Artículo de método

Estirar en Brain células endoteliales microvasculares (CEND) como

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DOI:

10.3791/50928

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26 de octubre de 2013

 ,  , 
1Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie, Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg, 2Department of Medicinal Chemistry, Faculty of Life Sciences, University of Vienna

En este artículo

Resumen

In vitro se están desarrollando modelos de lesiones cerebrales traumáticas para reproducir una deformación del cerebro vivo. Lesiones inducidas por el estiramiento se ha empleado para astrocitos, neuronas, células gliales, la aorta, y células endoteliales cerebrales. Sin embargo, nuestro sistema utiliza una barrera hematoencefálica (BBB) ​​modelo que posee propiedades que constituyen un modelo legítimo de la acreditación para establecer un modelo in vitro de lesión cerebral traumática.

Resumen

Debido a la alta incidencia de mortalidad provocada por una lesión cerebral traumática (TBI), los métodos que permitan a comprender mejor los mecanismos subyacentes implicados en ella son útiles para el tratamiento. Hay tanto in vivo como in vitro en los métodos disponibles para este propósito. En modelos in vivo pueden imitar lesión en la cabeza real, ya que se produce durante la lesión cerebral traumática. Sin embargo, las técnicas in vivo no puede ser explotado para realizar estudios a nivel de fisiología celular. Por lo tanto, en los métodos in vitro son más ventajosa para este propósito, ya que proporcionan un acceso más fácil a las células y el medio ambiente extracelular para la manipulación.

Nuestro protocolo presenta un modelo in vitro de lesión cerebral traumática usando lesión por estiramiento en las células endoteliales microvasculares del cerebro. Se utiliza la presión aplicada a las células cultivadas en pozos flexibles de fondo. La presión aplicada se puede controlar fácilmente y puede producir lesiones que va de menos a más grave. El murinocélulas endoteliales microvasculares cerebrales (CEND) generados en nuestro laboratorio es un modelo bien adaptado para la barrera hematoencefálica (BBB), proporcionando así una ventaja a otros sistemas que emplean una técnica similar. Además, debido a la simplicidad del método, los montajes experimentales se duplican fácilmente. Por lo tanto, este modelo se puede utilizar en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares implicados en la LCT en la acreditación.

Introducción

La lesión cerebral traumática (TBI) es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Unos 10 millones de personas se ven afectadas anualmente por TBI por lo que es uno de los principales problema de salud y médico 1. Debido a esto, varios in vivo e in vitro en modelos de lesión cerebral traumática se han establecido y desarrollado para estudiar sus mecanismos 2,3,4. Una mejor comprensión de la lesión cerebral traumática puede ayudar a mejorar el tratamiento del paciente y disminuir la mortalidad asociada, morbilidad, y el costo.

Existen muchos modelos de lesión cerebral que utilizan tanto in vivo e in vitro. En modelos in vivo podría imitar el caso real de lesión en la cabeza. Sin embargo, debido a la complejidad de la situación in vivo, la accesibilidad para el tejido de interés se vuelve limitado 2. En la comprensión de la respuesta fisiológica de las células individuales como resultado de la lesión infligida, es importante que las células se aíslan de los efectos sistémicos quepueden inhibir o alterar su respuesta individual 5. Por esta razón, los modelos celulares de trauma proporcionan ventajas valiosas sobre modelos animales ya que el entorno mecánico de las células puede ser controlada con precisión 6.

En sistemas in vitro que emplean el uso de la carga mecánica a las células o tejidos para determinar alteraciones inducidas por tal método de lesiones se han desarrollado. Por ejemplo, un método para estudiar el efecto de lesión mecánica a las células se ha establecido para astrocitos, neuronas, células gliales y células endoteliales aórticas 7,8,9. El traumatismo en el modelo in vitro establecido para el estudio de roedor y reactividad astrocito humano 10 empleado un dispositivo de control de presión idéntico a lo que utilizamos para nuestro modelo. El mismo método se aplicó para inducir la lesión a través de estiramiento en las células endoteliales de microvasos de cerebro de ratón (bEnd3) 11 y las neuronas corticales 12,13, así como, endoth cerebralcélulas Elial de los lechones recién nacidos 14. El dispositivo se deforma la parte inferior del pocillo de cultivo produciendo por ello un perjuicio estiramiento mecánico 10. Se inflige daño sobre las células cultivadas mediante la aplicación de presión de aire por encima de las células. Esta presión puede desviar la membrana sobre la cual las células están creciendo, estirando así las células. Varios grados de estiramiento (es decir, "bajo," moderado "o" grave ") se puede lograr mediante el establecimiento de la duración del pulso de presión de aire y la intensidad en consecuencia. Este método de lesiones inducidas por el estiramiento se ha correlacionado con lesión traumática in vivo 7. Además , este método de la lesión permite el control preciso del medio ambiente extracelular y se puede reproducir fácilmente.

