Name: Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-09T22:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende a visualizar interacciones gliales durante la metástasis cerebral usando cocultivos de rebanadas organotípicas de cerebro con células de carcinoma. Esta técnica permite observar invasiones tumorales en tiempo real mediante microscopía confocal.

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Los autores agradecen Chalid Ghadban por su excelente asistencia técnica, Andreas Wodarz y Stephan ploma por su asesoramiento técnico en relación con confocal y microscopía de lapso de tiempo. No hay conflicto de intereses para cualquiera de los autores. Este trabajo es financiado por el Consejo Alemán de Investigación (DFG) en el Proyecto 2 de Forschergruppe 942 (FOR942 BI 703/3-1), por los Dres. Bayer-Stiftung (Baden Württembergischer Krebspreis, Alemania) y por el Programa de Investigación de la Facultad de Medicina de la Georg-August-Universität Göttingen, Alemania.

Este nuevo modelo es una adaptación de un enfoque de cortes de cerebro organotípicos del hipocampo publicado previamente 9-12. Las modificaciones y adiciones se introdujeron para optimizar las interacciones de tejido de cáncer de células cerebrales y para garantizar la reproducibilidad. El estudio fue revisado y aprobado por el comité de ética local. Los animales fueron tratados cuidadosamente de acuerdo con las directrices para el cuidado de animales de la Medicina de la Universidad de Gotinga. El organotípico cocultivo de cortes de cerebro se puede subdividir en dos pasos. El primer paso es la preparación de la rebanada de cerebro organotípicos. Paso dos comprende la preparación de células tumorales y la deposición en el modelo de cocultivo. 1. Organotípicos Cerebro Slice <ol><li> Preparar el medio de disección que consiste en medio esencial mínimo (MEM), suplementado con glutamina 0,2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, y 4,5 mg / ml de glucosa. </li><li> Decapita a los ratones de cualquier cepa de ratón entre el día postnatalseis y ocho (P6-8). </li><li> Retire el cerebro rápidamente desde el cráneo bajo condiciones asépticas y la transfiere a un medio de disección enfriado con hielo. </li><li> Retire el polo frontal y el cerebelo de toda la sección del cerebro. </li><li> Fijar y estabilizar el cerebro en una etapa con pegamento crio y 5% de agarosa. </li><li> Cortar las secciones del cerebro horizontalmente hasta un espesor de 350 micras utilizando un vibratome. </li><li> Recoger cinco y cincuenta y seis rebanadas de todo el cerebro de un solo cerebro de ratón, dependiendo de la especie y la edad. </li><li> Preparar el medio de cultivo que consiste de 50% MEM, solución salina equilibrada de 25% de Hanks (HBSS), 25% de suero de caballo normal (NHS), glutamina 0,2 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (Sigma, Múnich, Alemania), y glucosa 4,5 mg / ml. </li><li> Ponga cada pedazo de cerebro organotípicos en un m policarbonato transwell inserto de membrana 0.4 en una placa de seis pocillos con 1 ml de medio de cultivo en el menor también. </li><li> Organotípico Cultura rebanadas del cerebro durante la noche en una humidified atmósfera con 5% de CO2 a 37 ° C incubadora. </li></ol> 2. El Modelo Slice Coculture <ol><li> Incrustar 10 5 de tumor de GFP-transfectadas u otras células (por ejemplo, células MCF-7-GFP) en 20 l matriz de gel, que consta de 15% medio RPMI y 85% en gel de ECM. </li><li> Coloque la mezcla matriz de células MCF-7-gel en un espaciador metálico estéril (3,8 mm de diámetro) directamente adyacente a la región cortical de la rebanada de cerebro organotípicos y se incuba durante 2 hr. </li><li> Retire el espaciador y deje que el esferoide tumor 3D para co-cultivo con la rebanada organotípicos de 24-96 h. </li><li> Cambie el medio de cultivo cada dos días. </li></ol> 3. Inmunofluorescencia tinción de astrocitos y Microglial en el cerebro organotípicos rebanada Coculture <ol><li> Fijar el organotípico cocultivo de cortes de cerebro con 4% paraformaldehido durante 8 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar el cocultivo rebanada con PBST (PBS con 0,5% de Triton X-100) durante 5 min. </li><li> Bloquee las sejemplos con suero normal de cabra en PBST (01:20) a temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Teñir los astrocitos mediante la incubación de la co-cultivo de cortes de cerebro con fibrilar glial anti-anticuerpo monoclonal proteína ácida (GFAP, 1:200 en PBST) durante 36 horas a 4 ° C seguido de cabra anti-ratón-TRITC (1:100 en PBST) tinción durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las muestras con PBST tres veces durante 5 min. </li><li> Tinción de las células de la microglía con ILB 4-Alexa Fluor 647 (1:100 en PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Contrateñir el cocultivo de cortes de cerebro con DAPI (1:1000) durante 3 min a temperatura ambiente. </li><li> Monte y cubreobjetos cocultivo de cortes de cerebro con medio de montaje DAKO fluorescente. </li><li> Evaluar el grado de invasión del tumor basado en el siguiente sistema de puntuación: 0 = ninguna de las células; + &lt;1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 de las células invadidas (primera medir la longitud de la sección de contacto entre el tapón del tumor y la rodaja, y luego medir el fraccionamienton de contacto detectable por las células invasoras). </li></ol> 4. Imágenes en vivo de la interacción entre células gliales y tumorales <ol><li> Lleve a cabo el experimento en una Leica DMI 6000B invertida microscopio a 10X lente de aumento y una cámara CCD 350 FX Leica DFC. </li></ol>

