Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

Summary

En este trabajo se describe la formación de estructuras a base de péptidos altamente ordenadas por el proceso espontáneo de auto-ensamblaje. El método utiliza péptidos disponibles comercialmente y equipo de laboratorio común. Esta técnica se puede aplicar a una gran variedad de péptidos y puede conducir al descubrimiento de nuevos conjuntos basados ​​en péptidos.

Abstract

En la naturaleza, las estructuras funcionales complejos se forman por el auto-ensamblaje de biomoléculas en condiciones suaves. La comprensión de las fuerzas que controlan auto-ensamblaje e imitando este proceso in vitro traerá consigo importantes avances en las áreas de ciencias de los materiales y la nanotecnología. Entre los bloques de construcción biológicos disponibles, los péptidos tienen varias ventajas ya que presentan una diversidad sustancial, su síntesis en gran escala es sencillo, y que pueden ser fácilmente modificados con entidades biológicas y químicas ^1,2. Varias clases de péptidos diseñados tales como péptidos cíclicos, péptidos de anfífilo y-péptido conjugados de auto-ensamblarse en estructuras ordenadas en solución. Dipéptidos homoaromáticos, son una clase de péptidos auto-ensambladas cortos que contienen toda la información molecular necesaria para formar estructuras ordenadas tales como nanotubos, esferas y fibrillas de ^3-8. Una gran variedad de estos péptidos está disponible comercialmente. 9 Los protocolos presentados aquí pueden adaptarse a otras clases de péptidos o bloques de construcción biológica y pueden potencialmente conducir al descubrimiento de nuevas estructuras a base de péptidos y para un mejor control de su montaje.

Introduction

Formas Naturaleza estructuras ordenadas y funcionales en el proceso de auto-ensamblaje biomolecular. La comprensión de las fuerzas que rigen este proceso espontáneo puede conducir a la capacidad de imitar auto-ensamblaje in vitro y en consecuencia a los grandes avances en el área de ciencias de los materiales ^10,11. Los péptidos, específicamente, una gran promesa como un bloque de construcción biomolecular, ya que presentan gran diversidad estructural, facilidad de síntesis química, y pueden ser fácilmente funcionalizados con entidades biológicas y químicas. El campo de los péptidos auto-ensamblaje fue iniciado por Ghadiri y sus colegas, quienes demostraron el auto-ensamblaje de nanotubos peptídicos mediante péptidos cíclicos con ácidos y ^D-12 L-aminoácidos alterna. Otros enfoques exitosos para el diseño de ensamblajes de péptidos incluyen péptidos lineales bolaamphiphile ^5, amphiphiles (AP) ^6, péptidos iónicos autocomplementarias no conjugados ^13, péptidos similares a tensioactivos ^{4,14, y dibloque copolypeptides 15.}

Un enfoque más reciente es el de la auto-ensamblaje de péptidos cortos aromáticos, denominado dipéptidos homoaromáticos. Estos péptidos comprenden sólo dos aminoácidos con la naturaleza aromático (por ejemplo, Phe-Phe, dicarbonato de terc-butilo (Boc)-Phe-Phe) ^7,8,16-21. Las estructuras formadas por estos péptidos homoaromáticos incluyen estructuras tubulares, esferas, conjuntos laminares y fibras ^{6,8,15,21-32.} Las fibras en algunos casos generar una malla de fibrillas que se obtiene un hidrogel ^33-37. Estos conjuntos han sido explotados para aplicaciones de biosensores, la administración de fármacos, la electrónica molecular, etc. ^38-45

Este documento describe los pasos experimentales necesarios para poner en marcha el auto-ensamblaje espontáneo de péptidos homoaromáticos. Además, se presenta el proceso de péptido coassembly. Este proceso implica el auto-ensamblaje de más de un tipo de péptidomonómero.

Nuestra demostración incluye la coassembly de dos péptidos disponibles comercialmente: el péptido difenilalanina (NH _{2-Phe-Phe-COOH)} y su análogo protegido con Boc (Boc-Phe-Phe-OH). Cada uno de los péptidos auto-ensambla en una estructura supramolecular: los formularios de péptidos difenilalanina conjuntos tubulares y el péptido auto-ensambla Boc-Phe-Phe-OH en cualquiera de esferas o fibras dependiendo del disolvente ^7,17,46. Mezclamos los dos péptidos en ciertas proporciones y caracterizaron los conjuntos resultantes mediante microscopía electrónica, microscopía de fuerza y ​​la espectroscopia FT-IR. Los métodos demostraron la formación de una estructura basada en péptidos que se compone de elementos esféricos con un diámetro de varias micras (1-4 micras) que están conectados por conjuntos alargados con un diámetro de unos pocos cientos de nanómetros (~ 300-800 nm) . Los conjuntos de cadenas de cuentas parecen en su morfología, como las estructuras esféricas parecen ser roscado en laconjuntos alargados. Por ello denominamos estas asambleas "collares biomoleculares". Los "collares biomoleculares" pueden servir como un nuevo biomaterial, como un agente de administración de fármacos o como un andamio para aplicaciones electrónicas. Por otra parte, el procedimiento que conduce a la auto-ensamblaje de péptidos se puede utilizar con otras clases de péptidos y biomoléculas. Todo ello puede conducir a una mejor comprensión de las fuerzas que intervienen en el autoensamblaje y la formación de nuevas estructuras ordenadas.

