Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

Resumen

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Resumen

La barrera sangre-cerebro (BBB) ​​comprende impermeables pero adaptables capilares del cerebro que controlan estrechamente el medio ambiente cerebro. El fallo de la BBB ha sido implicado en la etiología de muchas patologías cerebrales, creando una necesidad para el desarrollo de humano en modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación clínica relevante. Entre los numerosos modelos de BBB descritas hasta ahora, una estática (sin flujo), en contacto con la acreditación modelo, donde los astrocitos y las células endoteliales del cerebro (BEC) se co-cultivaron en los lados opuestos de una membrana porosa, surgió como un sistema todavía auténtica simplificado para simular el acreditación con capacidad de cribado de alto rendimiento. Sin embargo, la generación de dicho modelo presenta unos desafíos técnicos. Aquí se describe un protocolo para la preparación de un modelo de acreditación contacto humano que utiliza una combinación nueva de BEC humanos primarios y astrocitos humanos inmortalizados. Concretamente, se detalla un método innovador para la célula-siembra en inserciones invertidas, así como especificar la insercióntécnicas y tinción camisetas ejemplifican cómo usamos nuestro modelo para la investigación relacionada con la acreditación.

Introducción

La acreditación es una interfaz especializada entre la circulación de la sangre periférica y el sistema nervioso central, de manera crucial responsable del mantenimiento de la hemostasia cerebro. Se compone de células cerebrales distintas endoteliales microvasculares (BEC) que son funcionalmente influenciada por pocos componentes celulares y acelulares (a continuación) para formar una puerta de entrada ajustado y dinámico en el cerebro. En condiciones fisiológicas la acreditación restringe el paso de las células sanguíneas, componentes del plasma y sustancias nocivas, todos potencialmente neurotóxico, en el cerebro. En paralelo, la acreditación intercambia selectivamente iones y nutrientes (glucosa y amino-ácidos) clave y los productos de desecho metabólicos entre el cerebro y la circulación para mantener con precisión el entorno de ^1,2 cerebro. En los últimos años cada vez es más evidente que el fallo de la BBB se produce en una variedad de patologías cerebrales crónicas, tales como enfermedades neurodegenerativas o relacionados con la inflamación (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y multiple esclerosis, respectivamente) ^3, así como en condiciones agudas como accidente cerebrovascular isquémico ^4.

Las propiedades únicas de BBB de las células endoteliales del cerebro (BEC) se inducen en gran medida por su entorno cerebral ^5, y en particular por los astrocitos ^6,7. Hay una creciente comprensión de que otros tipos de células, tales como pericitos ^8, neuronas y microglia ^1,3, así como la membrana basal ^9, apoyan BEC y juntos forman una unidad funcional denominada "unidad neurovascular" (NVU), que al mismo tiempo parejas neuronal demandas metabólicas a sus capilares que suministran ^10.

La participación de la acreditación en situaciones patológicas subyace numerosos intentos de desarrollar modelos in vitro de BBB para ayudar en la investigación relacionada con la acreditación ^11,12. Estos modelos tienen como objetivo imitar lo más cerca posible in vivo características de BBB de acuerdo con el principio NVU. In vitro modelos de BBB se basan generalmente en una monocapa de las BEC apretado nudo de formación (principalmente de bovino ^{13, 14} humana, de rata ^15, ratón ^16, y porcinos ^17,18 orígenes), cultivadas en una membrana porosa junto con astrocitos de apoyo (ampliamente revisado por Deli et al. 2005 ^11).

Los astrocitos pueden ser cultivadas en condiciones sin contacto en la parte inferior de un pocillo de cultivo tisular, separado de las BEC (cultivadas en la superficie superior de la membrana) por el medio de cultivo todavía la comunicación con las BEC a través de factores solubles ^16. En modelos más avanzados que mejor se asemejan a la estructura anatómica de la BBB in vivo, los astrocitos se mantienen en condiciones de contacto y se cultivaron directamente en el lado opuesto de la membrana en las proximidades de las BEC ^13,15,17 (Figura 1). Esta configuración permite el contacto físico entre BEC y astrocitos, establecido cuando el proyecto astrocitossus procesos a través de la membrana porosa. Es importante destacar que, para un verdadero contacto a producirse los poros debe ser ≥ 1μm de diámetro, desde astrocíticos-pies finales no pueden pasar a través de tamaños de poro más pequeños (es decir, 0,4 micras) ^14,15. En particular, los sistemas de contacto de BBB se demuestran en algunos estudios para ser superior a sus homólogos sin contacto con respecto a su resistencia eléctrica trans-endotelial (TEER) y los valores de permeabilidad del endotelio de diversos trazadores ^13,17,18. Una dimensión adicional de flujo de medios de comunicación se añadió recientemente en un número de modelos in vitro de BBB para aplicar fuerzas de cizallamiento al endotelio para más cerca de la simulación de la vasculatura del cerebro ^12,19.

