Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

Summary

Detta protokoll specificerar en metod för isolering av antigenpresenterande celler från human tymus via olika stegen i enzymatisk spjälkning av vävnaden följt av densitetscentrifugering av enkelcellsuspension och slutligen magnetiskt och / eller FACS-sortering av cellpopulationer av intresse.

Abstract

I detta protokoll ger vi en metod för att isolera dendritiska celler (DC) och epitelceller (TEC) från den mänskliga bräss. DC och TEC är den stora antigenpresenterande celler (APC) typer som finns i en normal tymus och det är väl känt att de spelar olika roller under thymic val. Dessa celler är lokaliserade i olika mikromiljöer i tymus och varje APC typ utgör endast en mindre population av celler. För att ytterligare förstå biologin av dessa celltyper, är karakterisering av dessa cellpopulationer mycket önskvärt men på grund av sin låga frekvens, isolering av någon av dessa celltyper kräver ett effektivt och reproducerbart förfarande. Detta protokoll detaljer en metod för att få celler som är lämpliga för karakterisering av olika cellulära egenskaper. Tymusvävnad är mekaniskt avbrutna och efter olika steg av enzymatisk digerering, är den resulterande cellsuspension anrikad med användning av en Percoll-densitetscentrifugeringssteg. För isolering av myeloid DC (CD11c <sup> +), celler från låg densitet fraktion (LDF) är immunoselected genom magnetisk cellsortering. Anrikning av TEC-populationer (Mtec, CTEC) uppnås genom uttömning av hematopoietiska (CD45 ^hi)-celler från den låg densitet Percoll-cellfraktionen som möjliggör deras efterföljande isolering genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med användning av specifika cellmarkörer. De isolerade cellerna kan användas för olika tillämpningar nedströms.

Introduction

Tymus är det organ i vilket T-cellutveckling sker. Dess relativa och absoluta storlek minskar med åldern när det blir successivt ersätts av fett även thymic aktivitet fortfarande kan detekteras i ålderdomen. Dess betydelse för immunsvar visades i början av 1960-talet ^1.

Den T-cellrepertoaren formas genom samverkan mellan T-cellreceptorer med peptid-MHC-komplex på olika typer av tymus-APC, som ger överlevnad eller död cues att utveckla T-celler, vilket resulterar i en funktionell och i stor utsträckning självtoleranta T-cellrepertoaren ^2.

Ungefär 98% av cellerna i människo tymus utvecklar T-celler kallade tymocyter. De återstående 2% bestå av ett antal olika celltyper, inklusive en variation av TEC (kortikal, medullär, subkapsulär), myeloida och plasmacytoid DC (MDC, PDC), makrofager, B-celler, mogna åter cirkulerande T-celler, granulocyter, fibroblasts, endotelceller och mycket sällsynta epiteliala celler med en expressions fenotyp som liknar det av celler från andra vävnader, såsom muskler, neuroner och respiratoriskt epitel (Figur 1). Av dessa TEC och DC är de stora APC typer som finns i en normal tymus. Under senare år har reningen av dessa APC typer för kultur och molekylär profilering fått mer och mer intresse. På grund av sin låga frekvens, isolering av någon av dessa celltyper för detaljerad analys kräver ett effektivt, reproducerbart och kostnadseffektiv procedur. Den metod som presenteras här är en ändring från tidigare publicerade studier ^3,4.

Som med någon annan vävnad kan cellutvinning från tymus uppnås genom enzymatisk sönderdelning av den cell-cell-och cell-matrix-interaktionsnätverk, för att erhålla en suspension av enstaka celler. Det finns vissa parametrar som god dissociation effektivitet, cell avkastning, cellviabiliteten och bibehållande av cell surface markörer som är avgörande och måste optimeras för den framgångsrika isoleringen av dessa sällsynta cellpopulationer.

I detta protokoll, är isolering av DC och TEC grupper utförs genom att göra en encelliga suspension av vävnaden genom mekanisk störning och enzymatisk nedbrytning. Vi använder kollagenas A från Clostridium histolyticum, som har en balans mellan olika enzymaktiviteter, för att bryta ner den infödda kollagen som håller vävnaden tillsammans. DNas ingår i enzymlösningen för att minska cell aggregering grund fri DNA från döda celler (tymocyter är mycket känsliga). Vi erbjuder även ett alternativ till den typiska enzymatisk vävnad matsmältningen involverar mekanisk och enzymatisk vävnadsbehandling med bistånd av en vävnad dissociator. Den enda cellsuspension underkastas sedan en enda Percoll-densitetscentrifugering för anrikning av lågdensitetsfraktionen (LDF) av celler. Ur denna fraktion av celler, kan DC isoleras genom färgning feller DC-ytmarkörer (dvs. CD11c ⁺⁾ och med hjälp av magnetisk separation eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Till skillnad från de lymfoida celler som innefattar den stora majoriteten av celler i tymus, behöver TEC inte uttrycka CD45 vid höga nivåer, men är positiva för epitelial celladhesionsmolekyl EpCAM. CTEC kan särskiljas från medullära TEC genom uttrycket av en ännu odefinierad antigen som igenkännes av den CDR-2 (kortikal dendritisk retikulocyt-2) antikropp ^4,5 och något lägre EpCAM expression. Differential co-uttryck av EpCAM och CDR2 möjliggör effektiv isolering av dessa TEC grupper via höghastighetscellsortering ^6.

