Artículo de método

Observación Y Cuantificación De Fibroblastos Mediada Por Fibrina Gel Compactamiento

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DOI:

10.3791/50918

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16 de enero de 2014

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

En este artículo

Resumen

La microscopia del lapso de tiempo y las técnicas de proceso de imagen fueron utilizadas para observar y para analizar la compactación fibroblasto-mediada del gel y el realineamiento de la fibra de la fibrina en un biorreactor ambientalmente controlado durante un período de 48 horas.

Resumen

Las células incrustadas en los geles de colágeno y fibrina se unen y ejercen fuerzas de tracción sobre las fibras del gel. Estas fuerzas pueden conducir a la reorganización local y global y la realineación de la microestructura de gel. Este proceso procede de una manera compleja que depende en parte de la interacción entre la ubicación de las células, la geometría del gel y las restricciones mecánicas en el gel. Para comprender mejor cómo estas variables producen patrones globales de alineación de fibras, utilizamos microscopía de contraste de interferencia diferencial de lapso de tiempo (DIC) junto con un biorreactor controlado ambientalmente para observar el proceso de compactación entre explantes geométricamente espaciados (grupos de fibroblastos). A continuación, las imágenes se analizan con un algoritmo de procesamiento de imágenes personalizado para obtener mapas de la cepa. La información obtenida de esta técnica se puede utilizar para sondear la mecanobiología de varias interacciones de la célula-matriz, que tiene implicaciones importantes para entender procesos en la herida que cura, el desarrollo de la enfermedad, y los usos de la ingeniería del tejido.

Introducción

Una herramienta importante para el estudio de las interacciones célula-matriz es el gel de colágeno poblado por células1,2. El gel proporciona un entorno 3D que está más cerca del carácter in vivo del tejido y es más adecuado para comprender el comportamiento celular que el que ofrecen los cultivos 2D tradicionales3. Los primeros estudios en los que los fibroblastos se distribuían homogéneamente dentro de un gel de colágeno encontraron que las células consolidan rápidamente las fibras de colágeno y compactan el gel4,5. Los fibroblastos contráctiles en geles flotantes libres pasan a un estado quieto poco después de que el gel haya alcanzado completamente la compactación1,6,7. Los fibroblastos en geles que están restringidos en los límites permanecen en un estado activo y sintético8 y generan alineación de fibras de una manera dependiente de la geometría del gel y las restricciones externas5,9. Las diferencias en la actividad celular parecen ser el resultado de la tensión interna (o la falta de ella) que se desarrolla a medida que las células ejercen fuerzas de tracción a través de integrinas sobre las fibras de colágeno en el gel.

Una variante de esta técnica consiste en colocar explantes de fibroblastos(es decir, grupos de células) a una distancia de un gel de colágeno y observar las interacciones célula-matriz y el desarrollo gradual de la alineación de la fibra entre los explantes (a veces llamados correas similares a ligamentos)10-12. La principal ventaja del sistema explant es que permite organizar las células en patrones geométricos simples, lo que facilita la visualización y sonda de los mecanismos subyacentes a la realineación de fibras impulsadas por células. Estos patrones de alineación , que dependen principalmente de la interacción entre las fuerzas de tracción celular, la distribución espacial celular, la geometría del gel y las restricciones mecánicas en el gel , son importantes de entender porque desempeñan un papel central en la organización global del tejido, la función mecánica y el entorno mecánico local13.

En el campo de la ingeniería de tejidos, una estrategia para producir tejidos mecánicamente funcionales y de ingeniería implica controlar el patrón de alineación de fibras que se desarrolla a partir de la compactación celular para que el tejido diseñado posea una alineación de fibras que imite la del tejido nativo14,15. Tal alineación se cree necesaria para que los tejidos diseñados repliquen el comportamiento mecánico complejo de los tejidos nativos. Una modificación de esta estrategia es sustituir el gel de colágeno por un gel de fibrina16. El gel de fibrina desarrolla un patrón de alineación similar al de un gel de colágeno durante la compactación. Con el tiempo, la fibrina se degrada y se reemplaza con ECM sintetizado por células que sigue el patrón inicial de alineación de la fibra de fibrina. La construcción de ingeniería resultante ha mejorado significativamente las propiedades mecánicas en comparación con las construcciones derivadas del gel de colágeno17.