Un obstáculo técnico a superar cuando se genera un modelo de contacto acreditación es la siembra de los astrocitos en contra de la gravedad sobre la superficie abluminal de la membrana porosa. Protocolos anteriores ^13,20, donde los astrocitos se sembraron en simplemente una gota de medios de comunicación en la parte superior de una eninserto verted, permitió veces sólo a corto siembra (es decir, 10 min ¹³ o 2 horas ²⁰⁾ que se encuentra en nuestras manos para ser insuficiente para la fijación celular adecuada. El uso de este método básico, un período más largo de fijación de astrocitos requiere un constante monitoreo de los insertos mediante la apertura frecuente de la incubadora (causar fluctuaciones en la temperatura, el pH y la humedad) y también es propensa a la siembra de células irregular debido a las fugas de los medios de comunicación a través de los poros, especialmente Si se emplean poros de más de 1 m.

Aquí se describe un protocolo general para la preparación de un modelo de contacto BBB. Nuestro procedimiento incluye un método alternativo para la célula-siembra en inserciones invertidas, que aborda las limitaciones mencionadas anteriormente. El método permite la adherencia sin perturbaciones de los astrocitos en la superficie de la membrana abluminal, en un incubador equilibrado, durante un período prolongado de tiempo. Como resultado, se consigue una siembra uniforme de los astrocitos que aumenta la calidad de barreray minimiza las variaciones de permeabilidad basales entre insertos.

A medida que el uso de células humanas es importante para la investigación humana correspondiente ^21, que, además demostramos en este artículo la utilización específica de una novedosa combinación de las BEC humanos primarios e inmortalizado astrocitos humanos para el establecimiento de un modelo de acreditación de contacto humano con una alta capacidad de rastreo de . Desde la visualización de las células en membranas porosas puede ser, nosotros también las técnicas de tinción de detalles difíciles que pueden ayudar en la determinación de la confluencia y la morfología de las células de las membranas porosas. Finalmente, se ejemplifican cómo nuestro modelo de acreditación humano puede ser utilizado para examinar el efecto de tipo activador del plasminógeno tisular (t-PA) - una enzima para disolver coágulos que sirve como una opción de tratamiento único para el accidente cerebrovascular isquémico agudo - en la acreditación.

Protocolo

1. Cultivos Celulares (3-7 días antes de la acreditación de la Asamblea)

1.1. Primaria células cerebrales humanas endoteliales microvasculares (BEC)

BEC se obtuvieron comercialmente. Las células fueron producidas por disociación dispasa de tejido normal corteza cerebral humana y presenten en estado congelado en el paso 3 (<12 duplicaciones de la población).

1. Sustrato: vasos Escudo de cultivo de tejidos con "factor de unión" de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Mantenimiento celular: Mantener BEC en medio completo que contiene suero. Para la experimentación, la cultura BEC en un medio libre de suero completo. Mantener las células en un humidificado 5% de CO _2, 21% de O ₂ incubadora a 37 ° C
   Nota: Como alternativa a los reactivos especializados, 0,1% (w / v) de solución de gelatina puede servir como un reactivo de recubrimiento, mientras que DMEM/F-12 complementado con 15 mM de HEPES, 10% (v / v) de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de L-glutamina, 50 g/ Ml de gentamicina, 20 mg / ml de heparina y 20 mg de suplemento de crecimiento de células endoteliales / ml se pueden utilizar para el mantenimiento de BEC.
3. Sub-cultivo para la experimentación: BEC confluentes Split en una proporción de 01:03-01:06, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). Cambie el medio de mantenimiento cada 3 días. Utilice BEC hasta 15 pasajes.

1.2. SVG humano fetal astrogliales Cell-line

Células astrogliales SVG humanos fetales ²² se derivaron originalmente de cultivos primarios de cerebro fetal humano transformado con replicación deficiente virus de simio 40.