Protokollet presenteras här är optimerad för human tymusvävnad. Varaktigheten av förfarandet beror på mängden av vävnad och förmågan hos den som utför experimentet liksom hastigheten på cellsorterare, om FACS-sortering användes. Normalt kan protokollet för isolering av DC vara avslutad inom 5-6 H och för isoleringen av TEC i 8-10 timmar. Isoleringen av DC och TEC grupper från tymusvävnad är tidskänsliga. Ju snabbare isoleringsförfarandet, desto bättre tillstånd hos cellerna. Slutligen kan de isolerade cellerna kan användas för ytterligare undersökningar såsom jämförande studier av mRNA och proteinuttryck, PCR-experiment, proteinisolering, molekylär profilering (dvs transkriptomik, mikro-RNA-analys) samt cellodlings ^6.

Ethics Uttalande

För att kunna arbeta med mänsklig bräss vävnad behöver forskaren att få godkännande från den lokala etiska kommittén eller ansvariga myndigheter samt ett informerat skriftligt samtycke av givaren (eller oftast hans eller hennes föräldrar, eftersom vävnaden erhålls vanligtvis från sändare barn). Dessutom bör alla mänskliga vävnader hanteras som potentiellt smittsamma och lämpliga åtgärder bör vidtas, till exempel att arbeta med handskar, osv.

Protocol

1. Beredning av verktyg, Enzyme Lösningar och buffertar

Utför följande förberedande steg före början av protokollet.

1. Verktyg
   Ren, torr och autoklavera följande verktyg och hålla dem i sterila förpackningar fram till användning.
   1. Liten vass sax med antingen böjda eller raka tips för att skära bräss vävnad. Små böjda pincett med tandade tips för hantering av vävnaden.
   2. 50 ml Oak Ridge Centrifugrör, PC, för Percoll densitet centrifugeringssteg.
2. Enzymlösningar
   Förbered kollagenas / DNas I-enzymblandning (2 mg kollagenas / ml och 0,1 mg DNas I / ml) enligt följande:
   1. Lös 500 mg lyofiliserad kollagenas A (Roche) i 250 ml RPMI 1640 slätt (ingen FCS) för erhållande av en 2 mg / ml kollagenas lösning. Kollagenas är ganska svårt att lösa, så det rekommenderas att lämna den en stund på en berg-shaker vid RT.
   2. Lös 100 mg DNas I (Roche) i10 ml sterilt destillerat vatten. 2,5 ml prover kan lagras vid -20 ° C. Tillsätt 2,5 ml av 10 mg DNas lösning i 2 mg kollagenas En lösning.
   3. Sterilfiltrera kollagenas / DNas mix med hjälp av en Stericup filterenhet (0,22 um). Förvaras i 10-20 ml alikvoter vid -20 ° C fram till användning.
3. Buffertar och lösningar
   1. 1,5 M NaCl-stamlösning: Lös NaCl i destillerat sterilt vatten till en slutlig koncentration av 1,5 M. Filtrera lösningen genom ett 0,22 | im filter och förvara vid RT.
   2. 10x MACS-buffert: 1x PBS ^{(Ca2 +} / ^{Mg2 +-fri)} innehållande 5% BSA och 20 mM EDTA. Sterilfiltrera lösningen med ett 0,22 | im filter och förvara vid 4 ° C. Före användning förbereda en 1x-lösning genom att späda 10x lager till 1x i kall steril 1x PBS.
   3. FACS-buffert: 1x PBS ^{(Ca2 +} / ^{Mg2 +-fri)} innehållande 1% BSA och 0,02% _NaN3.
   4. FACS-buffert för cellsortering: 1x PBS (Ca ^{2 +} / Mg

2. Beredning av Tissue

Behandlingen av vävnaden bör utföras med sterila reagens och arbete i ett skåp med laminärt flöde. Innan förfarandet inleds, förbereda följande reagenser och utrustning:

1. 1. Värm följande till RT: RPMI 1640 komplett medium (RPMI 1640, 10% fetalt kalvserum, 1% pen / strep), RPMI 1640 slätt, ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +-fri} PBS och 2x kollagenas / DNas enzymlösning.
   2. Varm termisk inkubator med rotationsenhet till 37 ° C och cool fast vinkelrotor centrifug till 4 ° C.
   3. Förbered en låda med is.

Anm: varaktigheten av detta steg beror på tillståndet och storleken av vävnaden. Cirka 20-30 min är rimlig tid som behövs för en medelstor bit tissue i god kondition (~ 5 cm i bredd).

2. Placera vävnad i en petriskål med steril PBS och skölja bort alla rester av blod.
   1. Lägg färsk PBS för att förhindra vävnad från att torka och använda pincett och sax rengöra vävnaden från blodproppar, bindväv och fettvävnad och någon del som inte ser frisk.
   2. Var försiktig för att avlägsna nekrotisk vävnad som kommer att öka den mängd smuts.
   3. Efter rengöring, väger vävnad som referens.
   4. Skär vävnaden i ca 1 cm ³ st / block. Tillsätt tillräckligt med PBS för att täcka vävnaden.

Obs! Reproducerbarhet av resultat, bör vävnad skäras i bitar av enhetlig storlek.

