Flujo de trabajo sin manchas V3 para un control de carga total de proteínas práctico, conveniente y confiable en Western Blotting

Western blot es una técnica muy útil^9,sin embargo, hay dos desafíos principales con western blotting: proceso largo y laborioso y calidad de los datos. Un protocolo tradicional requiere aproximadamente 2 días. Implica muchos pasos que incluyen la preparación de la muestra, el bastidor del gel, la electroforesis y la transferencia de la proteína, el bloqueo de la membrana seguido por la incubación del anticuerpo, la proyección de imagen, y muy a menudo pelando, reprobando, y finalmente el análisis de datos. A lo largo de este proceso, no existen herramientas fiables y flexibles para el control de procesos. Como tal, los errores se pueden introducir en cada paso, y estos errores tienen el potencial de generar artefactos de datos; por lo tanto, los controles de carga son esenciales en western blotting para identificar y corregir los errores. El control de carga se realiza generalmente comprobando el nivel de proteína de una proteína de referencia en cada muestra para ver si se presenta por igual. Las personas a menudo usan proteínas domésticas, como β-actina, β-tubulina, GAPDH, como control de carga.

La calidad de los datos de western blot depende de un control de carga fiable. Pero hay dos preocupaciones legítimas cuando se utilizan proteínas de limpieza para los controles de carga: 1) la inmunodetección basada en anticuerpos de las bandas de proteínas de limpieza a menudo están saturadas y, por lo tanto, no se pueden distinguir las diferencias de carga entre las muestras^30; 2) el nivel de expresión de la proteína de limpieza puede variar en las muestras bajo ciertas condiciones experimentales, por ejemplo, tratamiento con siRNA, muerte celular, diferenciación celular, etc.^{11,28,3,6,10,21.} Debido a estas preocupaciones, las revistas científicas ahora están requiriendo que "para las comparaciones cuantitativas, se utilicen reactivos apropiados, controles y métodos de imagen con rangos de señales lineales" (guía de Nature). Del mismo modo, los editores del Journal of Clinical Investigation están pidiendo controles de carga más fiables²⁴. Por estas razones, una proteína de limpieza necesita ser validada para ser utilizada como control de carga. En primer lugar, hay que asegurarse de que se mide en el rango dinámico lineal del método de inmunodetección^14,29. En segundo lugar, uno tiene que asegurarse de que se expresa de manera consistente en todas las muestras^{26,31,25,19,20.}

Una solución alternativa a un control de carga confiable es utilizar la medición de proteína total de la mancha blanca /negra. Algunos investigadores han teñido las manchas con manchas de proteína total, como Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S, y tecnología libre de manchas, para medir la señal total de proteína en cada carril como control de carga^{16,20,13,27,1,4,12.} El control de carga total de proteínas evita los escollos asociados con las proteínas de limpieza. En primer lugar, es un fiel reflejo de la cantidad de proteína cargada para cada muestra. En segundo lugar, la tinción proteica total exhibe un excelente rango dinámico lineal en el rango de carga común para el análisis de western blot (proteína de 10-50 μg de un lisato celular complejo) y diferencia con precisión la diferencia de carga entre las muestras^12.

La tecnología libre de manchas es un nuevo método de tinción de proteínas totales donde un compuesto único se mezcla en una solución de gel de acrilamida y se distribuye uniformemente en el gel fundido. Después de que se completa la electroforesis, el gel se expone a la luz UV durante un mínimo de 1 minuto para que el compuesto de tinción reaccione con los residuos de triptófano en la proteína. Las proteínas se vuelven excitables bajo luz UV para dar una fuerte señal fluorescente que se puede visualizar y cuantificar en un generador de imágenes habilitado sin manchas, como el sistema ChemiDoc MP. El compuesto libre de manchas en sí, sin embargo, no absorbe la luz UV, lo que resulta en un fondo bajo de la imagen del gel. La modificación de los residuos de triptófano es irreversible y las proteínas se pueden visualizar no sólo en el gel, sino también en la mancha blanca /negra en cualquier momento después de la transferencia de proteínas.

La tecnología sin manchas se aplica en el flujo de trabajo occidental V3(Figura 1)para abordar las principales quejas sobre el flujo de trabajo tradicional, especialmente las preocupaciones con el uso de proteínas de limpieza como controles de carga. Usando este flujo de trabajo, uno podría: 1) ejecutar un gel en aproximadamente 20-30 min, 2) verificar la integridad de la muestra y la calidad de la separación de proteínas en 5 minutos después de la ejecución del gel; 3) proteínas de transferencia en 3-10 min; 4) comprobar cuantitativamente la eficiencia de la transferencia; y 5) lo más importante, validar los cambios en el nivel de la proteína de interés utilizando el control de carga total de proteínas.