1. Mantenimiento: células de cultivo de SVG en medio esencial mínimo con solución salina equilibrada de Earle suplementado con 20% (v / v) de FCS (mismo porcentaje de suero utilizada para mantener sus células primarias de los padres ^22), 2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en un humidificado 5% de CO _2, 21% de _O2 incubadora a 37 ° C.
2. Sub-cultivo para la experimentación: IVS confluentes Split en una proporción de 1:5 a 1:10, dependiendo de la hora prevista para el próximo uso (3-7 días). La eliminación de la tripsina no es necesario debido al alto contenido de suero en el medio. Cambie el medio cada 3 días. Utilice SVGs hasta 20 pasajes.

2. Asamblea y cocultivo del humano in vitro BBB Modelo (día 0)

Comentario: El humana in vitro modelo de contacto acreditación se preparó de acuerdo con los protocolos publicados ^13,23, con modificaciones.

2.1. Recubrimiento de las inserciones

1. Coloque los insertos de cultivo de tejidos (6,5 mm de diámetro con poliéster membrana porosa, 3 micras de tamaño de poro) en los pocillos de la placa de 24 pocillos se suministra. Cubra la superficie luminal de los insertos durante la noche en un incubador humidificado 37 ° C con colágeno I de rata (20 g / cm ^2; 50 l de 132 g/ Ml de colágeno I en ácido acético 0,02% en agua Milli-Q (MQH ₂ O)). Lavar los insertos de una vez (tanto desde el lado abluminal y luminal) con MQH ₂ O para eliminar el ácido residual.
   Nota: La membrana basal de los capilares del cerebro no contiene colágeno I, pero principalmente lamininas, isoformas de colágeno tipo IV, nidogens y proteoglicanos heparán sulfato ^9. Por esta razón, algunos investigadores utilizan agentes de revestimiento tales como colágeno IV, fibronectina ^13, o Matrigel (BD Biosciences) ¹⁶ para una más auténtico modelado de la acreditación.

2.2. SVGs Siembra en la parte inferior (Abluminal) superficie de la membrana

1. Invierta la inserción y ajuste suavemente por el borde de la membrana porosa de un pequeño trozo de tubo de silicona elástica ("tubing externa"; ~ 10 mm de largo, 8 mm de diámetro interior y 1,6 mm de pared), básicamente la creación de un nuevo muy por encima de la superficie abluminal (Figura 2A).
2. La parte inferior de la Nee insertods a sellar para evitar la fuga de los medios de comunicación. En primer lugar, preparar un enchufe (Figura 2A y 2B) hecha de un tubo de silicona (denominado "tubo interno"; ~ 8 mm de largo, 3,2 mm de diámetro interno, 1,6 mm de pared; Figura 2B), sellado en un extremo con un cono de sellado de plástico (~ 3 mm de largo; preparado por el corte de la parte inferior de una reacción en cadena de 0,2 ml de la polimerasa (PCR) del tubo; Figura 2B). Este cono no sólo sella el lumen de los tubos internos, pero también amplía su borde más apretado para encajar en el inserto. A continuación, utilizando unas pinzas esterilizadas, inserte el tapón de silicona en la cavidad luminal y avanzar hasta que llegue hasta a ~ 1-2 mm de la membrana (Figura 2A).
3. A continuación, las semillas 4 x 10 ⁴ células SVG en 200 medio de mantenimiento SVG l (SEcción 1.2.2 anterior) directamente en la silicona muy por encima de la superficie de la membrana abluminal (Figura 2A). Permitir SVGs se adhieran durante al menos 4 horas en la incubadora.
   Nota: Para mantener la esterilidad transportar los insertos montados entre dos placas de 6 pocillos (una placa invertida sobre la otra; Figura 2C) para reducir al mínimo la exposición al aire sin filtrar durante el procedimiento. Tubos de silicona y tapones se lavan en etanol y en autoclave para su uso posterior.
   Nota: Utilice tapones (apartado 2.2.2) sólo para plaquitas con poro de la membrana de tamaño mayor que 1 m. Las membranas con poros de diámetro ≤ 1 m rara vez se escapan y sólo requieren la instalación de la tubería de silicona externo (sección 2.2.1). Además, algunos agentes de recubrimiento que no sean de colágeno I (véase la nota a la sección 2.1) pueden impedir leakiness incluso a través de 3 micras poros. Determinar esto empíricamente.
4. Con el fin de supervisar el estado de cumplimiento de los astrocitos, sembrar en paralelo enun estándar de 96 pocillos un volumen idéntico de la célula astrocito-suspensión. Este pozo tiene la misma superficie que el inserto de 6,5 mm (0,33 cm ²⁾ y permite la fácil visualización de las células por microscopía de contraste de fase de la membrana de inserción. Cuando se observa la adherencia suficiente de la astrocitos en el control de 96 pocillos, los astrocitos han adecuadamente adherido también a la membrana de inserción.
5. Cuando los astrocitos se han adherido suficientemente en el control de 96 pocillos, transferir los conjuntos de inserto a la campana de cultivo de tejido (ver nota anterior) y retire suavemente el tubo de silicona externa y tapones. Inserciones Volver a la orientación normal (es decir, en posición vertical) en los pocillos suministrados contienen 800 l / pocillo de medio de mantenimiento BEC (sección 1.1.2).