3. Med hjälp av baksidan av en steril spruta (10-20 ml) utöva tryck (inte alltför kraftig eller långvarig) på tymusvävnad bitar. Denna procedur kommer att avlägsna huvuddelen av tymocyter, vilket minskar vävnadsvolymen som skall bearbetas senare. Utför detta steg på is och arbeta snabbt.
4. Lösningen blir synligt grumlig som tymocyter släpps. Rör skålen försiktigt och sedan med hjälp av en 5 ml pipett eller ett glas sug avlägsna supernatanten innehållande tymocyterna tar hand inte av misstag aspirera vävnadsbitar.

Tips: En steril cellodlings skrapa kan användas för att koncentrera alla vävnadsstycken vid en sida av skålen sedan luta skålen (45 ° vinkel) och aspirera supernatanten. Ersätt med färsk PBS och upprepa proceduren tills supernatanten är relativt öppen. Utför sista tvätten med RPMI slätten.

5. Finhacka vävnadsbitar med hjälp av vass sax (så fint som möjligt, bör fragment vara minst 2-4 mm). Fragmenten bör vara tillräckligt liten för att skriva en 5-ml pipett.

3. Beredning av Single Cell Suspension från Thymus Tissue

Härtvå alternativa tillvägagångssätt för detta steg beskrivs. Det första tillvägagångssättet beskriver en typisk enzymatisk vävnad matsmältningen (avsnitt 3.1), medan den andra handlar om mekanisk och enzymatisk vävnadsbehandling biträdas av en vävnads dissociator (avsnitt 3.2).

Detta protokoll är optimerad för behandling av vävnadsprover som väger 5 g. För större eller mindre vävnadsprover, justera enzymvolymer därefter.

3.1 Typiska enzymatisk vävnad matsmältningen att erhålla en enda cellsuspension

1. Placera mosade vävnad i 50 ml rör med 10 ml kollagenas / DNas lösning per 5 g vävnad. Lägg RPMI vanligt att ge en total volym på 20 ml.

Notera: i en 50 ml tub smälta upp till 10 g vävnad. Justera enzym volymen.

2. Inkubera vävnadssuspension under 40 min vid 37 ° C under långsam rotation i en termisk inkubator.

Notera:

3. Enzymlösningen kommer att bli grumlig eftersom celler frigörs in i den. Vid slutet av digestionen, centrifugrör vid 110 x g under 2 min för att sedimentera vävnadsfragment.
4. Samla supernatanten från denna uppslutning runt. Pelle cellsuspensionen under 10 min vid 400 x g.. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 10-50 ml RPMI komplett beroende på storleken av cellpelleten.
5. Håll cellsuspensionen i 37 ° C inkubator med locket löst.
6. Om större cellantal önskas kan uppslutningssteget upprepas med de återstående vävnadsfragmenten och det första och det andra smälta samman. Dessutom, om TEC skall isoleras, två rundor av digereringar utföras.
7. Späd en alikvot av cellsuspensionen i trypanblått (1:10-1:100) och räkna livskraftiga celler med användning av en hemocytometer. Förvara cellerna vid 37 ° C i inkubatorn tills den ska gå vidare till Percoll densitetscentrifugering (avsnitt 4). Efterföljande isolering av DC-undergrupper (avsnitt 5) kommer att utföras från dessa celler.

Anm: tymiska vävnader kan variera i sin sammansättning, särskilt med åldern, vilket påverkar matsmältningen verkningsgrad och genereringen av en enkelcellsuspension.

9. För den efterföljande isoleringen av tymiska epitelceller (TEC) krävs en tredje runda av enzymatisk digerering. Resuspendera vävnadsrester i 10 ml färskt kollagenas / DNas-lösning plus 10 ml RPMI slätt och lägg Trypsin / EDTA (1:50 från 2,5% stock) i lösningen.
10. Inkubera vid 37 ° C under 40 min med försiktig rotation. Under de sista 10 - 15 min av inkubationen till FCS (01:05) för att neutralisera aktiviteten hos trypsin.
11. Centrifugera vid 110 x g under 2 min vid RT för att sedimentera vävnadsfragment.

12. Samla cellsupernatanten och kassera de sedimenterade vävnadsfragment.
13. Centrifugera cell supernatanten vid 400 x g under 10 min. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i RPMI komplett.

Tips: Cell pellets är ganska löst, så var försiktig när du kasserar / aspirera supernatanten.

14. Räkna livskraftiga celler med användning av en hemocytometer. Placera cellerna i en 37 ° C inkubator tills vidare till PercoU separation (avsnitt 4). Efterföljande pre-anrikning av TEC celler genom utarmning av CD45 ^hi celler kommer att utföras från dessa celler (avsnitt 6).

3.2 Mekanisk och enzymatisk vävnadsbehandling med bistånd av en vävnad dissociator

7,8.