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

Investigaciones histológicas previas de la metástasis cerebral demostraron cambios rápidos y drásticos de las células gliales residentes, especialmente de los astrocitos y microglia 13. Para estudiar estos cambios y las interacciones con las células de carcinoma, este novedoso sistema de cocultivo es muy adecuado. Otros campos de investigación ya tienen experiencia de muchos años con cortes de cerebro organotípicos del hipocampo. Una ventaja es que los cultivos de cortes de cerebro organotípicos de hipocampo son viables y efectivamente conservado de días a semanas, lo que es adecuado para los experimentos a largo plazo. Desde la introducción de Stoppini del sistema de cortes de hipocampo organotípicos en 1991, que ha sido ampliamente utilizado, por ejemplo en la investigación de enfermedades degenerativas. Por lo tanto, este sistema de cocultivo innovador representa una modificación de un enfoque bien establecido con una amplia gama de aplicaciones en la biología del tumor 9,11. La modificación nos ofreció un modelo reproducible para evaluar el grado de invasión del tumor afterwards y culturas cultivadas por el método de interfaz son ideales para experimentos que requieren una estructura tridimensional. Varias técnicas se han utilizado para el cocultivo cortes de hipocampo organotípicos con otras células. Estos incluyen un sistema indirecto entre las células de macrófagos y la de cortes de cerebro organotípicos 14, y un cocultivo directo de dos rebanadas diferentes de la región del hipocampo 15. Agregados de glioma también se han cocultivadas con rodajas de cerebro 16. Estos modelos se pueden utilizar para analizar los eventos celulares y moleculares en las rodajas de cerebro, pero no permiten el contacto directo, fisiológica entre las células tumorales, la microglía y el parénquima cerebral. Además, este método permite la observación de la microglia y sin contaminación de óseas derivadas de médula periféricos monocitos / macrófagos. El uso de CCR2 y CX3CR1 modelo de ratón transgénico es una mejora crítico debido al hecho de que es difícil distinguir la microglía residente de la invasión de monocitoscon base en sus propiedades similares 17,18,19. Aunque la inyección intracerebral de células de carcinoma permite la investigación de la progresión del tumor, no puede decir mucho en cuanto a si las células como los macrófagos-rodeadas originan a partir de la población de la microglía residente-cerebro o de la médula derivadas de médula periféricos monocitos / macrófagos 17. El equipo de Kettenmann introdujo un modelo de cortes de cerebro organotípicos que involucró a la inoculación de células de glioma en rodajas de cerebro con un micromanipulador 20. Sin embargo, los gliomas malignos primarios difieren en muchos aspectos de los carcinomas metastásicos. En primer lugar, los gliomas malignos son de origen mesenquimal, no hacen metástasis fuera del sistema nervioso, y migran / invadir las células como simples sin la frontera entre el tumor y el tejido cerebral. Por el contrario, el crecimiento infiltrante es una característica típica patológica, y estos carcinomas generalmente migrar / invaden como cohortes. En segundo lugar, los carcinomas a menudo tratan de