetzlar, AlemaniaMicroscopio DMI 6000B y cámara DFC 350 FX CCD
Microscopio de anatomíaZeiss, Gö Ttingen, AlemaniaStemi SV11
ParaformaldehídoMerck, Darmstadt, Alemania1.04005.1000
Anticuerpo monoclonal de ratón anti-glial-proteína ácida fibrilar (GFAP)Sigma, Steinheim, AlemaniaG3893
Cabra anti-ratón IgG, F(ab')2- TRITCSanta Cruz, Heidelberg, AlemaniaSC3796
Isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugadoInvitrogen, Karlsruhe, Alemania132450
DAPI (4',6'-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro de dihidro)Sigma, Steinheim, AlemaniaD8417
Medio de montaje fluorescenteDAKO, Glostrup, DinamarcaS3023

Referencias

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