1. För över 5 g malet vävnadsbitar (steg 2,5) i en C Tube innehåller 10 ml kollagenas / DNas lösning.
2. Adapt C rör på vävnaden dissociator och kör programmet m_spleen_02 (10 sek). Upprepa detta program 4-5x (40-50 sek).
3. Inkubera under försiktig rotation under 20 minuter vid 37 ° C.
4. Centrifugera vid 110 x g under 2 min vid rumstemperatur.
5. Samla supernatanten och fortsätt som i steg 3.1.4. Tillsätt 10 ml färskt kollagenas / DNas lösning.
6. Adapt C rör på vävnaden dissociator och kör programmet m_spleen_01 (56 sek).
7. Inkubera vid 37 ° C under 20 min med försiktig rotation.
8. Centrifugera vid 110 x g under 2 min vid rumstemperatur.
9. CollecT-cell-supernatanten och pelletera cellsuspension under 10 minuter vid 400 x g.. Fortsätt som i steg 3.1.4.
10. Såsom beskrivs i 3.1.9 måste en tredje omgång av digestion för efterföljande isolering av tymiska epitelceller (TEC). För detta återsuspendera vävnadsrester i 10 ml färskt kollagenas / DNas-lösning plus Trypsin / EDTA (1:50 spädning av lager 2,5%)
11. Inkubera vid 37 ° C under ytterligare 20 min med försiktig rotation. Lägg FCS (1:05) och inkubera under ytterligare 10 minuter.

OBS: Genom att använda denna metod, efter denna sista matsmältning steg vävnaden är oftast helt dissocierade och inga osmälta vävnadsfragment observeras.

12. Fortsätt som i steg 3.1.11-3.1.14.

4. Anrikning av LDF av celler med Percoll densitet Separation

Efter enzymatisk digerering av vävnad, är de totala tymiska enkelcellsuspensioner utsattes för en enda Percoll density centrifugation steget att anrika LDF celler. LDF av celler höganrikat för APC. Både DC och TEC upptäcks i denna fraktion av celler.

1. Använd enda cell suspension erhållits från den ^{1: a} och ^{2: a} smälter för MDC isolering (poolade celler, se steg 3.1.8) eller ^{3: e} digest (för TEC isolering) (3.1.14). Centrifugera enda cellsuspension erhålles från varje digereringssteget vid 400 xg under 10 min.
2. Bered en Percoll-lösning med en slutlig densitet av 1,07 g / ml under denna tvättsteget (se exempel i tabellen nedan).

   Framställning av Percoll-lösning till en slutlig densitet av 1,07 g / ml (ρ = 1,07)
   Rör nr	1	2	3	4
   Outspädd Percoll (ρ = 1,130) (ml)	2,96	5,92	8,88	11,84
   1,5 M NaCl (ml)	0,6	1,20	1,8	2,4
   destillerat H2O (ml)	2,44	4,88	7,32	9,76
   Volymen av slutbruksspädning	6 ml	12 ml	18 ml	24 ml

3. Antalet Percoll rören beror på cellantalet som bestäms i steg 3.1.8 och / eller 3.1.14. Kombinera de sterila lösningar och blanda väl. För optimal isolering, kan 0,6-1 x 10 ⁹ celler laddas per rör av Percoll. Kombinera de sterila lösningar och blanda väl.

Tips: PercoU är ljuskänsligt och dessutom bör hållas kall. Förbered första blandningen innehållande NaCl och _H2O (RT) och tillsätt outspädd Percoll sist, strax innan återsuspendering av cellerna i Percoll-lösning.

tält "> Obs! Percoll densitet kan variera mellan olika leverantörer och satser Om densiteten av den outspädda Percoll lösningen är inte lika med 1,130 g / ml, använd instruktionerna från tillverkaren för att beräkna de exakta mängder PercoU och _H2O krävs för att få en slutlig densitet av 1,07 g / ml.

4. Resuspendera upp till 1 x 10 ⁹ celler i 6 ml av den beredda Percoll-lösning (ρ = 1,07), blanda tillräckligt mycket för att få en homogen suspension, och överför till en 50 ml Oak Ridge polykarbonat skruvkork centrifugrör.
5. Skiktet försiktigt 30 ml av RPMI komplett per rör med en pipett på toppen av Percoll-lösning / cellsuspension. Fyll på mediet långsamt, så att den förblir på ovansidan av suspensionen och se till att inte störa skiktet.
6. Väg rören för att säkerställa att de har lika vikter så att de är balanserade under centrifugering. Om de inte är, försiktigt lägga mer medel till den ljusare röret (under sterile förhållanden).
7. Försiktigt överföra rören till en i förväg kyld centrifug med en fixerad vinkelrotor, och centrifugering vid 3500 x g under 35 min, vid 4 ° C med bromsen av. Se till att temperaturen i centrifugen i inte är högre än 4 ° C.
8. Ta bort rören från centrifugen och noggrant samla den berikade APC, fann vid interfas mellan Percoll och medium (låg densitet fraktion) från varje rör med hjälp av en steril Pasteur-pipett. Överför celler i ett 50 ml rör som innehåller kall RPMI komplett. Fyll röret för att späda ut de resterande Percoll.
9. Centrifugera cellsuspensionen under 10 min vid 300 xg vid 4 ° C. Kassera supernatanten och upprepa tvätt.
10. Resuspendera cellpelleten i medium och bestämma celltalet (med användning av trypanblått och en hemocytometer). Enligt vår erfarenhet är den andel av LDF cellerna cirka 2-20% av den totala enda cell suspension erhålls efter enzymdigestion. En typisk yield av låg densitet berikade celler (från en ung bräss, intervall 1 dag-2 år) är 1x10 ⁸ celler per 1 x 10 ^9, vilket motsvarar en 10% av de totala singelcellsuspensionsceller.

OBS: I detta skede kan du konstatera att celler aggregeras i suspensionen (särskilt med prover från barn till äldre ålder). Cellklumpar är indikation på celldöd och resultat från frisättningen av DNA från döende celler som kan hålla celler tillsammans. I ett sådant fall, lägga till DNas I i provet (50 pg / ml) och inkubera den i upp till 20 min vid RT (försiktigt vändas varje 5 min) för att smälta de fria DNA-molekyler.