Protocol

1. El autoensamblaje de homoaromáticos Dipéptidos

1. Pesar el péptido deseado en su forma liofilizada (por ejemplo, _{NH2-Phe-Phe-OH,} Boc-Phe-Phe-COOH) y preparar una solución madre disolviendo el péptido en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro -2-propanol (HFP) a la concentración apropiada (por ejemplo, 100 mg / ml de NH _2-Phe-Phe-OH y Boc-Phe-Phe-COOH) ^7,17,46.
2. Mezclar la solución con vórtice y el lugar en el banco hasta que el péptido se disuelva completamente y la solución parece clara (unos pocos minutos).
3. Diluir la solución de péptido de stock, con un disolvente adecuado, a la concentración apropiada (por ejemplo, 2 mg / ml de NH _2-Phe-Phe-OH en agua destilada Triple (PST) para la formación de nanotubos; mediante la adición de 2 l de péptido solución madre a 98 l TDW, 5 mg / ml de Boc-Phe-Phe-COOH en etanol para la formación de estructuras esféricas).
4. Mantenga la solución a temperatura ambiente durante 24hora
5. Con el fin de evitar cualquier preaggregation, preparar soluciones madre frescos para cada experimento.

2. Coassembly de Dos homoaromáticos Dipéptidos

1. Preparar una solución de etanol al 50% mediante la mezcla de volúmenes iguales de TDW y etanol absoluto. Utilice vórtice para mezclar las dos soluciones.
2. Pesar 2 mg del péptido NH _2-Phe-Phe-OH y 1 mg del péptido Boc-Phe-Phe-OH. Disolver cada péptido en HFP a una concentración de 100 mg / ml.
3. Mezclar los péptidos soluciones madre utilizando vórtice y colocarlos en el banco hasta que los péptidos se disolvieron por completo y las soluciones parecen claras.
4. Mezcla los péptidos soluciones madre a la relación deseada. En este experimento específico mezclar 10 l de péptido NH _2-Phe-Phe-OH con 6 l de péptido Boc-Phe-Phe-OH (hasta una relación final de 05:03, respectivamente). Debido a la alta volatilidad del disolvente HFP, se recomienda preparar una gran cantidad de esta solución madre (por lo leao 10 l).
5. Utilice vortex para mezclar la solución de péptidos mezclados.
6. Diluir la solución madre de péptidos mezclados con etanol al 50% a la concentración final deseada. En este experimento específico, con el fin de obtener una concentración final de 5 mg / ml de NH _2-Phe-Phe-OH y 3 mg / ml para Boc-Phe-Phe-OH, respectivamente, añadir 8 l de la solución madre de péptidos mezclados a 92 l de la solución de etanol al 50%. Utilice una pipeta para mezclar suavemente la solución.
7. Mantenga la solución a temperatura ambiente durante 24 horas.
8. Cabe señalar que debido a la naturaleza altamente volátil del disolvente, los experimentos son sensibles a pequeños cambios en la concentración de los péptidos. Por lo tanto, nuevas soluciones madre deben prepararse para cada experimento.

3. Caracterización de los auto-ensambladas Estructuras Usando microscopía electrónica de barrido (SEM)

1. Después de 24 horas de incubación, se aplica una gota de 10 l de la solución de los péptidos en una cala de vidrior resbalón y seco a temperatura ambiente.
2. Escudo de la muestra en el vaso con una fina capa de oro (de unos pocos nanómetros) usando un revestidor por bombardeo iónico durante 90 segundos.
3. Imagen de los ensamblados mediante SEM funciona a 10-20 kV.

4. Caracterización de los auto-ensambladas Estructuras Utilizando Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

1. Coloque una gota de 10 l de la solución de los péptidos sobre una rejilla de cobre de malla 200 cubierto de carbono y estabilizado por un soporte de película de polímero.
2. Después de 1 min retirar el exceso de líquido con papel de filtro.
3. Preparar una solución de 2% de acetato de uranilo en TDW. Se filtra la solución con unidad de filtro de 0,22 micras.
4. Para la tinción de la muestra (tinción negativa), coloque una gota de 10 l de solución de acetato de uranilo en la parrilla.
5. Después de 30 segundos quitar el exceso de líquido con papel de filtro. Cabe señalar que aunque la tinción negativa mejora el contraste de las imágenes, no es esencial en todos los casos.
6. Imagen de la muestra en el the rejilla por TEM que opera a 120 kV.

