Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

Resumen

Hemos desarrollado un modelo in vitro que imita un componente importante de la respuesta inflamatoria aguda durante la infección de la vejiga con Escherichia coli uropatógena. El ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial permite la evaluación cuantitativa de la migración de neutrófilos humanos a través de los epitelios de la vejiga, se cultivaron en soportes permeables, en respuesta a la infección bacteriana o sustancias quimioatrayentes.

Resumen

El reclutamiento de células inmunes desde la periferia hacia el sitio de la inflamación es un paso esencial en la respuesta inmune innata en cualquier superficie de la mucosa. Durante la infección de la vejiga urinaria, los leucocitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) migran desde el torrente sanguíneo y atraviesan el epitelio de la vejiga. La incapacidad de resolver la infección en ausencia de una respuesta neutrofílica demuestra la importancia de los PMN en la defensa de la vejiga. Para facilitar la colonización del epitelio de la vejiga, uropatógena de Escherichia coli (UPEC), el agente causante de la mayoría de las infecciones del tracto urinario (ITU), amortiguar la respuesta inflamatoria aguda utilizando una variedad de mecanismos parcialmente definidas. Para investigar más a fondo la interacción entre el huésped y el patógeno bacteriano, hemos desarrollado un modelo in vitro de este aspecto de la respuesta inmune innata a la UPEC. En el ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial, una variación en la cámara de Boyden, epith vejiga cultivadasElial células se cultivan hasta la confluencia en la parte inferior de un soporte permeable. PMN se aíslan a partir de sangre venosa humana y se aplica a la cara basolateral de las capas de células epiteliales de la vejiga. Migración de PMN que representa la dirección basolateral a apical fisiológicamente relevantes en respuesta a la infección bacteriana o moléculas quimioatrayentes se enumera usando un hemocitómetro. Este modelo se puede utilizar para investigar las interacciones entre la UPEC y células eucariotas, así como para interrogar a los requisitos moleculares para el recorrido de los epitelios de la vejiga por los PMN. El modelo de la migración de neutrófilos transuroepithelial será mejorar nuestra comprensión de la respuesta inflamatoria inicial a la UPEC en la vejiga.

Introducción

El movimiento de las células en todo el cuerpo, a menudo a través de largas distancias, se requiere para el crecimiento y el desarrollo, la curación de heridas, y la respuesta inmune. La migración celular es complejo y requiere la coordinación de muchos procesos diferentes, incluyendo cascadas de señalización y la reordenación de los componentes del citoesqueleto. Las células pueden moverse al azar (quimiocinesis), así como hacia gradientes químicos definidos (quimiotaxis). Muchas técnicas se han desarrollado para estudiar la migración celular in vitro. La técnica más antigua y más común, la cámara de Boyden, consiste en un sistema de dos cámaras verticales cuando una sustancia quimiotáctica se coloca en la cámara inferior y células de interés se colocan en la cámara superior ^1. El movimiento de las células a través del filtro permeable, con poros de tamaño definido, que separa las dos cámaras se controla. Otras técnicas se han desarrollado para investigar la migración de células, incluyendo la cámara de Zigmond ² y la cámara de Dunn^3. Estos enfoques colectivos han aportado una información valiosa sobre el movimiento de muchos tipos de células diferentes.

