Artículo de método
La microscopia del lapso de tiempo y las técnicas de proceso de imagen fueron utilizadas para observar y para analizar la compactación fibroblasto-mediada del gel y el realineamiento de la fibra de la fibrina en un biorreactor ambientalmente controlado durante un período de 48 horas.
Las células incrustadas en los geles de colágeno y fibrina se unen y ejercen fuerzas de tracción sobre las fibras del gel. Estas fuerzas pueden conducir a la reorganización local y global y la realineación de la microestructura de gel. Este proceso procede de una manera compleja que depende en parte de la interacción entre la ubicación de las células, la geometría del gel y las restricciones mecánicas en el gel. Para comprender mejor cómo estas variables producen patrones globales de alineación de fibras, utilizamos microscopía de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo (DIC) junto con un biorreactor controlado ambientalmente para observar el proceso de compactación entre explantes geométricamente espaciados (grupos de fibroblastos). A continuación, las imágenes se analizan con un algoritmo de procesamiento de imágenes personalizado para obtener mapas de la cepa. La información obtenida de esta técnica se puede utilizar para sondear la mecanobiología de varias interacciones de la célula-matriz, que tiene implicaciones importantes para entender procesos en la herida que cura, el desarrollo de la enfermedad, y los usos de la ingeniería del tejido.
Una herramienta importante para el estudio de las interacciones célula-matriz es el gel de colágeno poblado por células1,2. El gel proporciona un entorno 3D que está más cerca del carácter in vivo del tejido y es más adecuado para comprender el comportamiento celular que el que ofrecen los cultivos 2D tradicionales3. Los primeros estudios en los que los fibroblastos se distribuían homogéneamente dentro de un gel de colágeno encontraron que las células consolidan rápidamente las fibras de colágeno y compactan el gel4,5. Los fibroblastos contráctiles en geles flotantes libres pasan a un estado quieto poco después de que el gel h....
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1. Preparación de la plantilla
Prepare una plantilla en Parafilm para diseñar la ubicación de cada explant, siguiendo la geometría deseada (Figuras 1A y 1B). Espaciar cada explanta aproximadamente 1-2 mm de distancia. Esta distancia corresponde a un espaciamiento ideal para generar alineación de fibras entre explantes. Coloque la plantilla debajo del área del vidrio de cubierta donde se preparará la muestra con cinta adhesiva.
2. Esterilización
Limpie a fondo todos los componentes del biorreactor usando etanol al 70% y esterilice durante 2....
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La remodelación de tejidos es un proceso complejo que es impulsado en parte por interacciones físicas recíprocas entre las células y la matriz circundante. Las células reorganizan las fibras circundantes y generan tensión en la red de fibra. La alineación de las fibras y el entorno mecánico a su vez controla el comportamiento celular, de modo que tanto las células como la matriz se reorganizan globalmente para producir tejido remodelado. En este experimento, las células de los explantes, inicialmente redondas en morfolog.......
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Este protocolo fue desarrollado con el propósito de observar y cuantificar la mecánica involucrada en la remodelación de ECM mediada por células. Tales procesos son la base de una serie de fenómenos biológicos y tienen implicaciones importantes para la ingeniería de tejidos2,22,la reducción de la cicatriz1,23,y la comprensión de la remodelación patológica de los tejidos12,24. El uso de la microscopia DIC del lapso de tiempo permite que uno resuelva y cuantifique la dislocación y la alinea.......
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No se declaran conflictos de intereses.
Agradecemos a George Giudice y Steven Eliason por donar fibroblastos dérmicos humanos y a Ramesh Raghupathy por su ayuda con el algoritmo de seguimiento de cepas. El apoyo para este trabajo fue proporcionado por una beca de asistencia para graduados del Departamento de Educación de los Estados Unidos en áreas de necesidad nacional (GAANN P200A120071).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Sondas moleculares | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biorreactor Biotensa | ADMET | ||
| Microscopio Ti-Eclipe | Nikon | ||
| # 0 35 mm Placa de Petri con Fondo de Vidrio | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Placa de Petri con tapa de vidrio | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Accesorios Luer de plástico, tubos de PVC con extremos Luer | Cole-Parmer | 30600-65 |
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