El proceso de alineación y los eventos de remodelación posteriores en geles de fibrina proceden de una manera complicada y poco entendida. Para caracterizar mejor estas interacciones y su efecto sobre el comportamiento celular y la remodelación de ecm, hemos desarrollado un procedimiento que se basa en el método explant. En este método, los explantes de fibroblastos se colocan en un gel de fibrina en diferentes patrones geométricos. Los geles se mantienen en un biorreactor18controlado ambientalmente y montado en un microscopio, y el proceso de compactación y realineación de la fibra se supervisa con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de lapso de tiempo. Los campos de desplazamiento se cuantifican con algoritmos personalizados. Los datos obtenidos de estos experimentos tienen implicaciones de amplia gama para una serie de procesos, incluyendo la optimización de las estrategias de ingeniería de tejidos, la mejora de la cicatrización de heridas y el tratamiento de la remodelación patológica del tejido.

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Protocolo

1. Preparación de la plantilla

Prepare una plantilla en Parafilm para diseñar la ubicación de cada explant, siguiendo la geometría deseada (Figuras 1A y 1B). Espaciar cada explanta aproximadamente 1-2 mm de distancia. Esta distancia corresponde a un espaciamiento ideal para generar alineación de fibras entre explantes. Coloque la plantilla debajo del área del vidrio de cubierta donde se preparará la muestra con cinta adhesiva.

2. Esterilización

Limpie a fondo todos los componentes del biorreactor usando etanol al 70% y esterilice durante 2-3 horas bajo luz UV antes de la experimentación. Si se está utilizando un recipiente alternativo en lugar de un biorreactor, se deben utilizar técnicas de esterilización adecuadas. Consulte el paso 4.12 para obtener comentarios sobre el uso de una placa de Petri con fondo de vidrio.

3. Preparación de gel de fibrina

Después de que los componentes del biorreactor hayan sido esterilizados, eche una capa delgada de gel de fibrina en la superficie del coverglass. Los detalles para preparar las soluciones del stock del fibrinógeno y de la trombina para hacer los geles de la fibrina de 6,6 mg/ml se describen en lijadora y otros. 13 Un protocolo similar por Ye et al. 19 para hacer geles de fibrina de 3,3 mg/ml también se puede ver en el sitio web de JoVE.

  1. Prepare una solución de microperlas fluorescentes en DMEM a una concentración de 10 millones de perlas/ml. Las cuentas se utilizarán para ayudar a rastrear los desplazamientos de gel. Para lograr esta concentración, combine 0,017 ml de solución de microperla y 0,149 ml de DMEM en un tubo de microcentrífuga.
  2. Sonicar esta suspensión durante 10 min para dispersar las cuentas y homogeneizar la solución.
  3. Solución de fibrina — En un tubo c de 15 ml, mezcle 0.22 ml de solución común de fibrinógeno con 0.44 ml de tampón HEPES de 20 mM. Añadir los 0,1667 ml de DMEM con microperlas creadas en el paso 3.1.
  4. Solución de trombina — En un tubo c separado de 15 ml, mezcle juntos 0.0328 ml de solución común de trombina, 0.131 ml de tampón HEPES de 20 mM, y 0.00246 ml de 2 M CaCl2.
  5. Mezcle cuidadosamente la solución de trombina (paso 3.4) con la solución de fibrinógeno (paso 3.3) pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5-10x hasta que la solución se distribuya uniformemente. Evite introducir burbujas tanto como sea posible. Para reducir la cantidad de burbujas producidas, tenga cuidado de no descargar completamente la pipeta mientras se mezcla.
  6. La adición de trombina hará que la solución se gelifique rápidamente (~ 30 seg). Pipetear la solución mixta en la cubierta de vidrio tan pronto como sea posible. Deje que el gel se polimerice en RT.
  7. Selle el biorreactor, inserte los bloques de calentamiento y conecte los termopares al controlador de temperatura. Incubar el gel a 37 °C durante 15-30 min.