reconstruir las estructuras epiteliales en el cerebro, mientras que las células glialestratar de separar el tumor del tejido cerebral por un (pseudo) cápsula. Teniendo en cuenta las características biológicas y morfológicas, glioma maligno y metástasis de carcinomas no son realmente comparables. Por estas razones, hemos modificado y desarrollado un sistema de co-cultivo, donde no nos cocultivo inyectamos pero un tapón celular de carcinoma adyacente a la sección de cerebro. Asimismo, se observó la microglia y la acumulación de los astrocitos en la frontera de la clavija del tumor, lo que significa que la microglia entran en el enchufe del tumor y pueden ser detectadas fácilmente por microscopía de campo brillante y confirmaron posteriormente mediante microscopía confocal. Las células cancerosas invaden el corte de cerebro, que es comparable a la situación real en vivo y para una observación hecha por Baumert y sus colegas, quienes encontraron una zona de infiltración en el 63% de los casos de autopsia con metástasis cerebrales 21. Debido a la perfusión de la sangre falta, hay sólo residente macrófagos / microglia en esta cultura. Por otra parte, debido a la mIssing células T y, por lo tanto, ausente alo-reactividad, células de carcinoma humano podrían ser utilizados para cocultivo incluso con secciones de cerebro de ratones o ratas inmunocompetentes (NMRI, B6, o Wistar). Esto podría servir como una alternativa al modelo de ratón desnudo. Desde cuatro y cincuenta y seis rebanadas se pueden obtener de cada ratón, se requieren reducidas significativamente el número de animales, en comparación con los modelos de inyección existentes. Además, los animales no sufran durante un largo período de enfermedad metastásica y que no se someten a procedimientos quirúrgicos repetitivamente 22. Con este sistema de cocultivo, hemos demostrado la activación de la microglia por las células cancerosas y la capacidad de promover la invasión de células de cáncer. Además, esta es la primera vez, a nuestro conocimiento, no se encontraron microglia para transportar activamente células de carcinoma 23. A pesar de todas estas ventajas, el sistema de co-cultivo tiene, de hecho, también limitaciones. Todavía es un in vitromodelar falta las etapas de la metástasis antes de la colonización. Debido a la falta de perfusión, no es posible estudiar la extravasación. Por lo tanto, la forma alternativa de estudiar la extravasación es utilizar ya sea el modelo in vivo en inyección o el sistema de cámara de Boyden modificada con matriz extracelular, HUVEC y astrocitos para imitar la barrera sangre-cerebro 22,24. El método de cocultivo de cortes de cerebro es todavía un modelo fiable y reproducible con muchas ventajas y un potencial para una amplia variedad de aplicaciones, tales como el análisis de la colonización, en particular, con un enfoque sobre el papel de las células residentes. La combinación con otras técnicas establecidas (como la inmunohistoquímica, microscopía confocal y microscopía de lapso de tiempo) apoya la investigación de las interacciones directas de célula a célula. Es una alternativa y complementación de otras técnicas de fácil y ofrece acceso a la investigación de los indicios y efectos como impuestas por el microambiente metastásico.