2.3. Siembra de BEC en la Cámara por encima de los astrocitos Luminal

Seed 2x10 ⁴ BEC en 200 l sobre la superficie luminal de colágeno recubierto y devolver la inseguridadRTS en la incubadora.

2.4. Cocultivo

Cocultivo los insertos SVG / BEC sembrados durante 3 días en medio BEC sin cambio de medio antes de la experimentación.

3. La experimentación con el modelo de acreditación Humano (Día 3)

1. Para estimular las células in vitro primera colada de BBB en los medios de comunicación mediante la sustitución abluminal y luminal con 600 l y 100 l de medio libre de suero BEC, respectivamente.
2. Aspirar el medio luminal de nuevo y reemplazar con 100 l de medio libre de suero con agentes estimulantes.
   Nota: Si es necesaria la estimulación de la cámara abluminal (para activar la acreditación vitro desde el compartimiento astrocítica), aspirar el medio abluminal y reemplazar con 600 ul de medio libre de suero con agentes estimulantes.
3. Pon a prueba cada grupo experimental en tres ejemplares (por lo tanto, si no se realiza la estimulación luminal, que requiere 3 x 100 l, se recomienda diluir la re agentes a sus concentraciones finales en 350 l de medio libre de suero por grupo para reducir al mínimo los errores de pipeteo entre pozos).
4. Realizar paracelular estándar y / o ensayos de permeabilidad transcelular de trazadores marcados ^16,24 (para el último usamos isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con albúmina) y / o la medición de la TEER ^13,16,25 como se describe anteriormente.

Para tener en cuenta las fluctuaciones en la permeabilidad de la línea de base entre los experimentos, analizar los cambios en la permeabilidad relativa a un inserto revestido sin células (que sirve como una referencia para la permeabilidad máxima) y al grupo tratado con vehículo usando la fórmula: Permeabilidad (% de max) = ( valor de permeabilidad de inserción experimental - valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) / (valor de permeabilidad de la inserción en blanco - el valor promedio de la permeabilidad del grupo del vehículo) X 100.

4. La visualización de las células en membranas porosas

nt "> Comentario: las células no teñidas en las membranas de inserción son difíciles de observar por contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía ya que la membrana es bastante opaca e interfiere con la transmisión de la luz Para hacer frente a este problema, hemos desarrollado diversos procedimientos de tinción de células en. inserciones, que mejoran en gran medida la apariencia de células en la membrana. Generalmente, las manchas de las membranas de inserción mientras que todavía unido a la pieza de inserción, en los pozos. Las membranas deben ser retirados sólo al final del procedimiento de tinción para los propósitos de montaje.

4.1. Hematoxilina tinción

1. Fijar insertos con helado 4% (w / v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 130 mM, 10 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM NaH ₂ PO _4, pH 7,2) durante 20 min. Lavar una vez con PBS.
2. Sumerja el inserto en solución de hematoxilina de Mayer 0,1% durante 2 min.
3. Lave suavemente la boquilla con agua del grifo (sumergiendo las insert en un vaso que contiene el agua del grifo y pipetear suavemente el exceso de agua). Transferir el inserto a la solución de Scott agua del grifo (2 g / l de _NaHCO3, 20 g / L _MgSO4) durante ~ 20 s hasta que el color azul deseado desarrolla. Lave el inserto de nuevo con agua del grifo (punto 4.1.3). Una tinción de eosina opcional se puede introducir aquí por inmersión de la pieza de inserción en la solución de eosina 1% durante 10 s seguido por un lavado con agua del grifo.
4. Aire secar la membrana de inserción. Usando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) quitar la membrana y montarlo en un portaobjetos de vidrio para la imagen de campo claro
   Nota: Si se utiliza di-N-butylphthalateinxylene (DPX) medio de montaje lavar el inserto con etanol al 100%, seguido de xileno antes de retirar y montar la membrana.