Además de interrogar a los principios básicos de la quimiocinesis y la quimiotaxis, ensayos de dos cámaras han facilitado la investigación de la migración celular a través de componentes de la matriz extracelular y ambas capas de células endoteliales y epiteliales. Una ventaja de los sistemas de dos cámaras sobre otras técnicas es que la membrana porosa se puede recubrir con proteínas tales como colágeno o fibrinógeno, y la migración de células a través de una barrera de matriz extracelular se puede evaluar. Además, las líneas de células cultivadas se pueden cultivar y diferenciar en los soportes permeables. Para investigar el movimiento de las células a través de una barrera endotelial, células endoteliales cultivadas se siembran y cultivan en el depósito superior de los soportes permeables. Células móviles, tales como las células inmunes, se añaden al depósito superior y la migración en el depósito inferior a través de la linease observa barrera endotelial en la dirección fisiológica-apical a basolateral. Este modelo ha sido muy valioso para la comprensión de la extravasación de las células inmunes de la sangre. En contraste con la migración transendotelial, el movimiento de las células a través de una barrera epitelial se produce normalmente en la dirección basolateral a apical. Con el fin de modelar estos eventos in vitro, los investigadores siembran y crecen las células epiteliales cultivadas en la parte inferior de los soportes permeables. Células móviles se añaden al depósito superior y la migración a través de la barrera epitelial, que representa la dirección basolateral a apical, se supervisa. Estos modelos de la migración transepitelial han contribuido significativamente a nuestra comprensión de las respuestas inflamatorias en las superficies de las mucosas, especialmente los de pulmón y el intestino ^4,5.

En contraste, el tráfico de células inmune a través del epitelio de las vías urinarias ha recibido mucha menos atención. Para avanzar en nuestra understanding de la respuesta inmune innata en el tracto urinario durante la infección con uropatógena de Escherichia coli (UPEC), hemos desarrollado un ensayo in vitro, el ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial, que permite la investigación de leucocitos polimorfonucleares (PMN; neutrófilos) movimiento a través de una barrera epitelial de la vejiga ^{6 -8.} Al igual que con otros modelos de dos cámaras de la migración transepitelial, células epiteliales de la vejiga humanas cultivadas se cultivan en la parte inferior de un soporte permeable y forman capas epiteliales confluentes. Los neutrófilos humanos, aislados a partir de sangre venosa, se aplican a la parte basolateral de la capa epitelial, y la migración a través del epitelio en la dirección basolateral a apical fisiológicamente relevante se cuantifica en respuesta a la infección con diferentes cepas de E. coli o la presencia de moléculas quimioatrayentes. Mucha investigación se ha centrado en el movimiento de los neutrófilos, tanto chemokinesis y quimiotaxis, en ausencia de otros tipos de células. El ensayo de la migración de neutrófilos transuroepithelial es ventajoso, ya que toma en cuenta las interacciones complejas entre las células epiteliales de la vejiga y de células inmunes durante la infección. Este modelo tratables in vitro tiene el potencial de permitir la investigación detallada de la respuesta inmune en superficies uroepiteliales.

Protocolo

1. El cultivo de 5.637 células de la vejiga epiteliales

Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar preparado con la irradiación UV y limpiada con etanol al 70%.

1. Prepare medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) [denominado RPMI +], esterilizar por filtración usando un filtro de 0,22 micras de tamaño de poro, y se calienta a 37 ° C en un baño de agua.
2. Descongelar un criovial de 5.637 células (American Type Culture Collection HTB-9; derivada de carcinoma de vejiga) en un 37 ° C baño de agua. Transfiera rápidamente las células descongeladas a un matraz de cultivo tisular de 75 ^cm2 contiene 20 ml de RPMI +.
3. Incubar el matraz a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO ₂ hasta que las células son de aproximadamente 95% de confluencia (~ 6 x 10 ⁶ células por matraz), alrededor de 4 días.
4. Para subcultivar las células 5637:
   1. Retire el medio de la petaca. Lavar las células con 10 ml de Dulbecco tamponada con fosfato Saline (DPBS) a temperatura ambiente.
   2. Añadir 6 ml de agua tibia (37 ° C) 0,05% de tripsina, solución de EDTA 0,02% al matraz, y se incuba a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 15 min.
   3. Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml, y sedimento por centrifugación a 300 xg durante 5 min. Retire la solución de tripsina / EDTA.
   4. Resuspender las células en 6 ml de RPMI + (10 ⁶ células / ml), y de transferencia de 1 ml (10 ⁶ células) a un nuevo matraz de 75 cm ² que contiene 20 ml de RPMI +.
5. Repita el paso 1.4 subcultivar células cada 4 días o cuando las células alcanzan el 95% de confluencia.