Aunque un enfoque similar se ha utilizado para muchos otros tipos de células del cerebro incluyendo bEnd3, nuestro modelo es de la ventaja de que se hace uso de las células endoteliales microvasculares del cerebro murino (CEND) generadoen nuestro laboratorio. Esta línea celular es un modelo muy adecuado de la barrera hematoencefálica (BHE). En cultivos celulares in vitro utilizados como modelos de BBB deben poseer características que les permitan servir como pantalla de permeabilidad. Un criterio importante para un modelo de células in vitro a ser un predictor de la permeabilidad de la BHE es que debe poseer la arquitectura celular fisiológicamente realista 15. A pesar de que presentan las células bEnd3 distintivo husillo morfología similar escamosas en la cultura 16, que presentan un comportamiento irregular morfogenética in vitro mediante el cual se forman cavidades quísticas en lugar de las estructuras tubulares regulares en geles de fibrina 17. Por otra parte, cuando las células fueron inyectadas en embriones de ratones y del recién nacido, se indujeron tumores de rápido crecimiento letales de embriones de ratones, pero no en ratones recién nacidos y joven. Por tanto, se sugirió que uno o más procesos que regulan normal de crecimiento endotelial, la migración, y diferenciación han sido alterados o eliminandoed en esta línea celular 18. Por otro lado, morfológica, la evaluación inmunocitoquímica de las mediciones de flujo endoteliales y la expresión de marcadores acreditación, bioeléctrica, y paracelular demuestran que nuestro modelo de acreditación CEND es de hecho un modelo adecuado de la acreditación 19.

Endotelio cerebral in vivo se caracteriza por una permeabilidad muy apretado con resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) que van desde 2.000-5.000 Ωcm 2. Para los estudios de las propiedades de barrera microvasculatura del cerebro a los productos farmacéuticos, deberían considerarse restrictivo paracelular y el apriete de las células. En la mayoría de las células endoteliales capilares cerebrales (BCEC), esto no se conserva como la exposición de las células TEER que van desde 50 hasta 100 Ωcm 2 20. El cerebro endotelial bEnd3 línea celular inmortalizada genera valores TEER de no más de 60 Ωcm 2 15. En contraste diferenciación de las células CEND con medio que contiene suero reducido pantallaValores TEER que van desde 300 hasta 500 Ωcm 2 19,21.

Hasta la fecha, en modelos in vitro de lesión por estiramiento en las células endoteliales cerebrales cultivadas son escasos. Por lo tanto, un modelo in vitro para el trauma a través de lesión por estiramiento usando células endoteliales cerebrales cultivadas que actúan como modelo de la acreditación puede llegar a ser útil. En este protocolo, se presenta un modelo in vitro que podría imitar el impacto real que las células cerebrales, células endoteliales microvasculares específica del cerebro de la acreditación, reciben durante TBI. La principal ventaja de este modelo es que la cantidad de daño aplicado a las células, así como el medio extracelular se puede controlar fácilmente, de manera precisa lo que facilita la reproducibilidad del montaje experimental.

Protocolo

1. Siembra de las células endoteliales en Well Plates

  1. Cultivar las células endoteliales microvasculares del cerebro murino (CEND) en un matraz de cultivo T75, cambiando el medio (DMEM que contenía 10% de FCS, 50 U / ml de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina) dos veces a la semana, hasta que se alcanzó confluencia. (Para la generación y la inmortalización de las células endoteliales microvasculares cerebrales, consulte Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.).
  2. Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Retire el PBS y trypsinize las células con 2 ml de solución de tripsina-EDTA caliente.
  3. Se incuban las células a 37 ° C durante 5 min o hasta que se dispersa la capa de células.
  4. Añadir 8 ml de medio de cultivo en las células. Toque en el frasco varias veces para separar las células.
  5. Ver las células bajo el microscopio para asegurar total desapego del matraz.
  6. Medio de pipetas con células desprendidas de arriba abajo. Agitar el matraz para mezclar el Suspensiòn celularen.
  7. Tomar 20 l de la suspensión celular, poner en un hemocitómetro y contar el número de células.
  8. Determinar la densidad celular y de las semillas 20.000 células / cm 2 en el pozo.
  9. Transferir la suspensión celular en collagen1 6 pocillos recubiertas previamente flexibles de fondo placas de cultivo de 57,75 cm (2) en un volumen total de 3 ml / pocillo. Cada pozo tiene una superficie de 9,62 cm2.
  10. Cultivar las células a 37 ° C durante una semana hasta la confluencia. Cambiar el medio de cultivo dos veces por semana.