1. Preparación de muestras de proteínas

(Se describe un procedimiento típico para extraer proteínas del cultivo celular)

1. Coloque el plato de cultivo celular HeLa en hielo y lave las células con solución salina tamponada tris helada (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).
2. Aspirar el TBS, luego añadir 1 ml por tampón RIPA helado de 100 mm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS) complementado con inhibidores de fosfatasa y proteasa.
3. Raspe las células adherentes del plato usando un raspador de células de plástico frío; transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo microcentrífuga preenfriado.
4. Mantenga la agitación constante durante 30 minutos a 4 °C en un rotador.
5. Girar a 16.000 x g durante 20 min en una centrífuga preenfriada de 4 °C.
6. Retire suavemente el tubo de la centrífuga y colóquelo sobre hielo. Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco mantenido en hielo y deseche el pellet.
7. Retire un pequeño volumen (10-20 μl) de lisato para realizar un ensayo de proteínas. Determine la concentración de proteínas para cada muestra utilizando el kit de ensayo RC DC.
8. Si es necesario, alícuota las muestras de proteína para su almacenamiento a largo plazo a -20 °C. Repetir los ciclos de congelación y descongelación causa degradación de proteínas y debe evitarse.
9. Tome aproximadamente 20 μg de cada muestra, agregue un volumen igual de 2x Laemmli Sample Buffer (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanol, 20% glicerol, 0.004% bromofenol azul, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).
10. Calentar cada celda de lisiar en tampón de muestra a 95 °C durante 5 min.
11. Centrífuga a 16.000 x g en una microcentrífuga durante 1 min.

2. Electroforesis en gel con geles sin manchas (~ 30 min)

1. Tome un criterio TGX Cualquier gel prefabricado sin manchas KD (un gel de formato midi), retire el peine y la cinta de la parte inferior del cassette.
2. Coloque el cassette en la celda Criterion y llene la cámara tampón superior integrada con un tampón de 60 ml (25 mM Tris, 190 mM de glicina, 0,1% de SDS, pH 8,3). Enjuague los pozos con un búfer en funcionamiento.
3. Llene cada mitad del tanque de búfer inferior con un tampón de 400 ml en funcionamiento hasta la línea de llenado marcada.
4. Cargue las muestras de proteína y los marcadores de proteína apropiados.
5. Coloque la tapa en el tanque, alineando los tapones de plátano codificados por colores con los gatos correspondientes en la tapa.
6. Ejecute el gel durante ~ 30 minutos a 200 V o 20 minutos a 300 V.

3. Imágenes de gel sin manchas utilizando el sistema Chemidoc MP para verificar la calidad de separación de proteínas (~ 5 min)

1. Retire el cassette de gel de la célula. Utilice la herramienta de apertura de cassette de gel en la tapa de Criterion Cell para abrir el cassette y soltar el gel.
2. Aplique un par de mililitros de agua en el centro de la bandeja de muestras UV del captador de imágenes ChemiDoc MP. Levante cuidadosamente el gel del cassette y colómelo en la bandeja.
3. Inicie el software Image Lab y capture la imagen de gel sin manchas (Figura 1A) con los siguientes ajustes:
   Aplicación: gel sin manchas
   Tiempo de activación del gel: 1 min
   Área de imagen: gel criterio
   Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas
4. Retire el gel de la bandeja de muestra y proceda inmediatamente a la transferencia paso.

4. Transferencia de proteínas con el sistema Trans-Blot Turbo (~ 10 min)

1. Abra un paquete de transferencia Trans-Blot Turbo Midi PVDF; coloque la pila inferior (que incluye la membrana) en la base del cassette de transferencia.
2. Coloque el gel en la parte superior de la membrana, coloque la pila superior en el gel y despliegue burbujas.
3. Coloque la tapa sobre la base del cassette y gire el dial para bloquearlo.
4. Inserte el cassette en la bahía de blotter.
5. Inicie la transferencia seleccionando un programa Turbo preestablecido y eligiendo el tamaño del gel Criterion (midi) y, a continuación, presione EJECUTAR. Una carrera típica toma sólo 7 minutos.
6. Cuando termine la transferencia, desmonte el sándwich secante y coloque tanto la mancha blanca /negra como el gel en un recipiente con agua desionizada.