2. Sembrando y Creciendo 5.637 celdas en soportes permeables

Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica aséptica. Para obtener resultados óptimos, utilice 5.637 células que han sufrido menos de 10 subculturas.

1. Usando una pinza estéril, invertir los soportes permeables en un 25 mm placa de cultivo de tejido profundo estéril.
2. trypsinize un 75 cm ² frasco de 5.637 células a 95% de confluencia de acuerdo a los pasos 1.4.1-1.4.3.
3. Usando una pipeta de 1000 l, resuspender suavemente las células en ~ 2 ml de RPMI + a una concentración de 3 x 10 ⁶ células / ml, determinado por recuento de células usando un hemocitómetro.
4. Aplicar 50 l de la suspensión celular (1,5 x 10 ⁵ células) a cada soporte permeable sin tocar la membrana. Coloque la tapa en el plato y coloque cuidadosamente el plato a 37 ° C con 5% de _CO2 durante no más de 16 horas.
5. Usando una pinza estéril, a la derecha los soportes permeables en una placa de 24 pocillos que contenía 0,6 ml de RPMI + por pocillo. Añadir 0,1 ml de RPMI + para el depósito superior de cada soporte permeable. Incubar a 37 ° C con 5% de CO _2.
6. Sustituya el medio cada 2 días. En primer lugar, el medio aspirado desde el depósito superior seguido por el depósito inferior, y luego se aplica fresco RPMI + en el orden inverso, para el depósito inferior (0,6 ml) y después la parte superior reservoir (0,1 ml).
7. Siete días después de la siembra de los soportes permeables con 5637 células, evaluar confluencia de las células. Llene el depósito superior con RPMI + (~ 0,35 ml). Las células están suficientemente confluentes cuando el medio no se equilibre entre los depósitos superior e inferior.

3. Preparación del inóculo bacteriano

1. Utilizando una técnica aséptica, añadir 20 ml de caldo de cultivo apropiado a un matraz de 250 ml con una tapa. Utilice Luria-Bertani (LB) caldo para E. coli culturas y añadir antibióticos al caldo en su caso.
2. El uso de un asa de siembra estéril, inocular el caldo con las bacterias de la madre de glicerol o una placa de racha. Para las cepas UPEC, incubar el cultivo de bacterias a 37 ° C durante aproximadamente 16 horas, sin agitación (para promover la producción de pili tipo 1).
3. Transferir el cultivo bacteriano a un tubo de centrífuga. Sedimenten las bacterias por centrifugación a 8000 xg durante 10 min.
4. Decantar el sobrenadante, Y resuspender las bacterias en PBS a OD ₆₀₀ = 1,000, equivalente a ~ 10 ⁹ UFC / ml.
   1. Para generar un estímulo bacteriana muerta por calor, incubar una alícuota (por ejemplo, ~ 1,5 x 10 ⁸ UFC en 150 l) de las bacterias se resuspendieron a 55 ° C durante 30 min. Placa de una alícuota de la suspensión de calor mató a confirmar la muerte bacteriana.
5. Inmediatamente antes de su uso, diluir las bacterias resuspendidas (vivos o muertos-calor) de 10 veces a 10 ⁸ UFC / ml en caliente sin suero RPMI [denominado RPMI-] en un tubo de microcentrífuga.

4. Aislamiento de los neutrófilos humanos de sangre periférica

La recolección de sangre de voluntarios adultos requiere la revisión y la aprobación de una junta de revisión institucional de antelación. Use el equipo de protección personal apropiado y disponer adecuadamente de materiales peligrosos para evitar la exposición a la sangre humana.