5. Isolering av thymus MDC

Efter APC anrikning (via Percoll separation) kan MDC effektivt isoleras från LDF efter den första och andra omgången av enzymatiska spjälkningar. Följande protokoll är en modifierad version av magnetisk cellseparation för isolering av MDC (CD11c

1. Centrifugera APC anrikade celler isolerade från enkelcellsuspension erhållen från poolad första och andra enzymatisk digerering vid 300 xg under 10 minuter vid 4 ° C och återsuspendera cellpelleten i 100 | il MACS-buffert per 10 ^7-celler.
2. Lägg till 5 l av CD11c-PE-antikroppen per 10 ⁷ celler.

Obs: titreringsexperiment rekommenderas för optimala resultat.

3. Blanda väl och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C, skyddat från ljus.
4. Tvätta cellerna genom att tillsätta 1 till 2 ml av MACS-buffert per 10 ^7-celler och centrifugera vid 300 xg under 10 min.
5. Aspirera supernatanten helt och slamma upp till 10 ⁷ celler i 80 l av MACS-buffert.
6. Lägg 20 pl anti-PE mikrokulor per 10 ⁷ celler.
7. Blanda väl (Do Not Vortex) och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C i skydd mot ljus.
8. Upprepa som i steg 5.4. Resuspendera upp till 10 ⁸ celler i 500 l av buffert.
9. Om så är nödvändigt, filtrera cellsuspension med användning av en 40 | im cellfilter för att ta bort skräp och cellaggregat som kan hindra flödet av kolonnen.
10. Använd en LS kolumn eftersom bräss cellsuspensioner flöda bättre genom LS kolumner. Förbered LS kolumnen efter tillverkarens anvisningar. Pipettera cellsuspensionen långsamt i kolonnen undvika genererar bubblor. Använd en kolumn för varje 1 x 10 ⁸ celler.
11. Tvätta kolonn enligt tillverkarens instruktioner. Ta bort kolumnen från magneten och placera den i en steril 12 ml rundbotten polypropylen rör. Lägg 3 ml MACS-buffert på kolonnen och samla magnetiskt märkta celler genom att sätta in och stadigt trycka in kolven i kolonnen.
12. Samla den eluerade fraktionen representerar CD11c ⁺ MDC och centrifugera vid 400 xg under 6 min.
13. Bestäm mobilnummer och bekräfta renhet av den valda cellen populatipå genom flödescytometrisk analys. Föreslagna markörer inkluderar CD45, CD11c, och HLA-DR.

Anm: CD11c ⁺ MDC kan också isoleras med användning av en FACS-sorterare.

6. Anrikning av CD45 ^{lo / neg} celler för cellsortering av TEC

För isolering av TEC, celler kan vara pre-berikas genom utarmning av CD45 ^hi celler med hjälp av CD45 mikropärlor, för att snabba upp sin isolering genom cellsortering.

Använd enda cell suspension erhållits från den ^{3: e} matsmältningen steg (3.1.14) och därefter separeras med PercoU centrifugering.

1. Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera cellpelleten i 80 | il MACS-buffert per 10 ^7-celler.
2. Använd CD45 mikropärlor vid 1/3 av den rekommenderade mängden (6,7 | il) per 10 ^7-celler.

OBS: Genom att använda en mindre mängdav mikropärlor vi pre-berika celler för både CD45 ^lo och CD45 ^neg celler. Titrering rekommenderas för bästa resultat.

3. Blanda väl genom att försiktigt ställa röret (Do Not Vortex) och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C.
4. Tvätta de obundna mikropärlor genom tillsats av 10 ml av MACS-buffert och centrifugera i 10 min vid 300 xg vid 4 ° C. Sug ut supernatant helt.
5. Resuspendera upp till 10 ⁸ celler i 500 l av buffert.
6. Om så är nödvändigt, filtrera cellsuspension med användning av en 70 | im cellfilter för att ta bort skräp och cellaggregat som kan hindra flödet av kolonnen.
7. Använd en LS kolumn eftersom bräss cellsuspensioner flöda bättre genom LS kolumner. Förbered LS kolumnen efter tillverkarens anvisningar. Pipettera cellsuspensionen långsamt i kolonnen undvika genererar bubblor. Använd en kolumn för varje 10 ⁸ celler.
8. Samla omärkta celler (genomflödes och tvättar) som innehållerCD45 ^{lo / neg} cellfraktion och tvätta kolonnen efter tillverkarens anvisningar.
9. Centrifugera vid 300 x g under 10 min vid 4 ° C och återsuspendera cellpelleten i steril FACS-buffert för att fastställa antalet celler och vidare till färgning för cellsortering.