5. Gel sin manchas e imágenes de manchas usando el sistema Chemidoc MP para verificar la eficiencia y calidad de la transferencia de proteínas (~ 5 min)

1. Coloque el gel posterior a la transferencia en la bandeja de muestra del imager ChemiDoc MP.
2. Inicie el software Image Lab y capture la imagen libre de manchas del gel posterior a la transferencia (Figura 1B) con los siguientes ajustes:
   Aplicación: gel sin manchas
   Tiempo de activación del gel: ninguno
   Área de imagen: gel criterio
   Tiempo de exposición de la imagen: igual al tiempo de exposición para la imagen de gel pretransferible
3. Retire el gel de la bandeja de muestra y, a continuación, la imagen de la mancha blanca /negra (Figura 1C) con los siguientes ajustes. Mantenga la mancha blanca /negra mojada con unas gotas de agua o TBST al realizar la toma de imágenes.
   Aplicación: mancha libre de manchas
   Área de imagen: gel criterio
   Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas
4. Retire la membrana secante de la bandeja de muestra y colóquela en un recipiente con TBST (0,1% Tween 20 en TBS).

6. Incubación de anticuerpos

1. Bloquee colocando la mancha blanca /negra en una solución de la albúmina de suero bovino del 3% (BSA) en TBST en la temperatura ambiente por 1 hora.
2. Incubar la mancha blanca /negra durante la noche a 4 °C en la solución que contiene anticuerpo primario de ratón levantado contra la primera proteína diana y anticuerpo primario de conejo levantado contra la segunda proteína diana.
3. Vierta la solución que contiene el anticuerpo primario. A continuación, lave la mancha agitando en 20 ml de TBST durante 5 min. Repetir 4x para un total de 5 lavados.
4. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en la solución de anticuerpos secundarios que contiene un anticuerpo conjugado de cabra-anti-ratón Dylight 650 y un anticuerpo conjugado de cabra-anti-conejo Dylight 549.
5. Vierta la solución que contiene el anticuerpo primario. A continuación, lave la mancha agitando en 20 ml de TBST durante 5 min. Repetir 4x para un total de 5 lavados.

7. Imágenes y análisis de datos por software de laboratorio de imágenes- Normalización de proteínas totales (~ 5 min)

1. Adquirir una imagen fluorescente multiplexante de la mancha blanca /negra (Figura 1E) abriendo un nuevo protocolo multicanal, configurar tres canales fluorescentes y ejecutar el protocolo.
   Canal 1:
   Aplicación: blot Dylight 650
   Área de imagen: gel criterio
   Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas
   Canal 2:
   Aplicación: blot Dylight 549
   Área de imagen: gel criterio
   Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas
   Canal 3:
   Aplicación: mancha libre de manchas
   Área de imagen: gel criterio Tiempo de exposición de la imagen: optimizado automáticamente para las bandas más intensas
2. Haga clic en el icono Normalización del Cuadro de herramientas Análisis y haga clic en Sí para detectar carriles y bandas.
3. Seleccione y utilice "Herramientas de carriles y bandas" para realizar ajustes en los carriles y bandas si es necesario.
4. Seleccione imagen libre de manchas como canal de normalización.
5. Seleccione Herramientas de análisis de MW y asigne los carriles estándar de MW marcando las casillas debajo de ellos.
6. Para ver los volúmenes normalizados, haga clic en la Tabla de análisis de la barra de herramientas. Todos los cálculos serán realizados automáticamente por el software, incluyendo el factor de normalización y volúmenes normalizados. Los valores de intensidad de la banda de la proteína objetivo ahora se ajustan para la variación en la carga de proteínas. Esto permitirá comparaciones precisas de proteínas diana entre las muestras.

1. Evaluación de la integridad de la muestra, la calidad de la separación de proteínas y la eficiencia de transferencia con imágenes de gel sin manchas.

El extracto de la proteína de las células de HeLa fue separado en 300 V por el minuto 20 en un gel mancha-libre del criterio AnyKD TGX de 18 pozos. Las muestras de proteína se cargaron 3 veces en cuatro cantidades diferentes (carriles 1-3, 40 μg; Carriles 4-6, 30 μg; Carriles 7-9, 20 μg; Carriles 10-12, 10 μg). El gel se activó bajo luz UV durante 1 min. La Figura 2A muestra la imagen del gel adquirida justo después de la separación de la proteína. La integridad de la muestra de proteínas(por ejemplo, degradación) y la calidad de separación(por ejemplo, precipitación de proteínas) se pueden evaluar visualmente con esta imagen en gel. Las proteínas fueron transferidas por 7 minutos a una membrana de la nitrocelulosa usando Trans-Blot Turbo. La Figura 2B muestra la imagen libre de manchas del gel post-transferencia. Ambas imágenes fueron adquiridas con el mismo tiempo de exposición (6,8 seg). Se seleccionaron los carriles 3 y 12 para medir la eficiencia de la transferencia. Usando la herramienta de volumen en el software Image Lab, se dibujó una caja rectangular (azul) para cubrir el carril 3 y 12 en ambas imágenes de gel. El cálculo basado en los valores de volumen de estas cajas indicó que la eficiencia de transferencia de ambos carriles fue del 80% (Figura 2C). En este experimento, el gel AnyKD TGX fue seleccionado para estudiar proteínas diana de tamaño pequeño a mediano y no se optimizó para la transferencia de proteínas grandes. La optimización de la eficiencia de transferencia requeriría el uso de gel de menor porcentaje(por ejemplo, 4-20%) y/o un ajuste del tiempo de transferencia para facilitar la transferencia de proteínas grandes. 2. El control de carga total de proteínas sin manchas es una alternativa confiable al control de carga de limpieza en western blotting para cuantificar un pequeño cambio en el nivel de proteína de interés.