1. Aproximadamente 25 ml de sangre venosa de un adulto sano vVOLUNTARIO debe arrastrar a 3 tubos de recogida de sangre que contiene heparina de sodio estéril por el personal capacitado en la flebotomía.
   1. Envuelva un torniquete de goma alrededor de la parte superior del brazo, por encima del codo.
   2. Desinfectar el sitio de entrada, la fosa antecubital, utilizando un 70% de alcohol estéril limpiar.
   3. Fije un soporte de tubo de plástico a un sistema de agujas de alas de mariposa.
   4. Inserte la aguja en una vena antecubital en un ángulo de 30 º o menos, bisel hacia arriba. La aguja ha perforado la vena cuando un chorro de sangre aparece en el tubo de plástico.
   5. Insertar un tubo de recogida de sangre en el soporte de tubo de plástico. Cuando el primer tubo de recogida está lleno, cámbielo por otro del segundo tubo de recogida. Repita con el tercer tubo.
   6. Cuando el tercer tubo de recogida es de aproximadamente la mitad, retire el torniquete.
   7. Cubra el sitio de punción con un algodón estéril y retire lentamente la aguja de la vena. Deslice el escudo protector sobre la aguja y el lugar en el quena de riesgo biológico Envase de los sostenidos.
   8. Aplique presión sobre la zona de punción. Cubra la bola sitio de la punción y el algodón con un vendaje adhesivo.
   9. Invierta suavemente los tubos de recogida de sangre para dispersar a la heparina.

Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica aséptica.

2. Usando una pipeta de 10 ml, transferir suavemente la sangre a un tubo cónico de 50 ml estériles fresco. Añadir un volumen equivalente de 3% (W / V) de dextrano en NaCl al 0,9% y se mezcla por inversión. Incubar el tubo en posición vertical a temperatura ambiente durante 20 min.
3. Sin perturbar la capa inferior, aspirar cuidadosamente la capa superior y la transfiere a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min. Eliminar el sobrenadante.
4. Resuspender el sedimento celular en un volumen de 0,9% de NaCl equivalente al volumen de partida de la sangre.
5. Capa 10 ml de solución de centrifugación de densidad en virtud de la suspensión de células, pla reserva de la interfaz entre las dos fases. Centrifugar a 400 xg durante 30 min sin freno. Eliminar el sobrenadante.
6. Para lisar las células rojas de la sangre restantes, resuspender el sedimento celular en 10 ml de frío 0,2% de NaCl. Incubar durante 30 segundos, y luego añadir rápidamente 10 ml de frío 1,6% de NaCl para restablecer la isotonicidad.
7. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 6 min. Eliminar el sobrenadante.
8. Repetir los pasos 4.6 a 4.7 hasta que el sedimento celular parece estar libre de células rojas de la sangre, típicamente 3 rondas de lisis.
9. Usando una pipeta de 1000 l, resuspender el sedimento celular, principalmente de PMN, en caliente (37 ° C) RPMI-a una concentración de 10 ⁷ células / ml, determinada por recuento de células usando un hemocitómetro. Mantener las células a 37 ° C hasta su uso. Típicamente, la viabilidad de PMN y la pureza son> 99% según la evaluación por exclusión de azul de tripano y la visualización de la morfología nuclear después de la tinción, respectivamente.

5. Transuroepithelial neutrófilos Migración Comodecir

Realice los siguientes pasos en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica aséptica. Utilice sólo soportes permeables teniendo confluentes 5637 capas de células, tal como se determina en el paso 2.7. Las placas de 24 pocillos que contienen medio RPMI-se pueden preparar por adelantado y se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO ₂ hasta su uso.