4. Preparación de explantes celulares

  1. Retire el medio del matraz T-75 que contiene las células de fibroblastos dérmicos humanos.
  2. Enjuague cuidadosamente la superficie con aproximadamente 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las proteínas séricas. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA e incubar durante 3 min, o hasta que las células se hayan levantado.
  3. Después de que las células se han levantado, gire la suspensión hacia abajo en una centrífuga a 200 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y resuspiente el pellet en un volumen de DMEM que permitirá una concentración final de 20 millones de células/ml.
  4. Mientras las células están girando hacia abajo en la centrífuga desconecte el biorreactor de los bloques de calefacción y los termopares. Transfiera el biorreactor a un gabinete de bioseguridad y retire cuidadosamente la tapa siguiendo técnicas asceptivas.
  5. Cree explantes pipeteando 0,3 μl de la suspensión celular sobre el gel de fibrina polimerizada, siguiendo el patrón de la plantilla. Cada explant debe contener aproximadamente 6.000 células. Asegúrese de que se utilizan puntas de micropipeta de bajo volumen (0.1-10 μl).
  6. Deje que las células se asienten y se adhieran a la matriz de fibrina durante 1 hora a 37 °C.
  7. Con el biorreactor todavía abierto, agregue aproximadamente 5 ml de DMEM suplementado con suero bovino fetal del 10% (FBS), penicilina-estreptomicina del 1%, anfotericina B del 0,1%, y aprotinin de 10 mg/ml directamente en el compartimiento del biorreactor. DMEM es bicarbonato tamponado y requiere 5% de CO2 para mantener un pH neutro. Dado que el biorreactor no se suministra con CO2,acondicione el medio en una incubadora con 5% deCO2 durante 2-3 horas antes de su uso. La aprotinina es un inhibidor de la serina proteasa que es ampliamente utilizado para reducir la tasa de degradación de la fibrina20.
  8. Vuelva a seseer el biorreactor. Use una jeringa para administrar 5 ml adicionales de co2 acondicionado medio a través del accesorio de púas en el puerto de entrada. Dispense el medio lentamente y asegúrese de que todo el volumen de la cámara del biorreactor esté lleno. Retire cuidadosamente las burbujas que se forman en el biorreactor.
  9. Suministre un medio fresco acondicionado de CO2 al 5% al biorreactor durante todo el experimento para mantener el pH, suministrar nutrientes y eliminar los productos de desecho. Configure una bomba de jeringa con una jeringa de 10 ml o 30 ml llena de medio acondicionado de CO2 al 5%. Conecte la jeringa directamente al puerto de entrada en la tapa del biorreactor con el tubo estéril instalado en Luer-lock. Retire el accesorio macho y coloque el tubo en el accesorio de púas del biorreactor (consulte la Figura 1C).
  10. Establezca la tasa de perfusión en 0,01 ml/min. Conecte las piezas modificadas de tubería a ambos puertos de salida y coloque los extremos en un beaker de 100 ml para recoger los residuos.
  11. Utilice un conector de laboratorio para establecer las alturas de las alimentaciones de entrada y salida para que no se desarrolle un diferencial de presión en el biorreactor (consulte la Figura 1D para referencia).
  12. Si un biorreactor no está disponible, prepare muestras en placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm con tapas de vidrio. Utilice uno con un tamaño de cubrebocas que esté optimizado para el conjunto específico de objetivos que se utilizarán. Las muestras que se preparan en placas de Petri deben mantenerse en una incubadora a 37 °C y al 5% de CO2.
    Nota: El poliestireno despolariza la luz e interferirá con las imágenes DIC, por lo que se deben usar tapas de vidrio si se realizarán imágenes DIC. El contraste de fase es una modalidad alternativa conveniente de la proyección de imagen. La transferencia de platos entre la incubadora y el microscopio dificultará el registro de imágenes. Si las imágenes no se registran correctamente, la cepa calculada en la Sección 6 no será exacta.