MCM-7 es un factor de replicación de licencias de ADN cuyo nivel disminuye en un 20-50% en las líneas celulares linfoblastoides (LCL) después del tratamiento de irradiación. En este experimento, los lysates (30 μg cada uno) de cuatro culturas de la línea celular linfoblastoide control-tratadas y de la irradiación (LCL) fueron separados en un gel mancha-libre de 12-well Criterion AnyKD TGX. El gel fue activado por 1 minuto bajo luz ULTRAVIOLETA y transferido por Trans-Blot Turbo a una membrana de PVDF para immunoblotting. La proteína de limpieza GAPDH (verde) fue sondeada con un anticuerpo de conejo (Cell Signaling Technology, USA, 1:2,500) y un anticuerpo conjugado Dylight 549 cabra-anti-conejo (Rockland, EE.UU., 1:20,000). La proteína de interés MCM-7 (rojo) fue sondeada utilizando un anticuerpo de ratón (Abcam, EE.UU., 1:1.000) y un anticuerpo conjugado cabra-anti-ratón Dylight 649 (Rockland, 1:10.000).

La Figura 3A muestra una imagen fluorescente múltiplex de proteínas totales (azul), MCM-7 (rojo) y GAPDH (verde) detectadas en cuatro muestras de LCL tratadas con control e irradiación. La Figura 3B es una imagen libre de manchas de la misma mancha que muestra los patrones de proteína total en cada muestra (30 μg). El software de laboratorio de imágenes seleccionó los carriles de muestra (cajas azules) para medir MCM-7, GAPDH y el volumen total de proteínas en cada carril. Los niveles MCM-7 fueron normalizados contra la medida total mancha-libre de la proteína o contra GAPDH. Se analizaron estadísticamente los niveles normalizados de proteína MCM-7 y se presentan en la tabla el volumenmedio de la banda de proteínas MCM-7 y la desviación estándar (n=4). Ambos métodos de normalización revelaron una pequeña disminución (alrededor del 25%) en los niveles de proteína MCM-7 después del tratamiento de irradiación. Los datos con la normalización total de la proteína exhibieron una desviación estándar más pequeña que ésa con GAPDH como el control del cargamento.

Figura 1. V3 Flujo de trabajo occidental. El flujo de trabajo V3 se muestra en la columna izquierda en 4 pasos. Los principales instrumentos y reactivos utilizados en el flujo de trabajo se muestran en cada paso. También se incluye el tiempo estimado para cada paso. La columna de la derecha muestra que se puede generar un mínimo de 4 imágenes en el flujo de trabajo de V3. Se describe el uso de cada dato. Las imágenes libres de manchas del gel pretransferible, el gel post-transferencia y la mancha blanca /negra(A, B, C)no se pueden generar fácilmente con las técnicas tradicionales de western blotting; Estas imágenes y datos proporcionan información importante y puntos de control a lo largo del procedimiento para mejorar el control del científico y la reproducibilidad del flujo de trabajo de Western blot. Las señales de la proteína de la blanco se pueden capturar en una imagen quimioluminiscente de la mancha blanca /negra(D)si un anticuerpo secundario HRP-conjugado fue aplicado en la detección o en una imagen fluorescente de la mancha blanca /negra(E)si la borrasco occidental fluorescente múltiplexing fue realizada para detectar más de una proteína de la blanco simultáneamente en la misma mancha blanca /negra. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Imágenes sin manchas de geles pretransferibles y post-transferencia en el flujo de trabajo occidental V3 para evaluar la integridad de la muestra, la calidad de la separación y la eficiencia de la transferencia. (A)Imagen libre de manchas en gel pretransferible. (B)Imagen libre de manchas de gel post-transferencia. (C) Medición de la eficiencia de la transferencia de proteínas. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Comparación de la medición de la proteína total libre de manchas con la inmunodetección de GAPDH como controles de carga para normalizar el nivel de proteína de interés. (A) Imagen fluorescente de western blot. (B) Imagen de mancha libre de manchas. (C)Niveles normalizados de la proteína MCM-7. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Los autores, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond y Ning Liu son empleados de Bio-Rad Laboratories, Inc.