2. Diferenciación Celular Antes de la lesión por estiramiento inducido

  1. Cambiar el medio de cultivo de las células con medio de diferenciación (DMEM que contenía 1% de suero de ternera fetal de suero despojado (ssFCS), 50 U / ml de penicilina / estreptomicina).
  2. Se incuban las células a 37 ° C durante 24 hr.

3. Lesiones inducidas por el estiramiento de las células endoteliales

  1. Encienda el dispositivo controlador de lesión celular.
  2. Ajuste el retardo de 50 ms.
  3. Ajuste el regulador de presión de 15 psi y apriete el gatillo un par de veces hasta que la presión máxima registrada se estabilice.
  4. Ajuste el regulador de presión hasta el valor deseado. Utilice la Tabla 1 como una guía para la generación de varios grados de lesión por estiramiento.
  5. Coloque la placa de cultivo de fondo flexible de 6 pocillos (57,75 cm 2) en el soporte de la bandeja. Asegúrese de que el selector también se establece en el tamaño y correcta (es decir, grande también).
  6. Coloque el conector del adaptador firmemente sobre el pozo. Sujete el enchufe firmemente en su lugar con una mano mientras la otra mano empuja el gatillo.
  7. Anote la presión máxima generada.
  8. Ponga inmediatamente la placa de nuevo en la 37 ° C incubadora durante el período de tiempo deseado o utilizar de inmediato para tener éxito experimentos o evaluación.

4. Evaluación de la lesión por estiramiento por ensayo de absorción del tinte

  1. Inmediatamente después de que las células fueron strgrabado al agua fuerte (paso 3.7), añadir 30 l de una mg / ml de solución de la viabilidad mancha 1 que actúa como un marcador de la citotoxicidad (por favor, véase la tabla suplementaria de materiales y equipo) para el medio de cultivo celular (Nota: 10 l de la solución de colorante es para ser utilizado por cada ml de medio de cultivo celular).
  2. Después de la adición del colorante a las células, ver inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia.

5. Evaluación de la lesión por estiramiento por la lactato deshidrogenasa (LDH) de lanzamiento

  1. Inmediatamente después del estiramiento de las células (paso 3.7), eliminar 200 l de medio de cultivo celular del pozo. Haga lo mismo con cada punto de tiempo después de la lesión que le gustaría incluir en su investigación de la liberación de LDH (es decir, por ejemplo, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, etc.)
  2. Se centrifuga el medio de cultivo celular en el ajuste más alto de una microcentrífuga durante 5 min para eliminar los residuos de células. Eliminar el sobrenadante y con ello a los pasos siguientes.
  3. Una vez que have terminó paso 5.1 y se han tomado las muestras necesarias que le gustaría tener de los diferentes puntos de tiempo que le gustaría investigar, lisis de las células por medio de la solución de lisis incluido en el kit de ensayo de LDH (ver tabla complementaria de materiales y equipos).
  4. Ponga 100 l de medio de ensayo se incluye en el ensayo de Kitto cada pocillo de una placa de 96 pozos proporcionado en el kit.
  5. Ponga 100 l de medio de cultivo celular libre de células en dos pocillos paralelos de una placa de 96 pozos incluido en el kit de ensayo.
  6. Incubar la placa a 37 ° C durante 30 min.
  7. Leer la absorbancia a 492 nm.

Resultados

Las células cultivadas en colágeno I recubrieron previamente placas de cultivo de fondo de 6 pocillos flexibles (57,75 cm 2) se sometieron a diversos grados de lesión por estiramiento utilizando el dispositivo de camilla celular. Después de someter las células a la herida, que se examinaron bajo el microscopio en busca de los efectos de las lesiones inducidas por el estiramiento de la morfología celular. Se observó que se aplicó como un mayor grado de estiramiento de las células también se pudo observar un mayor grado de distorsión de la célula (Figura 1). Como se muestra en la Figura 1A, las células de control que no estaban sometidos a lesiones aparecen células endoteliales cerebrovasculares como de forma regular (CEND) sin ninguna indicación de hinchazón celular o la distorsión. Cuando se aplicó lesión por estiramiento (Figuras 1B-D), la deformación se puede observar bajo el microscopio de luz. Después de estirar las células gravemente con un pico de presión entre 3.5 a 4.5 psi, las células cend parecían notablemente retraídos, hinchados y deformados con no espacios intercelulares capaces. Además, la absorción de la viabilidad mancha (100 nM concentración final) también aumentó a medida que aumentaba el grado de lesión por estiramiento (Figura 2). La viabilidad mancha utilizado es un medio de contraste para impermeable a las células sanas que se convierte en permeable cuando se ve comprometida la integridad de la membrana plasmática de las células. El colorante fue excluido de la mayor parte de las células de control, por lo tanto, sólo algunas de las células se tiñeron (Figura 2A) en comparación con células estiradas (Figuras 2B-D). Más células fluoresció verde con un mayor grado de lesión por estiramiento.

