Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

Laura L. Smith; Alan H. Beggs; Vandana A. Gupta

doi:10.3791/50925

Artículo de método

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

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DOI:

10.3791/50925

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13 de diciembre de 2013

Laura L. Smith¹ , Alan H. Beggs¹ , Vandana A. Gupta¹

¹Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

En este artículo

Resumen

El pez cebra es ahora una herramienta establecida y poderosa para modelar distrofias musculares, miopatías congénitas y enfermedades neuromusculares relacionadas. La birrefringencia y el comportamiento de escape evocado por el tacto son dos ensayos no invasivos comunes que se utilizan para determinar el grado de desorganización muscular y deterioro locomotor de los embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano.

Resumen

El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en una herramienta particularmente eficaz para modelar enfermedades humanas que afectan al músculo esquelético, incluyendo distrofias musculares^1-3, miopatías congénitas^4,5 e interrupciones en el ensamblaje sarcomérico^6,7, debido a la alta conservación genómica y estructural con mamíferos⁸. La desorganización muscular y el deterioro locomotor se pueden evaluar rápidamente en el pez cebra durante los primeros días después de la fertilización. Dos ensayos para ayudar a caracterizar los defectos del músculo esquelético en el pez cebra son la birrefringencia (estructural) y la respuesta de escape evocada por el tacto (conductual).

La birrefringencia es una propiedad física en la que la luz gira a medida que pasa a través de la materia ordenada, como la matriz pseudocristalina de los sarcómeros musculares⁹. Es un enfoque simple y no invasivo para evaluar la integridad muscular en larvas de pez cebra translúcidas en las primeras etapas del desarrollo. Los peces cebra de tipo salvaje con músculo esquelético altamente organizado parecen muy brillantes en medio de un fondo oscuro cuando se visualizan entre dos filtros de luz polarizados, mientras que los mutantes musculares tienen patrones de birrefringencia específicos para el trastorno muscular primario que modelan. Las distrofias musculares modeladoras del pez cebra, enfermedades caracterizadas por la degeneración de las miofibras seguida de rondas repetidas de regeneración, exhiben manchas oscuras degenerativas en el músculo esquelético bajo luz polarizada. Las miopatías no distróficas no se asocian con necrosis o cambios regenerativos, pero dan lugar a miofibras desorganizadas y debilidad del músculo esquelético. El pez cebra miopático suele mostrar una reducción general de la birrefringencia, lo que refleja la desorganización de los sarcómeros.

El ensayo de escape evocado por el tacto consiste en observar el comportamiento de natación de un embrión en respuesta a la estimulación táctil^10-12. En comparación con las larvas de tipo salvaje, las larvas mutantes muestran con frecuencia una contracción de escape débil, seguida de una natación lenta u otro tipo de movimiento deteriorado que no logra impulsar a las larvas más que^{una distancia corta}. La ventaja de estos ensayos es que la progresión de la enfermedad en el mismo tipo de pez se puede monitorear in vivo durante varios días, y que se puede analizar un gran número de peces en poco tiempo en relación con los vertebrados superiores.