7. Fläck Celler för Fluorescens Aktivt cellsortering

1. Utför FcR blockerande före cellfärgning, för att minska icke-specifik antikroppsbindning. Inkubera cellsuspension med poolade humana immunoglobuliner lösning i 15 min vid RT. Dessa reagens är kommersiellt tillgängliga (dvs. Gammunex 10% lösning).
2. Tvätta cellerna genom tillsättning av kall steril FACS buffert. Centrifugera vid 400 x g under 6 min vid 4 ° C.
3. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i kall steril FACS buffert. Förbered 5 prover enligt följande exempel:
   

   * Scc, enkel färgkontroll

   Inkubera cellerna med antikroppar för 30 min, på is i mörker.
   Tvätta två gånger med FACS-buffert genom centrifugering av cellerna vid 400 x g under 6 min vid 4 ° C.
   Justera cellkoncentrationen hos provet som skall sorteras till en x10 ⁷ celler / ml (eller till koncentrationen rekommenderas av cellsorteringsanläggning) med användning av sterila FACS-buffert för cellsortering (dvs. utan _NaN3).
   Passera cellprov genom ett 70 ìm cell sil för att avlägsna eventuella cellklumpar som kan täppa cytometern under sortering.
   Resuspendera kontrollprov i 200-400 l av buffert. Håll rören på is och skyddas från ljus.
   Förbered uppsamlingsrören med medium.

   Anteckningar:

   • Utför titrering av antikroppar för optimal färgning.
   • I ett prov för sortering, kan upp till 50 x 10 ⁶ celler färgas i en total reaktionsvolym av500 | il.
   • Utför-färgning av provet som skall sorteras i 5 ml Falcon Polystyren rundbottnade rör. De enskilda färgkontroller kan färgas i separata brunnar i en 96-brunnsplatta.
   • Eftersom TEC undergrupper är sällsynta befolkningar, är det tillrådligt att använda en annan positiv markör (hög frekvens) för varje fluorokrom för att underlätta fastställandet av lämpliga FACS inställningar och se till att du har ordentlig ersättning om valet av fluorokromer kräver ersättning. Celler från CD45 ^+-fraktionen kan färgas med markörer såsom CD45, CD3 eller CD8 för de olika fluorokromer och efter färgning ofärgade CD45 ^+-celler kan tillsättas till provet.

   8. Isolering av TEC med fluorescensaktiverad cellsortering

   TEC delmängder kan sorteras från CD45 ^{lo / neg} fraktion som EpCAM ^hi CDR2 ^- (Mtec) eller EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   1. Kör prov kvickheth de ofärgade celler och justera framåt och sidospridning för att placera populationen av intresse i skala. Ställ in spänningen på varje detektor så att cellerna är synliga men ligger i handdelen längst till vänster i histogrammet.
   2. Kör varje enda färgade provet och justera kompensation för varje färg.
   3. Efter justering av spänning och ersättning för de ofärgade och enda färgade kontroller kör provet som skall sorteras och användning gating verktyg för att definiera populationen av intresse. Använd en bred framåt och sidospridning grind för att säkerställa integration av alla stromal cellstorlekar, medan exklusive cellrester.
   4. På pricken tomt med CD45-Pacific Blue kontra Forward Scatter gate på CD45 ^låg-och CD45 ^neg celler.
   5. Applicera denna port till en EpCAM kontra CDR2 punktdiagram och avgöra genom att grinda befolkningarna som ska sorteras.
   6. När portarna har bestämts, väljer portarna innehåller populationerna av intresse och börja sortera.

   Observera: Under sortering för att förhindra celler från att fastna vid sidorna av uppsamlingsröret, varvid röret kan i förväg beläggas genom att fylla den med 50% FCS i PBS och inkuberades vid RT under 30 min. Kasta beläggningslösningen innan du lägger insamlingsmedier.

   Representative Results

   Som utgångsmaterial i detta protokoll använder vi bräss vävnad tas bort från barn som genomgår korrigerande kardiovaskulär kirurgi (Thorax och kardiovaskulär kirurgi, universitetskliniken Tübingen) erhålls efter informerat samtycke och under institutionens riktlinjer. Detta kasse material kan variera mycket i storlek 2-30 g eller mer. Antalet MDC och TEC-delmängder (CTEC och Mtec) som erhålls beror på storleken och åldern hos provet tymus vävnad som används för isolering.

   Figur 2 visar en ganska stor bit vävnad (~ 9 cm), som erhållits från en sex år gamla barn. Ett viktigt första förberedande steg i detta protokoll är rengöring av vävnad från oönskade delar (indikeras med vita pilar).

   Thymus vävnad behandlades som beskrivs i avsnitt 2 och 3.1 i protokollet för att erhålla en enda cell suspension som avskiljdes med en enda Percoll densitet centrifuge step Medan enkelcellsuspension innehåller cirka 3% av HLA-DR +-celler (Figur 3A), efter Percoll-centrifuge denna procentsats ökas i låg densitet fraktion (LDF), innehållande stora och medelstora celler, för att 15 till 40%, medan hög densitet fraktion (HDF) som huvudsakligen består av likformiga små stora tymocyter innehåller praktiskt taget inga sådana celler (Figur 3B). Den fraktion av intresse (LDF), som innehåller anrikat APC därefter samlas in och tvättas för att samla in celler för användning i efterföljande isoleringssteg.

   Medan tymus MDC kan identifieras genom expression av ett antal ytmarkörer, inklusive CD11c9, 10, PDC uttrycka markörer såsom BDCA-2, BDCA-4, CD45RA och CD123 ^11,12. Efter anrikning av LDF celler, båda celltyperna utgör 2-10% av denna fraktion, vilket gör att en effektiv isolering även i större antal, antingen genom magnetisk cellseparation eller flödes sortering av CD11c ⁺ eller BDCA-4 ⁺celler ^6.