5. Caracterización tridimensional de las Asambleas por Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)

1. Preparar una muestra para el análisis AFM usando el procedimiento descrito en el apartado 3.1.
2. Analizar la muestra sobre el vidrio utilizando un instrumento AFM se trabaja en modo de CA. Utilice palancas de silicio con una constante de resorte de 3 N / m y una frecuencia de resonancia de 75 kHz.
3. Iniciar mediante el escaneo de un área grande de la red, con el fin de encontrar la estructura deseada. Luego concéntrese en un área más pequeña específico y escanearlo (el tamaño de escaneo fue de 2,5 m x 2,5 m para la imagen incluida en este manuscrito).

6. Caracterización de la estructura secundaria por FT-IR

1. Aplique una gota de 30 l de la solución de los péptidos a una ventana de CaF _2.
2. Deje que la solución se seque a temperatura ambiente.
3. La adsorción de agua en el espectro IR es a 1650 cm ^-1.Este pico está en el centro de la banda de amida I del enlace peptídico. También es un pico típico para estructuras α-helicoidal de péptidos y proteínas ^47. Con el fin de superar este problema y evitar la señal de agua, se debe realizar un intercambio de hidrógeno a deuterio. Coloque una gota de óxido de deuterio _(D2O) en la muestra de péptido se secó. La caída debe ser lo suficientemente grande como para cubrir completamente el depósito de péptido en la ventana.
4. Permita que la muestra se seque al vacío.
5. Repita los pasos 6.3 y 6.4 2x para asegurar el intercambio máxima-hidrógeno-deuterio. Guarde la muestra bajo vacío hasta su análisis.
6. Registre los espectros FT-IR usando una triglicina sulfato deuterado detector (DTGS). El sistema FT-IR incluye un generador de gas de purga, con el fin de evitar que la humedad en los alrededores de la muestra. Para las muestras de péptidos cortos, lo mejor es escanear la muestra 2000 x con una resolución de 4 cm ^-1. Los valores mínimos de transmitancia se pueden determinar por el modoftware suministrado con el instrumento.

Results

En este trabajo se describe un método para la formación de estructuras ordenadas en la nano-y micrométrico escala por el auto-ensamblaje de péptidos. Con el fin de demostrar este sencillo proceso presentamos y caracterizar la coassembly de dos péptidos aromáticos simples (Figura 1). Uno de los péptidos es el _2-Phe-Phe-OH (difenilalanina) péptido NH, que puede auto-ensamblan en una solución acuosa en estructuras tubulares huecos con dimensiones nanométricas ^7. El otro péptido es su ...

Discussion

En resumen, este trabajo demuestra la facilidad con la que conjuntos basados ​​en péptidos se pueden formar in vitro. El proceso consiste en péptidos y disolventes disponibles comercialmente, y se produce espontáneamente en condiciones ambientales, después de la adición de un disolvente polar para el tubo de ensayo. Es crucial usar HFP como disolvente de los péptidos, debido a la baja solubilidad de los péptidos en otros disolventes orgánicos. Además, debido a la alta volatilidad de HFP es necesario para prepar...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NH2-Phe-Phe-OH	Bachem	G-2925.0001
Boc-Phe-Phe-OH	Bachem	A-3205.0005
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	52512-100ML
Etanol absoluto (deshidratado) AR estéril	Bio-Lab Ltd.	52555	Mezcla con TDW para la preparación de una solución al 50%
Acetato de uranilo	Sigma-Aldrich	73943	Para tinción negativa. Es posible trabajar sin él.
cubreobjetos de vidrio	Marienfeld Laboratory Glassware	110590
Rejillas TEM	Microscopía Electrónica Ciencias	FCF200-Cu-50	Formvar/Carbon 200 Mesh, Cu
Papel de filtro cuantitativo	Whatman	1001055
Óxido de deuterio (D2O)	Sigma-Aldrich	151882-100G	99,9 átomo % D
CaF2 ventana	PIKE Technologies	160-1212 ventana de	25 mm x 2 mm. Para mediciones FT-IR
Puntas AFM NanoScience	Instruments Sondas	CFMR	Aspire, serie CFMR-25
Unidades de filtro	Millipore	SLGV033RS	Millex-GV, 0.22 μ m, PVDF, 33 mm, esterilizado con rayos gamma
SEM	FEI		Quanta 200 ESEM
TEM	FEI		Tecnai T12 G2 Spirit
AFM	JPK Instruments		A JPK NanoWizard3
FT-IR	Thermo Fisher Scientific		Nicolet 6700 espectrómetro de oro avanzado
FT-IR Purga	Parker		BALSTON FT-IR Generador de gas de purga modelo 75-52
Software OMNIC (Nicolet)	Thermo Nicolet Corporation		Para el análisis de espectros FT-IR
Mezclador de vórtice	Wisd Equipos de laboratorio Wisd ViseMix		VM
Weight	Mettler Toledo		NewClassic MS
Recubridor por pulverización catódica	Polaron		SC7640