Como un marcador bioquímico de lesiones, la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) enzima también se examinó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Figura 3 muestra que un aumento de lesión por estiramiento celular causado el aumento de la liberación de LDH.

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Figura 1. Examen de microscopía de luz de las células normales vs lesionada. (A) normal sin estirar monocapa celular confluente istightly lleno y alargada. Cuando las células se estiraron mediante la aplicación de un impulso de presión pico de 1,8-2,0 psi (es decir, bajo estiramiento) que aparecen menos compacta, espacios indicados por las flechas (B). Cuando las células fueron moderadamente heridos con un impulso de presión pico de 2,5-3,0, algunos de ellos parecían hinchadas y deformadas (C). Las células se vuelven retraídos con estiramiento severa de 3.5 a 4.5 psi, como se indica por la flecha (D). Un aumento de 100X. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 2. Flúorescencia examen microscópico de las células normales vs lesionado células tratadas con tinción de viabilidad 2 horas después de la lesión A: las células de control sin estirar BD: células estiradas (B - bajo, C - moderada, D - grave).... Un aumento de 100X. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 3. Lactato deshidrogenasa de liberación (LDH) enzima en el sobrenadante después de la lesión por estiramiento. LDH liberada en el medio de cultivo se midió a diversos intervalos de tiempo después de la lesión inducida por estiramiento. LDH se expresó como un porcentaje de la LDH total liberable (LDH en los medios de comunicación más células). Los valores son ± SEM. El n para cada punto de tiempo es 5, excepto para el 0 hr valor sometido a estiramiento severa donde n = 3. La liberación de LDH a partir de células que fueron sometidos a estiramiento bajo y moderado no difirió significativamente de la de los controles no estiradas y el uno del otro. Las células que fueron severamente extendían liberan una cantidad significativamente mayor de la LDH en comparación con todas las demás muestras, excepto para la muestra moderadamente estirado a 1 hr. (P <0,05, un factor ANOVA, método de Holm-Sidak). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Tabla 1. Guía para la generación de diversos grados de lesión por estiramiento.

Regulador de presión Presión máxima Grado de Lesión
15 psi 01.02 a 01.05 psi
20-25 psi 1,8-2,0 psi Bajo
30-35 psi 2,5-3,0 psi Moderada
40-50 psi 3.5 a 4.5 psi Grave
60 psi 4,8-6,0 psi > Grave

Discusión

Los efectos de una lesión mecánica in vitro se han estudiado y se han establecido métodos para astrocitos, neuronas, células gliales y células endoteliales aórticas 8, 9, 22. Hay, sin embargo, hasta la fecha todavía no es conocido ningún modelo in vitro de lesión por estiramiento en las células endoteliales cerebrales cultivadas. Los modelos celulares de trauma proporcionan ventajas valiosas sobre modelos animales ya que el entorno mecánico de las células puede ser controlada con precisión 6. Por lo tanto, un modelo in vitro de trauma por lesión tramo utilizando células cerebrales endoteliales cultivadas que actúan como modelo de la barrera hematoencefálica (BBB), como lo que nuestros regalos de protocolo puede llegar a ser útil.

Este protocolo hace uso de las células CEND, un modelo de acreditación establecido en nuestro laboratorio. Desde BBB ruptura suele documentarse en pacientes con TCE y TBI suele estar relacionada con la interrupción de la acreditación que puede dar lugar a la formación de edema 23, 24, el método presentando específicamente aquí pueden ser utilizados en la realización de estudios de BBB en relación a la lesión cerebral traumática.

