Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

Resumen

La preparación de extractos de células de levadura de alta calidad es un primer paso necesario en el análisis de las proteínas individuales o proteomas completos. Aquí se describe un protocolo de homogeneización rápida, eficiente y fiable para las células de levadura en ciernes que ha sido optimizada para conservar funciones de las proteínas, las interacciones y las modificaciones posteriores a la traducción.

Resumen

Homogeneización por golpeo del talón es una manera rápida y eficiente para liberar el ADN, ARN, proteínas y metabolitos a partir de células de levadura en ciernes, que son notoriamente difícil de interrumpir. Aquí se describe el uso de un homogeneizador de molino de bolas para la extracción de las proteínas en tampones optimizados para mantener las funciones, interacciones y modificaciones post-traduccionales de las proteínas. Células de crecimiento logarítmico que expresan la proteína de interés se cultivan en un medio de cultivo líquido de elección. Los medios de cultivo pueden suplementarse con reactivos para inducir la expresión de la proteína a partir de promotores inducibles (por ejemplo, galactosa), sincronizar la fase del ciclo celular (por ejemplo, nocodazol), o inhibir la función del proteasoma (por ejemplo, MG132). Las células se sedimentaron después y se resuspendieron en un tampón adecuado que contiene proteasa y / o inhibidores de la fosfatasa y se procesan inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido para su uso posterior. La homogeneización se lleva a cabo seis ciclos de 20 seg bead-latido (5,5 m / seg), cada una seguida por una incubación minutos en hielo. El homogeneizado resultante se aclaró por centrifugación y las partículas pequeñas se puede retirar por filtración. El extracto de células enteras aclarado resultante (WCE) se precipitó usando TCA al 20% para el análisis directo de proteínas totales por SDS-PAGE seguida de Western Blot. Los extractos también son adecuados para la purificación por afinidad de proteínas específicas, la detección de modificaciones post-traduccionales, o el análisis de proteínas co-purificación. Como es el caso para la mayoría de los protocolos de purificación de proteínas, algunas enzimas y proteínas pueden requerir condiciones únicas o composiciones tampón para su purificación y otros pueden ser inestables o insolubles en las condiciones indicadas. En este último caso, el protocolo presentado puede proporcionar un punto de partida útil para determinar empíricamente la mejor estrategia de cordón-latido para la extracción y purificación de proteínas. Se demuestra la extracción y purificación de un epítopo de etiquetado SUMO E3 ligasa, Siz1, un ciclo celularregulada proteína que se convierte en tanto sumoylated y fosforilados, así como una subunidad de ubiquitina ligasa SUMO-dirigida, Slx5.

Introducción

El asombroso poder de la genética de la levadura es legendaria, pero la preparación y el análisis de las proteínas nativas de levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, es a menudo lleno de problemas. Este último es debido a la considerable resistencia mecánica y la elasticidad de la pared celular de levadura ^1. Diferentes medios han sido descritos para la enzimática, química, mecánica, y la presión basada en la interrupción de las células de levadura para obtener extracto de proteína de células enteras ^2-6. Estas técnicas varían ampliamente en su eficacia para producir extractos de proteínas de células nativas representativas, que ....

Protocolo

Purificación de proteínas marcadas con 6xHis expresadas en células de levadura en ciernes en condiciones nativas

1. Crecimiento de células de levadura y la inducción de la expresión de la proteína

(Modificado de ²⁾

OPCIONAL: Usa logarítmicamente crecientes cultivos de levaduras que expresan la proteína de interés en lugar de los cultivos inducidos por galactosa se describen a continuación.

1. Transformar células de una cepa de levadura Gal ⁺ con un plásmido que codifica una proteína inducible por galactosa de elección 6xHis de etiquetado. Por ejemplo, véase la lista de reacti....

Resultados

Nuestros resultados representativos revelan que el protocolo de extracción del talón-latido y proteína descrita es útil para la preparación reproducible de proteínas para una variedad de aplicaciones aguas abajo (que se resumen en la Tabla 2). SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie de WCE muestran que una amplia gama de proteínas (~ 12 a> 250 kDa) se puede reproducible extrae de las células de levadura (Figura 1A). Bandas discretas más de una gama de pesos moleculares son indicati.......

Discusión

Este protocolo se centra en la preparación de intacta, nativa, y después de la traducción modificada proteínas a partir de células de levadura en ciernes para aplicaciones de corriente abajo. Antes de intentar este protocolo, es fundamental para determinar si la proteína de interés puede ser fácilmente detectado en extractos proteicos preparados bajo condiciones de desnaturalización ^12. Si los anticuerpos policlonales no están disponibles, puede ser ventajoso epítopo etiqueta de la proteína de interés de mane.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Cepa de levadura ORF en BG1805	ThermoScientific	YSC3869	cepa de levadura GAL+ que se puede utilizar para la inducción y extracción
pYES2.1 TOPO vector	Technologies	K4150-01	Cepa de levadura GAL+ que se puede utilizar para la inducción y la extracción; contiene un cóctel de un solo uso V5/6xHIS
tag Halt Protease Inhibitor ( 100x)	Thermo Scientific	1860932
Tubo con faldón de 2,0 ml con tapón de rosca atado	BioExpress	C-3369-3	Asegúrese de que el tubo encaje correctamente en el separador de cuentas
Perlas de vidrio, lavadas con ácido, 425-600 y micro; m (30-40 tamiz de EE. UU.)	Sigma-Aldrich	G8772
Filtros de tubo de centrífuga Corning Costar Spin-X	Sigma-Aldrich	CLS8161	Uso para el filtrado adicional de lisado clarificado
TALON Resina de afinidad metálica	Clontech 635502		Para la purificación de proteínas marcadas con 6xHIS
Tampón de muestras NuPAGE LDS (4x)	Life Technologies	NP0007	Para preparar y/o eluir muestras antes de SDS-PAGE y Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	geles prefabricados utilizados a menudo para SDS-PAGE antes de Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	Tinción de gel de proteínas
Tampón de lisis de mamíferos	Promega	G9381	Tampón de lisis comercial alternativo
Anti-V5 agarosa	Sigma	A7345	Método de inmunoprecipitación
ECL	Millipore	WBKL S0 050
Membrana de PVDF	Millipore	IPVH00010
geles BIS-TRIS	Technologies	NP0321BOX
anticuerpo anti-myc	Covance	mms-150R
anticuerpo secundario	Abcam	ab97040	pAb de cabra a ratón IgG (HRP)

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