4.2. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM)

1. Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min. Lavar tres veces en PBS.
2. Post-fijar las membranas durante 30 min en 1% (w / v) Tetróxido de osmio en MQH ₂ O.
3. Lavar insertos en agua (sección 4.1.3) y se deshidratan en un gradiente creciente de etanol (50%, 70%, 90% durante 5 min cada uno, y luego 3 veces con etanol al 100% durante 10 minutos por intervalo).
4. Tratar insertos deshidratados con una mezcla de hexametildisilazano (HMDS): etanol (1:2 y luego 2:1 para 5 min).
5. Tratar insertos con 100% HMDS de 5 min, aire seco y almacenar en condiciones desecadas.
6. Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana). Examine las membranas por microscopía electrónica de barrido.

4.3. Inmunofluorescencia

1. Fijar insertos con enfriado con hielo 4% (w / v) de PFA en PBS durante 20 min, se lava una vez en solución salina tamponada con Tris (TBS; 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 154 mM, 0,22 m filtrada).
2. Realizar la inmunotinción de las células en la membrana de inserción como se ha descrito anteriormente ^26.
3. Retire la membrana utilizando un bisturí (corte alrededor del borde de la membrana) y montarlo en agdiapositiva lass con medio de montaje de fluorescencia. Examine membrana mediante microscopía de fluorescencia.

Resultados

Con el fin de establecer un modelo de contacto acreditación humana tuvimos que cultivar IVS y BEC en membranas porosas con un tamaño de poro de 3 micras, que se muestra para permitir el paso de astrocitos finales pies para el contacto con las células endoteliales ^14,15,27,28. Una representación esquemática del modelo de contacto completa se ilustra en la Figura 1 (la ilustración de la izquierda). El principal desafío técnico presentado por un sistema de contacto es la necesidad de sembrar ast...

Discusión

La investigación médica en patologías cerebrales sufre mucha dificultad de traslación. En el área de accidente cerebrovascular isquémico agudo, por ejemplo, muchos fármacos que mostraron una gran promesa en modelos animales fallaron en la clínica ^38,39. Las razones de estos resultados decepcionantes son diversos e incluyen la infidelidad de los sistemas de pruebas preclínicas con el escenario de derrame cerebral humana y la exageración de los resultados obtenidos a partir de estudios en animales ^21.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Factor de fijación	Cell-Systems Corporation	4Z0-210
Células endoteliales microvasculares cerebrales (BECs), primarias, humanas	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Medio completo	Cell-Systems Corporation	4Z0-500	Complementado con CSC JetFuel
Medio completo sin suero	Cell-Systems Corporation	SF-4Z0-500	Complementado con CSC RocketFue
DMEM/F-12 con 15 mM HEPES	Life Technologies	11330-032
Suplemento para el crecimiento de las células endoteliales (de origen bovino)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Tubo externo de silicona	Watson-Marlow	913.A080.016	Pumpsil marca, 8 mm de diámetro interno, 1,6 mm de pared
Suero fetal de ternera	Lonza	14-501F
Sulfato de gentamicina	Life Technologies	15750-060
Heparina sódica	Pfizer		1.000 U/ml
Hexametildisilazano (HMDS)	Sigma-Aldrich	H4875
Células endoteliales microvasculares del cerebro humano	Cell-Systems Corporation	ACBRI 376
Tubo interno de silicona	Watson-Marlow	913.A032.016	Marca Pumpsil, 3,2 mm de diámetro interno, pared de 1,6 mm
L-Glutamina	Life Technologies	25030
Mayer' s solución de hematoxilina	Amber Scientific	MH
Medio esencial mínimo con Earle' s solución salina equilibrada	HyClone Laboratories	SH30244.01
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies	15140
Colágeno de rata I	Trevigen	3440-100-01	Marca Cultrex
Insertos de cultivo de tejidos	Corning Life Sciences	3472	marca Transwell, 6,5 mm de diámetro, con membrana porosa de poliéster, 3 &; m tamaño de poro