<table><tbody><tr><td>Hank&#039; s solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Gibco, Darmstadt,Alemania</td><td>24020</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)</td><td>Gibco, Darmstadt, Alemania</td><td>32360</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 PAA</td><td>Laboratories Inc., C&ouml; lbe, Alemania</td><td>E15-840</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Pan Biotech, Aidenbach, Alemania</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de caballo (NHS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero (FCS)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>10091148</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>B. Braum, Melsungen, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-glutamina-penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma, Steinheim, Alemania</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>Leica VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>Leica SM 2000R</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato</td><td>BD Falcon, Heidelberg, Alemania</td><td>353090</td><td>inserto de membrana transwell (0.4 &mu; m tamaño de poro)</td></tr><tr><td>ECM gel</td><td>Trevigen, R& D, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemania</td><td>3432-005-01</td><td>Extracto de membrana basal</td></tr><tr><td>Espaciador metálico</td><td>Kig GmbG, Kirkel, Alemania</td><td>DIN 433</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss, G&ouml; ttingen, Alemania</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio y cámara time-lapse</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>Microscopio DMI 6000B y cámara DFC 350 FX CCD</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de anatomía</td><td>Zeiss, G&ouml; Ttingen, Alemania</td><td>Stemi SV11</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de ratón anti-glial-proteína ácida fibrilar (GFAP)</td><td>Sigma, Steinheim, Alemania</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG, F(ab&#039;)2- TRITC</td><td>Santa Cruz, Heidelberg, Alemania</td><td>SC3796</td><td></td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugado</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Alemania</td><td>132450</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6&#039;-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro de dihidro)</td><td>Sigma, Steinheim, Alemania</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje fluorescente</td><td>DAKO, Glostrup, Dinamarca</td><td>S3023</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3d esferoide de células de carcinoma

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Los pacientes con metástasis cerebrales de los carcinomas tienen un mal pronóstico. Sin embargo, el proceso en el lugar de la metástasis apenas se ha investigado, en particular, el papel de las células del estroma (residente). Los estudios en los carcinomas primarios demuestran la influencia del microambiente en la metástasis, incluso en 1,2 pronóstico. Especialmente los macrófagos asociados a tumores (TAM) la migración de apoyo, la invasión y proliferación 3. Curiosamente, los principales sitios diana de la metástasis poseen los macrófagos específicos de tejido, tales como células de Kupffer en el hígado o la microglía en el SNC. Por otra parte, los sitios metastásicos también poseen otras células específicas de tejido, como astrocitos. Recientemente, los astrocitos se demostraron para fomentar la proliferación y la persistencia de las células cancerosas 4,5. Por lo tanto, las funciones de estos tipos de células específicas de tejido parecen ser muy importante en el proceso de 6,7 metástasis cerebral. A pesar de estas observaciones,Sin embargo, hasta ahora no hay una adecuada modelo vivo / in vitro disponible en para visualizar directamente las reacciones gliales durante la formación de la metástasis cerebral, en particular, mediante microscopía de campo claro. Reciente en vivo de imágenes en vivo de las células de carcinoma demostraron su comportamiento colonización cerebral 8. Sin embargo, este método es muy laborioso, costoso y técnicamente compleja. Además, este tipo de experimentos con animales se limitan a series pequeñas y cuentan con un considerable estrés para los animales (por implantación de la placa de vidrio, la inyección de las células tumorales, la anestesia repetitivo y fijación a largo plazo). Además, imágenes in vivo hasta ahora se limita a la visualización de las células de carcinoma, mientras que las interacciones con las células residentes aún no se han ilustrado. Por último, las investigaciones de las células de carcinoma humano en animales inmunocompetentes son imposibles 8. Por estas razones, hemos establecido un sistema de co-cultivo consipicadura de un corte de cerebro de ratón y células epiteliales organotípico incrustado en matrigel (esfera de células en 3D). Las esferas celulares de carcinoma de 3D se colocaron directamente junto al borde de cortes de cerebro con el fin de investigar la invasión del tejido cerebral vecino. Esto nos permite visualizar los cambios morfológicos y de las interacciones entre las células gliales y las células de carcinoma de fluorescencia e incluso por microscopía de campo claro. Después del experimento de cocultivo, el tejido cerebral o los esferoides de células 3D pueden ser recogidos y utilizados para otros análisis moleculares (por ejemplo, QRT-PCR, IHC, o inmunotransferencia), así como para investigaciones por microscopía confocal. Este método se puede aplicar para controlar los eventos dentro de un tejido cerebral para vivir día sin efectos perjudiciales a los cortes de cerebro. El modelo también permite la supresión selectiva y la sustitución de las células residentes por las células de un tejido de un donante para determinar el impacto diferenciado de un determinado genotipo. Por último, el modelo de cocultivo es una alternativa posiblea in vivo enfoques al probar manipulaciones farmacológicas específicas.