Protocolo

1. Análisis in vivo de la estructura del músculo esquelético por birrefringencia

Prepare jaulas de apareamiento que separen a los machos de las hembras de la línea de pez cebra deseada a última hora de la tarde después de alimentarse.
1. Distinga a las hembras por su vientre más grande y su ligera coloración azul/blanca, y a los machos por su forma corporal esbelta y sus tonos rosados/amarillos.
2. El éxito con los cruces por parejas (un macho y una hembra) puede ser solo del 50%. Para una mayor tasa de éxito, aparee un macho con 2-3 hembras.
Retire los divisores de la jaula a la mañana siguiente, poco después del inicio de la luz, y permita que los peces desoven sin ser molestados.
Recoja los huevos con un colador cuando se haya puesto un número suficiente de huevos fertilizados en el fondo del tanque.
Transfiera los embriones a una placa de Petri profunda enjuagando el colador con agua de pescado y devuelva los peces padres a sus tanques. Coloque las placas de embriones en una incubadora a 28,5 °C.
Limpie los huevos inviables y los desechos más tarde ese día o a la mañana siguiente, y devuelva los embriones a la incubadora para que sigan creciendo.
Los embriones/larvas alcanzan la edad adecuada para observar birrefringencia a los 3-7 días después de la fertilización (dpf), ya que los resultados anteriores a 3 dpf pueden sufrir un contraste limitado. Los embriones de tipo salvaje eclosionan de sus coriones entre 48 y 60 horas después de la fertilización (hpf), seguida de un enderezamiento del eje del cuerpo. Los embriones de tipo salvaje o mutantes de eclosión tardía pueden requerir decorionación manual.
1. Haz suavemente un desgarro en el corion con pinzas afiladas y gíralo boca abajo para que el embrión se caiga.
2. Permita que los embriones decorionados se enderezen antes de comenzar el ensayo.
3. Anestesiar el/los embrión/es con tricaína (0,04% en agua de pescado) para ayudar en su correcta posición.
Coloque un microscopio de disección con una lente polarizada que se pueda girar para ajustar el ángulo de la luz polarizada (Figura 1A).
Coloque los embriones anestesiados y decorionados directamente encima de una segunda lente polarizada a lo largo del eje lateral del cuerpo. La segunda lente debe colocarse debajo de la lente superior, en la platina del microscopio (Figura 1B). No utilice placas de Petri de plástico en ningún momento durante el ensayo de birrefringencia, ya que el plástico no es un medio adecuado para la transmisión de luz refractada.
Gire la lente superior con el embrión de interés a la vista hasta que los ejes de polarización de las dos lentes estén orientados a 90° entre sí y el fondo esté completamente oscuro.
El resultado óptimo del ensayo depende de la orientación de los peces entre dos lentes polarizadas. Mueve los peces para asegurarte de que estén acostados lo más planos posible.
1. Si el pez es curvo, solo los segmentos con esta orientación plana pasarán la luz polarizada y exhibirán birrefringencia. En tales casos, mida la birrefringencia en las áreas planas y registre la birrefringencia del área correspondiente en los peces de tipo salvaje (por ejemplo, somitas 1-10 tanto en peces de tipo salvaje como mutantes).
Observa el fenotipo birrefringente de los peces.
1. Los peces de tipo salvaje con músculo esquelético altamente organizado muestran birrefringencia brillante, ya que el índice de refracción de la luz paralela a los miofilamentos es mayor que la luz polarizada perpendicular a estas estructuras.
2. Los peces con músculo esquelético desorganizado que sugiere una miopatía no degenerativa o un defecto del desarrollo suelen mostrar una reducción general de la birrefringencia.
3. Los peces con músculo esquelético desorganizado característico de una distrofia muscular comúnmente exhiben un patrón de birrefringencia en forma de parche, con áreas oscuras que representan la degeneración muscular entre áreas brillantes de arquitectura muscular normal.
Cuantifique la birrefringencia tomando imágenes de peces de tipo salvaje y mutantes bajo luz polarizada con los mismos ajustes de exposición y aumento. Guarde las imágenes como archivos .tiff.
1. Abra imágenes de birrefringencia en el software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
2. Para cada imagen, seleccione el área del músculo del pez cebra dibujando una línea alrededor del cuerpo usando la opción "Selecciones de polígonos" de la barra de herramientas.
3. Utilice "Establecer mediciones" en el menú desplegable "Analizar" para seleccionar las estadísticas necesarias para la imagen.
  1. La selección mínima requiere que las casillas "Área", "Valor medio de grises" y "Valor de gris mínimo y máximo" estén marcadas.
  2. Un valor de gris máximo de >255 indicará saturación de píxeles. Por lo tanto, utilice imágenes con valores máximos de gris inferiores a 255.
4. Normalice la intensidad media con el área seleccionada y repita este mismo procedimiento de cuantificación para cada imagen birrefringencia.

2. Ensayo de Comportamiento de Escape Evocado por el Tacto

Establezca parejas de apareamiento de la(s) línea(s) de pez cebra apropiada(s) y recoja los embriones como se describe anteriormente en los pasos 1.1-1.5.
A los 2-7 días después de la fertilización, coloque los embriones/larvas decorionados individualmente en una placa de Petri profunda o en las cámaras de placas de pocillos múltiples.
Trabajando con un solo embrión a la vez, centre el embrión en el campo de visión de un microscopio estereoscópico Nikon SMZ1500 con un sistema de cámara digital SPOT RT3 o similar, y comience la obtención de imágenes secuenciales.
1. Se debe utilizar la misma frecuencia de obtención de imágenes tanto para los peces de tipo salvaje como para los mutantes. Se recomiendan velocidades de fotogramas de >30 Hz, ya que las velocidades más lentas generalmente no serán suficientes para capturar la natación rápida de los peces de tipo salvaje.
Administra estímulos mecanosensoriales al embrión tocando la cola con un alfiler de insecto.
Detener la toma de imágenes cuando el embrión ha dejado de nadar o ha nadado fuera del campo de visión.
Convierta imágenes secuenciales en un archivo de vídeo, o analice fotogramas individuales de imágenes time-lapse fuera de línea, utilizando el software SPOT 5.1 Advanced. Paquetes de software similares incluyen Open Lab, NIS Elements, o ImageJ disponible gratuitamente (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
Cuantificar el comportamiento de natación realizando la respuesta de tacto evocado en múltiples embriones.
1. Esto se puede lograr promediando la distancia que los embriones pueden nadar dentro de un intervalo de tiempo fijo utilizando un software o una regla métrica para marcar los puntos de inicio y final de la sesión de natación.
2. Evite que los embriones se habitúen al estímulo táctil con el tiempo realizando el ensayo con un nuevo embrión para cada repetición experimental. Los comportamientos en modelos mutantes confiables y de tipo salvaje tienden a ser altamente reproducibles.