   Figur 4 visar en effektiv isolering av CD11c ^+-celler med användning av den modifierade magnetisk cellseparation protokoll som beskrivs i avsnitt 5. Efter isolering, renhet CD11c ⁺ DC var 93% som fastställdes genom immunfärgning av isolerade celler. I genomsnitt är återvinning av isolerade CD11c ⁺ DC 5 x 10 ⁵ -5 x 10 ⁶ MDC per 10 ⁹ totalt tymusceller. Tabell 1 visar data från flera enskilda bräss prover av olika ålder och vävnadsvikt med en rad olika input singel cellsuspensioner samt total LDF siffror och den efterföljande CD11c ⁺ avkastning och renhet.

   I APC anrikade fraktionen, endast ca 0,5% av cellerna är CD45 ^lo EpCAM ⁺ eller CD45 ^neg EpCAM ^+. CTEC och Mtec kan sorteras från trypsin-smält CD45 ^{lo / neg} berikade stromaceller som EpCAM ^l o CDR2 ⁺ och EpCAM ^hi CDR2 ^-, respektive såsom visas i fig. 5.

   
   Figur 1. Ett förenklat schema över den cellulära organisation och sammansättning av den mänskliga bräss. Bräss består av tymocyter, vid olika mognadsstadier, och en heterogen mobilnät kallad thymic stroma som bildar thymic miljö. De huvudsakliga celltyperna av den thymic stroma är MDC och PDC, epitelceller (uppdelade i två huvudkategorier beroende på deras lokalisering inom lob: kortikala och medullär) och makrofager Förkortningar: DC, dendritiska celler, MDC, myeloida dendritiska celler;. PDC plasmacytoid dendritiska celler, M O, makrofager, mono, monocyter, CTEC, kortikala epitelceller, Mtec, märg epitelceller.

   tält "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
   Figur 2. Första förberedande steg i vävnaden för encelliga förberedelser. Pilarna pekar på de oönskade vävnadsdelar som måste kasseras innan verkställandet av protokollet.

   
   Figur 3. Rening av tymus APC. FACS-analys av olika stadier i reningsproceduren. Enkelcellsuspensioner av bräss vävnad erhölls genom mekanisk sönderdelning och serie enzymatiska klyvningar och APC berikad (LDF-celler) genom Percoll-densitetsseparation. Celler före (A) och efter (B) Percoll-densitetsseparation färgades med HLA-DR-PE-antikroppen för att kontrollera om APC anrikning. Procentuell sortiment av HLA-DR + celler normalt observeras är indike ed.

   
   Figur 4. Isolering av CD11c ⁺ MDC. Thymus vävnaden digererades genom användning kollagenas A / DNas I för att skapa en enkelcellsuspension. CD11c ⁺ MDC utgör endast en mindre population av den enda cellsuspension (0,6%). Efter anrikning av LDF celler via Percoll-densitetsseparation andelen CD11c ⁺ celler ökar till ~ 9%. LDF-celler märktes med CD11c-PE-antikroppen och därefter isoleras med hjälp av magnetiska kulor (anti-PE). Ny analys av CD11c ⁺ befolkningen direkt efter magnetisk cellseparation genom FACS indikerade 93% renhet. Klicka här för att visa en större bild .

   0951/50951fig5.jpg "/>
   Figur 5. Anrikning av CD45 ^{lo / neg} celler och efterföljande sortering av TEC delmängder. A) Representativa punktdiagram som visar procentandelar av CD45 negativ / låga thymic stromal celler totalt enkelcellsuspensioner före och efter Percoll täthetsseparation (9% och 16,2%, respektive). B) De LDF celler utarmat av CD45 ^hi celler med hjälp av magnetiska kulor och TEC grupper sorterade från den utarmade fraktion som EpCAM ^hej CDR2 ^- (Mtec) eller EpCAM ^lo CDR2 ⁺ (CTEC).

   Prov	Provtyp Antikropp	Cellantal	Total volym
   1. ofärgade	kontroll		1 x 10 6	50 | il
   2.scc *-Pacific Blue	kontroll	CD45-Pacific Blue	1 x 10 6	50 | il
   3. scc-APC	kontroll	CD3-APC	1 x 10 6	50 | il
   4.scc-Alexa 488	kontroll	CD8-Alexa 488	1 x 10 6	50 | il
   5. Cellsortering	analyt	CD45-Pacific Blue EpCAM-APC CDR2-Alexa 488	10 x 10 6 - 50 x 10 6	500 | il 10 x 10 6 celler/100 pl

   CD11c + MDC frekvenser, cell utbyten och renheter av olika givare
   Donator	Ålder	Vävnadsvikt	Totalt antal celler per prov	LDF-celler per prov	CD11c+%	CD11c + isolerat per prov	CD11c + renhet
   1	5 dagar	7 g	1,45 x 10 9	9,5 x10 7	12,6	2,4 x 10 6	89%
   2	3 år	15 g	2 x 10 9	6,5 x10 7	4,3	1,9 x 10 6	81%
   3	21 dagar	9 g	2,6 x 10 9	22 x10 7	10,3	3,6 x 10 6	93%
   4	6 år	13 g	1,4 x 10 9	25,4 x10 7	4,2	5,7 x 10 6	82%
   5	5 dagar	6,5 g	1,3 x 10 9	16,2 x10 7	6	2,9 x 10 6	91%
   6	39 dagar	3 g	0,6 x 10 9	8 x 10 7	3,4	1,3 x 10 6	80%

   Tabell 1. Antalet totala enkelcellsuspension cellerna släppts efter två rundor av matsmältning såväl som utbytena av LDF-celler efter Percoll separation visas för isoleringar som utförs i tymus prover av sex personer i olika åldrar och vävnadsvikt. Frekvenserna för MDC bestämdes genom flödescytometri baserad på CD11c expression i totala LDF-celler (APC berikad). Utbyte och renhet av CD11c ⁺ celler efter magnetisk pärla separation visas för varje enskild donator.