En este modelo, es importante cuidar de la cantidad se aplica grado de lesión por estiramiento de las células. En la medida que las células se lesionan, en cualquier caso, y con cualquier cantidad de presión que se aplica, el grado de lesión que puede afectar las células endoteliales se diferencian mucho en gran medida de otros tipos de células. Células endoteliales aórticas son más resistentes a estirar lesiones que los astrocitos o células gliales mixtos 9. Además, se reparan más rápidamente después de la lesión en comparación con los otros tipos de células. Por lo tanto, para las células endoteliales cerebrales, particularmente células de CEND, mayor cantidad de lesión por estiramiento que se necesita para producir un alto grado de lesión. Se podría alcanzar el grado deseado de lesiones mediante la aplicación de la presión correspondiente se indica en la Tabla 1. Para las células CEND, sin embargo, se prefiere lesiones graves debido a su resistencia a la tensión. Los LDH ensayos realizados mostraronque a medida que aumenta el grado de estiramiento, más LDH se secreta en el sobrenadante. En contraste, las células que fueron dados una baja cantidad de lesión por estiramiento producen LDH en una cantidad similar a las células de control. Como se ha mencionado en el protocolo, se debe tener cuidado de que la cantidad apropiada de medio se utiliza ya que un aumento o disminución en la cantidad de medio pueden dar lugar a diferencias en la presión pico aplicado a los pozos. Por ejemplo, un pocillo que contiene 5 ml de fluido registra un pico de presión en la media de 4,0 psi, mientras que un pocillo vacío registra un promedio de 3,8 psi cuando se aplica presión de 45 psi. Por lo tanto, lo mejor es empujar el gatillo varias veces durante un pocillo de control para asegurar que el pico de presión que se genera corresponde a la cantidad deseada.

En nuestros experimentos se utilizó una tinción de viabilidad para determinar el efecto de estiramiento a la permeabilidad de la membrana celular. La óptica de las placas de cultivo flexibles de fondo que utilizamos nos permite VIew las células teñidas directamente bajo el microscopio. Sin embargo, cuando se quiere llevar a cabo estudios de inmunomarcaje directamente después del estiramiento de la lesión, pueden surgir dificultades. En primer lugar, el tamaño y el grosor de la placa pueden plantear un problema con algunas plataformas de observación del microscopio. En segundo lugar, la óptica de la membrana flexible del pozo pueden ser un obstáculo para borrar la visualización.

A pesar de las limitaciones mencionadas anteriormente, sin embargo, el procedimiento descrito se puede utilizar como un modelo de lesión mecánica en in vitro de la BBB. La lesión cerebral traumática (TBI) tiene dos componentes, a saber, la isquemia y trauma. La isquemia puede producirse como una lesión secundaria después de un TCE en casos en los que hay una pérdida grave de la sangre resultante de la presión sanguínea baja o como resultado de la inflamación del cerebro restringir el suministro de oxígeno al cerebro. Se considera como un retraso, el daño no mecánica que representa procesos patológicos consecutivos iniciados en el momento de la lesión 25. La ocurrencia de una hipoxiaespués severa lesión cerebral traumática es común 26. Privación de glucosa de oxígeno (OGD) es el método que se utiliza actualmente para modelo de isquemia in vitro. Por lo tanto, sometiendo las células a OGD como un insulto secundario a las células después del estiramiento puede imitar la incidencia de la lesión cerebral traumática seguido por la isquemia. Por lo tanto, para mejorar nuestra actual modelo in vitro de lesión cerebral traumática y el patrón que lo más cerca posible a una lesión cerebral traumática real, ya que se produce in vivo, en el futuro vamos a OGD también emplear en combinación con lesión por estiramiento.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana para la Investigación) con el número de subvención FO 315/4- y el Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) bajo contrato de subvención No. SALUD-F2-2009 hasta 241.778 a CF.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Controlador de lesiones celulares IIDiseño y fabricación personalizados, Virginia, EE. UU. 
Placa de cultivo Bioflex - Colágeno tipo IFlexcell, Dunn LabortechnikBF - 3001C 
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)Sigma-AldrichD5796 
Suero de ternera fetal (FCS)Laboratorios PAAA15110-1333concentración final 10%, inactivado por calor (30 min a 56 ° C)
L-glutaminaBiochrom AGK0282Almacenamiento: ≤ -15 ° C
MEM VitaminBiochrom AGK0373Almacenamiento: ≤ -15 ° C
Na-piruvatoBiochrom AGL0473 
Aminoácidos no esenciales (NEA)Biochrom AGK0293Almacenamiento a 4 & grados; C
Penicilina/EstreptomicinaBiochrom AGA2212Almacenamiento: ≤ -15 ° C
Suero fetal de ternero, tirado al carbón (ssFCS)Life Technologies12676-011 
Solución de tripsina-EDTALaboratorios PAAL11-004Almacenamiento: ≤ -15 ° C
Image-iT DEAD GreenLife TechnologiesI10291Almacenamiento: ≤ -15 ° C, protegido de la luz Kit de detección de
citotoxicidad PLUS (LDH) Roche4744926001 Almacenamiento: ≤ -15 ° C

Referencias

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