5. Imágenes de lapso de tiempo

  1. Una vez que la muestra ha sido preparada, vuelva a sesecar el biorreactor, vuelva a conectar los bloques de calentamiento y los termopares, y ajuste la temperatura del biorreactor a 37 °C.
  2. Fije el biorreactor en la etapa motorizada montada en el microscopio. Coloque el objetivo DIC 20X bajo el puerto de vista. Un objetivo de aumento más bajo es aceptable, particularmente si una etapa motorizada de precisión no está disponible. Asegúrese de que el polarizador, el analizador y el prisma estén en su lugar. Alternativamente, las muestras también se pueden fotoizar utilizando el contraste de fase.
  3. Abra el software de imágenes.
  4. Centrar el objetivo en el área entre los tres explantes.
  5. Guarde las coordenadas (x, y y z) de esta ubicación en el software de creación de imágenes.
  6. Con el fin de obtener imágenes de toda el área entre y alrededor de los explantes, seleccione la opción de adquirir una imagen grande y especifique el tamaño del área. Esto permitirá la adquisición de varias imágenes alrededor del área especificada y creará una imagen en mosaico que representa una región más grande de la muestra.
  7. Establezca el tiempo de exposición y la intensidad de la luz en los valores más bajos posibles para evitar la muerte celular causada por la fototoxicidad, al tiempo que proporciona una resolución suficiente para discriminar entre células, microperlas y fibras de fibrina.

6. Seguimiento de cepas

Para obtener más información e instrucciones sobre el software de seguimiento de cepas (Figura 2) utilizado, consulte Raghupathy et al. 21 El algoritmo es un código MATLAB personalizado que se puede descargar desde http://www.license.umn.edu/default.aspx. Tenga en cuenta que las imágenes DIC a menudo tienen suficiente textura para el seguimiento de la deformación. Las microperlas se incluyen para servir como un control en los campos de deformación calculados. Si se va a realizar un seguimiento de la deformación, es fundamental que las imágenes obtenidas se tomen exactamente en el mismo lugar para que las imágenes se registren. Las imágenes no registradas producirán cepas espurias.

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Resultados

La remodelación de tejidos es un proceso complejo que es impulsado en parte por interacciones físicas recíprocas entre las células y la matriz circundante. Las células reorganizan las fibras circundantes y generan tensión en la red de fibra. La alineación de las fibras y el entorno mecánico a su vez controla el comportamiento celular, de modo que tanto las células como la matriz se reorganizan globalmente para producir tejido remodelado. En este experimento, las células de los explantes, inicialmente redondas en morfolog...

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Discusión

Este protocolo fue desarrollado con el propósito de observar y cuantificar la mecánica involucrada en la remodelación de ECM mediada por células. Tales procesos son la base de una serie de fenómenos biológicos y tienen implicaciones importantes para la ingeniería de tejidos2,22,la reducción de la cicatriz1,23,y la comprensión de la remodelación patológica de los tejidos12,24. El uso de la microscopia DIC del lapso de tiempo permite que uno resuelva y cuantifique la dislocación y la alinea...

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Divulgaciones

No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a George Giudice y Steven Eliason por donar fibroblastos dérmicos humanos y a Ramesh Raghupathy por su ayuda con el algoritmo de seguimiento de cepas. El apoyo para este trabajo fue proporcionado por una beca de asistencia para graduados del Departamento de Educación de los Estados Unidos en áreas de necesidad nacional (GAANN P200A120071).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sigma-AldrichF8630
Sigma-AldrichT4648
Gibco11965-092
Gibco15140-122
Sigma-AldrichA2942
Sigma-AldrichH0887
Sigma-Aldrich223506
Gibco25200-056
Invitrogen3000
LonzaDE14-701F
Sondas molecularesF8858
GIBCOA10483-01
GIBCO11430-030
Fisher-ScientificSS264-1
Sigma-AldrichA3428-25MG
Biorreactor BiotensaADMET
Microscopio Ti-EclipeNikon
# 0 35 mm Placa de Petri con Fondo de VidrioMatTekP35G-0-20-C
# 0 35 mm Placa de Petri con tapa de vidrioMatTekP35GTOP-0-20-C
Accesorios Luer de plástico, tubos de PVC con extremos LuerCole-Parmer30600-65

Referencias

  1. Grinnell, F., Petroll WM, Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
  2. Sander, E. A., Barocas, V. H. Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , Springer. New York. (2008).
  3. Pedersen JA,, Swartz MA, Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  4. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
  5. Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
  6. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
  7. Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
  8. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
  9. Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
  10. Stopak, D., Harris AK, Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  11. Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
  12. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
  13. Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
  14. Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
  15. Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
  16. Robinson PS,, Robinson PS, Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
  17. Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
  18. Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
  19. Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
  20. Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
  21. Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
  22. Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
  23. Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
  24. PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  25. Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
  26. Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
  27. Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
  28. De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).
  29. Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).

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