En primer lugar, todas las células de carcinoma utilizados (humanos: MCF-7 y murinos: 410,4) invadieron la de cortes de cerebro organotípicos de ratón. La invasión fue por lo tanto en especies independientes (Figura 1A), lo que indica una amplia gama de aplicaciones en una especie de forma independiente. Además, la microglia, así como los astrocitos acumuladas en la interfase como se describe anteriormente en vivo y en muestras de pacientes 13. Proyección de imagen de lapso de tiempo durante un período prolongado de tiempo no sólo reveló la viabilidad de la rebanada, pero también ofrece una buena plataforma para observar las interacciones celulares. Por experimentos de lapso de tiempo, se registraron las células microgliales para entrar en la esfera 3D celular mientras, a su vez, las células cancerosas también invadieron el corte de cerebro (Figuras 1B1-B2). Por otra parte, hemos demostrado previamente la capacidad de la microglia para el transporte de células de carcinoma mediante un mecanismo todavía enigmática para ayudar de ese modo en la invasión de carcinoma. El uso de técnicas de marcaje de inmunofluorescencia, nosco-localizaciones de las células tumorales y las células del estroma (por ejemplo, astrocitos y microglia), tanto en el tejido cerebral y en el enchufe de células tumorales (Figuras 1C-D), lo que sugiere una interacción estrecha entre estas células durante el proceso de invasión descrito. Se obtuvieron resultados comparables cuando rodajas de cerebro de ratón se cocultured ya sea con (Figuras 1D1-D3) células de carcinoma humano (Figuras 1C1-C3) o murino - que muestra la amplia gama de aplicaciones para el estudio de células de diferentes especies, genotipos y cepas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1.jpg" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" /> Figura 1. Cerebro modelo cocultivo rebanada con un esferoide 3D ​​de ratón y células de carcinoma humano. A) La cuantificación de la invasión de células cancerosas en todo organotypic co-cultivos de sección de cerebro con el cáncer de mama de ratónlínea celular 410.4 o una línea celular de cáncer de mama humano MCF-7. Los datos representan el porcentaje del grado de invasión de células en cortes de cerebro en cada grupo con n ≥ 38. No hubo diferencia significativa entre estos dos grupos (prueba de Kruskal-Wallis). B) imágenes con lapso de tiempo de enteros organotypic co-cultivos de sección de cerebro con células MCF-7-GFP y las imágenes representativas de day2 (B1) y el día 5 (B2) fueron se muestra. imágenes de microscopía CD) confocal mostraron cohortes de carcinomas, astrocitos y microglia. Doble tinción de los astrocitos (anti-GFAP-TRITC, rojo) y microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violeta) de todo el co-cultivo con 350 m de espesor de cortes de cerebro organotípicos y el tapón de células tumorales transfectadas con GFP (verde): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) y 3D-410.4-GFP (D1-D3). Líneas blancas mostraron el borde de la rebanada del cerebro y el frente de la invasión tumoral. Las barras de escala representan 50 micras. La microglia, astrocitos unnd tumores colocalizations (C1 y D1), astrocitos-tumores colocalizations (C2 y D2) y colocalizations microglia-tumorales (C3 y D3) en el co-cultivo rebanada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50881/50881fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a>