1. Alícuota 1 ml calentar RPMI-por pocillo en una placa de 24 pocillos, preparar 3 pocillos por soporte permeable.
2. Aspirar el medio desde los depósitos superior e inferior de los soportes permeables.
3. Usando una pinza estéril, transferir los soportes permeables a la placa de 24 pocillos preparada en el paso 5.1. Lavar los soportes permeables tres veces mediante la transferencia de los soportes de un pozo a otro.
4. Si un inóculo bacteriano se va a utilizar, invertir los soportes permeables en un 25 mm de placa de cultivo de tejido profundo estéril. Si un quimioatrayente (por ejemplo, N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF) o IL-8) es para ser utilizado, continúe en el paso 5.6.
5. Para experimentos con bact vivo o muertoestímulos erial, inocular el lado apical de cada soporte permeable con 60 l de RPMI-(infección simulada) o con el inóculo bacteriano (6 x 10 ⁶ UFC) preparado en la etapa 3.5. Coloque la tapa en la placa y se incuba a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 1 hora.
6. Añadir 0,6 ml de RPMI-por pocillo a una placa de 24 pocillos de bajo apego; preparar 1 bien por soporte permeable. Preparar 3 pocillos que contenían 0,5 ml de RPMI-enumerar entrada PMN.
   1. Si un quimioatrayente se está utilizando en lugar de bacterias, añadir el quimioatrayente a 0,6 ml de RPMI-en la placa de 24 pocillos preparada en la etapa 5.6.
7. El derecho de los soportes permeables en la placa de 24 pocillos de bajo apego.
8. Añadir 0,1 ml de PMN (10 ⁶ PMN), preparado en la etapa 4.9, con el depósito superior (lado basolateral) de cada soporte permeable. Añadir 100 l de PMN directamente a los pocillos que contienen 500 l de RPMI-. Incubar a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 1 hora.
9. Usando una pinza estéril, raspar suavemente elmembrana del soporte permeable contra el borde del pozo para eliminar los PMN adicional de la parte apical y luego disponer del soporte.
10. Recoger PMN raspando suavemente la parte inferior de cada pocillo con la punta de pipeta 1.000 l, y la transferencia de las suspensiones de PMN a Microfuge tubos.
11. Enumerar PMN usando un hemocitómetro.
12. Para calcular el número total de PMN en el depósito inferior, se multiplica el número de PMN en 1 mm ² (100 nl) de 6000. Los datos pueden ser reportados como un porcentaje de los PMN de entrada, o como números de PMN normalizaron a 10 ⁶ PMN de entrada.

Resultados

El ensayo de migración de neutrófilos transuroepithelial permite la evaluación cuantitativa de la migración de PMN humano a través de capas de células epiteliales de la vejiga cultivadas en respuesta a diversos estímulos (Figura 1B). Mientras que el protocolo es sencillo, hay un número de variables que pueden influir en la migración de PMN y por consiguiente afectar a la reproducibilidad de este ensayo. Se deberían tomar medidas, mientras que la preparación de los soportes permeables y el PMN para reduc...

Discusión

Usando una línea de células epiteliales cultivadas de la vejiga y recién aisladas PMN humanos, establecimos un modelo in vitro de la migración de neutrófilos transuroepithelial. Este modelo ha sido instrumental en el inicio de diseccionar la complejidad de la respuesta inmune innata durante la infección del tracto urinario (ITU), una infección bacteriana muy común por lo general causada por la UPEC ^9. Durante la infección de la vejiga, o cistitis, el reclutamiento de los PMN al lumen de la vejiga es ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plaquitas Transwell (i.e.  soportes permeables)	Corning	3472	6,5 mm, 3 μ m poro, inserto de membrana de poliéster
BD Vacutainer Tubos de extracción de sangre	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	Tubos de 16 mm x 100 mm x 10 ml con tapa verde que contienen heparina sódica
BD Safety-Lok Set de extracción de sangre e infusión	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 g x 0,75 pulgadas aguja x 12 pulgadas tubo
BD Vacutainer de un uso, soporte no apilable	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	De Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS solución de centrifugación de densidad	GE Healthcare	17-1440-02
Placas de fijación ultra bajas	Corning	3473	24 pocillos, fondo
plano transparenteN-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	reconstituido en DMSO a 10 mM
humano recombinante CXCL8/IL-8	R& D Systems	208-IL	reconstituido en PBS a 100 μ g/ml