Discussion

Protokollet som beskrivs här är en modifiering av det protokoll som publicerats av Gotter et al ^4. Kritiska steg i protokollet är de tillstånd och initial beredning av vävnaden samt Percoll densitetsseparation. Vi rekommenderar starkt att behandla vävnaden så snart som möjligt efter provtagningen. Det är viktigt att arbeta snabbt men noggrant vid rengöring och skär vävnaden. Under tymocyt tvätta beskrivs i steg 2,3, är det viktigt att hitta rätt balans vid tillämpning tryck med baksidan av kolven på vävnadsbitar som alltför kraftig och långvarig tryck kan skada stromaceller. Skiktning mediet ovanpå Percoll lösning / cellsuspension utan att orsaka störningar kan också kräva lite övning. Efter centrifugering är det viktigt att samla alla lågdensitetsfraktionen cellerna så snabbt som möjligt från Percoll-skikt med en minimal mängd av Percoll-lösning.

Dentotala cellutbyten och relativa APC nummer kan vara mycket varierande (se tabell 1) och beror på givaren (i synnerhet med avseende på ålder) och de förberedande kunskaper i försöks. För en kort översikt kan cellsuspensioner färgas med HLA-DR och / eller andra markörer efter olika steg i protokollet som önskat. Alla antikroppar som används för fenotypisk analys bör titreras för att uppnå optimala resultat.

På grund av den relativt låga förekomsten av APC-typer i tymus jämfört thymoctyes, kanske större bitar av tymus krävas om högre antal isolerade celler önskas.

Om en vävnads dissociator finns i labbet, kommer detta avsevärt påskynda vävnadsbehandling, men båda alternativen som beskrivs här fungerar lika bra. Ett relativt vanligt problem kan vara hopklumpning av cellerna, speciellt under stegen mellan Percoll separation och MACS / FACS sortering. I det här fallet, en kort DNas jag gräverestion såsom beskrivs i protokollet kommer vanligtvis att lösa problemet. Eftersom bräss vävnad successivt ersätts av fettvävnaden under åldrandet, Thymi från äldre donatorer kan innehålla lite fett, som kommer att simma på toppen av röret efter centrifugering av enskilda cellsuspensioner erhållna från de olika rötningssteg. I ett sådant fall, bör fett tas bort med en pipett innan det fortsätter protokollet. För optimala resultat samt ekonomiska skäl vi råd att titrera inte bara antikroppar utan även anti-PE mikrokulor (avsnitten 5 och 6). För isolering av TEC från mus bräss, har alternativa enzymblandningar beskrivits att förbättra TEC avkastning ^8,13, men vi har inte testat dem med mänsklig vävnad.

I princip kan andra tymiska APC och stromala celler såsom B-celler och pDC också isoleras från de LDF-celler (efter kollagenas / DNas matsmältning och Percoll) genom FACS / MACS sorterings Om de respektive markörer är känd. Till exempel för PDC BDCA-2, BDCA-4 och CD123 har beskrivits som markörer ^6,14. Om analysen eller isolering av tymocyt delmängder önskas, rekommenderar vi att du använder cellerna frigörs genom att klämma (steg 2,3), eftersom de är ganska ren och har genomgått minimal manipulation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
RPMI 1640	PAA	E15-842
Dulbecco's PBS	PAA	H15-002
Fetal Bovine Serum-Gold	PAA	A15-151
Bovine Serum Albumin	PAA	K41-001
Collagenase A	Roche	10 103 586 001
DNase I, grade II bovine pancreatic	Roche	10 104 159 001
Trypsin-EDTA 10x in PBS	PAA	L11-001	stock conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit	Molecular Probes	A-10235
anti-human CDR2 (purified)	Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany		labeled with Alexa Fluor 488
anti-human CD45 (Pacific Blue)	Biolegend	304022
anti-human EpCAM (APC)	Miltenyi Biotec	130-091-254
anti-human CD11c (PE)	Miltenyi Biotec	130-092-411
anti-PE Microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
anti-CD45 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-801
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	for tissue dissociator
Percoll (density 1.130 g/ml)	GE Healthcare, Life Sciences	17-0891-01
Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)	GIBCO	10977-035
Gamunex 10%	Tajecris-Biotherapeutics	G120052	1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells
0.22 μm filter	Millex GS	SLGS033SS	Syringe driven
Stericup filter unit	Millipore	SCGPU05RE	Pump driven
50 ml PC oak ridge centrifuge tubes	Nalgene	3118-0050	50 ml
50 ml PP conical tubes	Becton Dickinson	352070
12 mm x 75 mm 5 ml test tubes	Becton Dickinson	352058	FACS stainings
Cell strainer 70 μm	Becton Dickinson	352350
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)	Becton Dickinson
Sorvall Evolution R6 (rotor)	Kendro
Rotator REAX 2	Heidolph
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093 235	tissue dissociator