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar las interacciones gliales directamente durante la formación de metástasis cerebrales. Esto se logra preparando primero cortes de cerebro organotípicos de ratones. A continuación, los cortes de cerebro organotípicos se cocultivan con células de carcinoma.A continuación, las células estromales se tiñen con fluorescencia con marcadores específicos. Finalmente, se evalúa el nivel de invasión tumoral con un microscopio fluorescente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la interacción y colocalización de las células cancerosas de la glía a través del marcaje de inmunofluorescencia y la microscopía confocal o de lapso de tiempo.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inyección intracerebral de células de carcinoma, es que este método es una alternativa fácil y ofrece una buena plataforma para observar las interacciones celulares durante la progresión del tumor. Las implicaciones de esta técnica son 10 0 para el descubrimiento de una nueva y las terapias selectivas para el tratamiento del cáncer. Debido a que las células traumatizadas desempeñan un papel importante en la metástasis y también son objetivos potenciales para la terapia contra el cáncer, la demostración de la técnica será Eugenia entregando un postdoctorado de mi laboratorio Antes del procedimiento quirúrgico, prepare el medio de disección que consiste en un medio esencial mínimo, suplementado con 0,2 milimolar de glutamina, 100 miligramos por mililitro de estreptomicina y 4,5 miligramos por mililitro de glucosa después de decapitar ratones de cualquier cepa de ratón entre el sexto día postnatal y Ocho.Utilizando condiciones asépticas rápidamente, extraiga el cerebro del cráneo y transfiéralo a un medio de disección. Extirpar el polo frontal y el cerebelo del cerebro. A continuación, utilice pegamento criogénico y 5%agros para fijar y estabilizar el tejido cerebral restante compuesto por el cerebro.En un escenario en el que se utiliza un corte horizontal de Vibram, secciones de 350 micras de grosor, dependiendo de la especie y la edad del ratón, recogen de cuatro a seis cortes de cerebro enteros de un solo cerebro. Después de preparar el medio de cultivo de acuerdo con el protocolo de texto, agregue un mililitro a cada pocillo inferior de una placa de seis pocillos trans. A continuación, coloque cada rebanada de cerebro organotípica en una membrana transwell de policarbonato de 0,4 micras e insértelas en los pocillos de la placa.Incubar las rodajas durante la noche en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados. Al día siguiente, incruste de 10 a la quinta células tumorales transfectadas con GFP u otras células en 20 microlitros de matriz de gel que consta de un 15% de medio RPMI y un 85% de gel ECM. Coloque la mezcla de matriz de siete geles MCF en espaciadores metálicos estériles directamente adyacentes a las regiones corticales de los cortes de cerebro organotípicos e incube durante dos horas después de la incubación, retire los espaciadores y permita que la PHE tumoral 3D se incube con los cortes de cerebro durante 24 a 96 horas.Reemplace el medio de cultivo cada dos días si lo desea. Realice imágenes en vivo utilizando microscopía de lapso de tiempo con un objeto de aumento de 10x para teñir los cocultivos de cortes de cerebro. Fíjelos con aldehído de paraforma al 4% durante ocho horas a cuatro grados centígrados antes de lavar las muestras en PBST durante cinco minutos.Luego, para bloquear las muestras, use suero de cabra normal en PBST a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, se tiñen los astrocitos incubando los cocultivos con proteína ácida fibrilar antiglial o anticuerpo monoclonal GFAP durante 36 horas a cuatro grados centígrados, seguido de una tinción antiratón en cabra durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con PBST tres veces durante cinco minutos cada una, tiñe las células microgliales con I LB cuatro LOR 647 durante una hora a temperatura ambiente antes de contratinción con DPI durante tres minutos a temperatura ambiente.Después de utilizar un medio de montaje fluorescente para montar las muestras de cocultivo, obtenga imágenes de las muestras utilizando un microscopio fluorescente con un aumento de 25x. Por último, evalúe el grado de invasión tumoral con base en el siguiente sistema de puntuación. Primero mide la longitud de la sección de contacto entre el tapón tumoral y el corte, y luego la fracción de contacto detectable por las células invasoras.Como se muestra aquí, todas las líneas celulares de carcinoma probadas invadieron cortes de cerebro de ratón organotípicos, lo que sugiere que el proceso de invasión fue independiente de la especie. Esta película muestra una grabación de lapso de tiempo de las interacciones directas de las células tumorales de la glía. Se observó que las células estromales invadían el tumor que contenía el tapón celular e interactuaban con las células cancerosas.Las imágenes de lapso de tiempo durante un período prolongado de tiempo confirmaron la viabilidad de los cortes de cerebro y permitieron la visualización de las células microgliales que ingresan a la esfera tridimensional, así como las células cancerosas que invaden los cortes de cerebro. Además, como hemos demostrado anteriormente, la microglía transporta células de carcinoma por un mecanismo aún enigmático y ayuda en la invasión del carcinoma mediante el marcaje de inmunofluorescencia. Demostramos la colocalización de células tumorales y estromales tanto en el tejido cerebral como en los tapones de las células tumorales, lo que sugiere una estrecha interacción entre estas células durante el proceso de invasión.Como se puede ver aquí, se obtuvieron resultados comparables cuando se cocultivaron trozos de cerebro de ratón con células de carcinoma humano o de orina, lo que respalda la amplia gama de aplicaciones para el estudio de células de diferentes especies, genotipos y cepas. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la metástasis del cáncer exploraran el impacto del microambiente durante la colonización tumoral en sitios distantes. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo visualizar las reacciones de las células cancerosas GL durante la formación de metástasis cerebrales celulares en un sistema de contacto fisiológico directo.

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Este video muestra el desarrollo de un sistema de co-cultivo en 3D. Los trozos de cerebro de ratón se colocan en una membrana y se permite que las células tumorales del cerebro humano marcadas con fluorescencia crezcan en ella. Una vez que el sistema está listo, se tiñe para la obtención de imágenes.

Establecimiento de un tumor cerebral en un modelo de cocultivo de cortes organotípicos

El video muestra la generación y el mantenimiento de cultivos de cortes organotípicos a partir de tejido de glioblastoma. El tejido aislado se incrusta en una matriz de agarosa y se obtienen secciones delgadas utilizando un vibrátomo. A continuación, estas secciones se colocan en insertos de membrana permeable dentro de una microplaca y se cultivan en un medio de mantenimiento de cultivo en rodajas para el mantenimiento a largo plazo.

Generación y mantenimiento de cultivos de cortes a partir de tejido de glioblastoma humano

Este video describe la preparación y el cultivo de organoides de tumores cerebrales a partir de suspensión de una sola célula. Utilizando una matriz extracelular rica en laminina como andamio y medio de cultivo de nutrientes, se facilita que las células se multipliquen y se autoorganicen dentro del organoide. En consecuencia, se generan organoides ex vivo, que imitan la diversidad celular y el microambiente de los tumores cerebrales.

Generación de un cultivo de organoides a partir de una suspensión de células tumorales cerebrales

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Muchos tipos de tumores cerebrales humanos se localizan en regiones específicas dentro del cerebro y son difíciles de cultivar en cultivo. Este protocolo aborda el papel del microambiente tumoral e investiga nuevos tratamientos farmacológicos mediante el análisis de células tumorales cerebrales primarias fluorescentes que crecen en un corte de cerebro de ratón organotípico.

Un tumor cerebral / organotípicos rebanada Co-cultura del sistema para estudiar microambiente tumoral y dirigida Medicamentos Terapias

Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.

Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos

Las culturas Organotypic rebanada hippocampal (OHSC) representan un modelo en vitro que simula muy bien la situación en vivo . Aquí describimos un vibratome base mejorado rebanar protocolo para obtener rodajas de alta calidad para uso en la evaluación del potencial neuroprotector de nuevas sustancias o el comportamiento biológico de las células tumorales.

Culturas de rebanada Hippocampal Organotypic como un modelo para estudio neuroprotección e invasividad de las células tumorales

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

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Uso del cerebro del embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano

Existe una necesidad crítica de modelos de cáncer en 3D que capturen la diafonía heterocelular para estudiar la metástasis del cáncer. Nuestro estudio presenta la generación de estromas-epiteliales heteromulticelulares en un entorno de andamios y libres de andamios que pueden ser utilizados para estudiar la invasión y las distribuciones espaciales celulares.

Células estromales heteromulticelulares en cultivos 3D sin andamios de células de cáncer epitelial para impulsar la invasión

Aprende a visualizar interacciones gliales durante la metástasis cerebral usando cocultivos de rebanadas organotípicas de cerebro con células de carcinoma. Esta técnica permite observar invasiones tumorales en tiempo real mediante microscopía confocal.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

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