Artículo de método

De Alto Rendimiento Fluorometric Medición de Potencial del Suelo extracelulares enzimáticos Actividades

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DOI:

10.3791/50961

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15 de noviembre de 2013

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1Natural Resource Ecology Laboratory, Colorado State University, 2Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 3Department of Bioengineering, University of Colorado

En este artículo

Resumen

Para medir las tasas potenciales de la actividad de las enzimas extracelulares del suelo, se añaden sustratos sintéticos que se unen a un tinte fluorescente para las muestras de suelo. La actividad enzimática se mide como el colorante fluorescente se libera del sustrato por una reacción catalizada por la enzima, donde mayor fluorescencia indica más degradación del sustrato.

Resumen

Los microbios en suelos y otros entornos producen enzimas extracelulares despolimerizar y hidrolizar macromoléculas orgánicas para que puedan ser asimilados por la energía y los nutrientes. Medición de la actividad enzimática microbiana del suelo es crucial para entender la dinámica de los ecosistemas funcionales del suelo. El concepto general de la enzima de ensayo de fluorescencia es que sintético C-, N-, o sustratos de P-rica unidos con un tinte fluorescente se añaden a las muestras de suelo. Cuando intacta, los sustratos marcados no son fluorescentes. La actividad enzimática se mide como el aumento en la fluorescencia como los colorantes fluorescentes se separan de sus substratos, lo que permite una fluorescencia. Mediciones de enzimas se pueden expresar en unidades de molaridad o actividad. Para realizar este ensayo, suelos fangosos se preparan mediante la combinación de suelo con un tampón de pH. El tampón de pH (típicamente un acetato de sodio 50 mM o 50 mM de tampón de Tris), se elige para la constante del tampón particular ácido de disociación (pKa) para adaptarse mejor a la SA suelopH mple. Los suelos fangosos se inoculan con una cantidad no limitante de marcado con fluorescencia (es decir, C-, N-, o P-rica) sustrato. Uso de suelos fangosos en el ensayo sirve para reducir al mínimo las limitaciones de enzima y sustrato de difusión. Por lo tanto, este ensayo para los controles de las diferencias en la limitación de sustrato, las velocidades de difusión, y condiciones de pH del suelo; detectando así posibles tasas de actividad enzimática como una función de la diferencia de concentraciones de la enzima (por muestra).

Ensayos enzimáticos Fluorescencia suelen ser más sensibles que los (es decir colorimétricos) ensayos espectrofotométricos, pero pueden sufrir interferencias causadas por las impurezas y la inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz, por lo que se requiere precaución al manipular sustratos fluorescentes. Del mismo modo, este método sólo evalúa actividades enzimáticas potenciales bajo condiciones de laboratorio cuando los sustratos no son limitantes. Se debe tener precaución al interpretar los datos que representa la cruz-sitio comparaciones con diferentes temperaturas y tipos de suelo, como in situ el tipo de suelo y la temperatura pueden influir en la cinética enzimática.

Introducción

Enzimas extracelulares (EEE) producidos por las bacterias del suelo, hongos y arqueas están involucrados en los procesos biogeoquímicos innumerables, y son fundamentales para la transformación, estabilización y desestabilización de la materia orgánica del suelo y el ciclo de nutrientes en los ecosistemas terrestres 1. Mediante la producción de EE, los microbios del suelo descomponen y transforman la materia orgánica polimérica en moléculas solubles más pequeños, liberando de ese modo consolidados anteriormente micro y macronutrientes, lo que permite a las plantas y los microbios para asimilar los nutrientes disponibles en el suelo. EEs se han estudiado durante décadas, principalmente mediante la medición de sus actividades en ensayos de laboratorio 2-4, ya que es muy difícil de detectar y cuantificar directamente las enzimas.

Actividad de la enzima extracelular (EEE) está más fuertemente controlada por la concentración de enzimas y sustratos correspondientes. La abundancia de diferentes C-, N-, y P-enzimas de degradación en suelos es controlado por numerosos factores including biomasa microbiana, composición de la comunidad, la disponibilidad de sustrato, el microclima, y las demandas estequiométricas 5,6. Sin embargo, en los EEA situ dentro del ambiente del suelo también se ven afectados por la temperatura 7,8, la unión de las enzimas a las arcillas del suelo y propiedades húmicos 2, y las limitaciones de difusión 9, que en última instancia regulan la piscina enzima activa, en términos de tamaño, la disponibilidad de sustrato y tasas de rotación de 10 a 12. Por lo tanto, el reconocimiento de las condiciones del suelo in situ es fundamental cuando se utilizan ensayos enzimáticos de laboratorio para interpretar la función microbiana del suelo a través de diferentes sitios ambientales.

Muchas clases diferentes de EEE se pueden cuantificar en ensayos de laboratorio utilizando una variedad de sustratos sintéticos (por favor, consulte la sección "Lista de Reactivos Table" para más detalles). Algunos protocolos utilizan sustratos en ensayos que se acoplan a una reacción colorimétrica que se puede detectar con un espectrofotómetro, Wientras que otros, incluido el protocolo como se describe aquí, utilizan sustratos que se unen a un resto fluorescente. Ensayos de EE fluorescencia son típicamente más sensibles (por un orden de magnitud) que los ensayos colorimétricos (que utilizar un resto cromogénico ligado con un sustrato sintético) 12-14. La sensibilidad en la detección del EEE incluye dos aspectos: uno está relacionado con la cantidad del compuesto de interés detectados y el otro relacionado con la actividad de la enzima potencial detectable más bajo. Métodos para colorimétrico P-nitrofenol ensayos (PNP) con sede en se pueden encontrar en las obras del pasado 15,16. En breve, el suelo (típicamente tamizada a <2 mm y se seca al aire) se incuba a la temperatura óptima y o-campo relevante de pH. La velocidad a la que el producto de reacción liberada se determina colorimétricamente con un espectrofotómetro 14. La mayor sensibilidad de los ensayos enzimáticos de fluorescencia se debe en parte a la detección más sensible de la separación resto fluorogénico asociado con substrcomió la degradación en lugar de absorbancia grabación después de la separación de un resto cromogénico específico a una longitud de onda específica. Los dos indicadores fluorescentes sintéticos más utilizados son 4-metilumbeliferona (MUB) 17 y 7-amino-4-metil-cumarina (MUC) 18,19. Sustratos MUC vinculados son comúnmente asociados con la N-ricos sustratos sintéticos tales como proteínas y / o aminoácidos. Técnicas fluorescentes se desarrollaron por primera vez para las muestras acuáticas 20,21, y su aplicación a los suelos requiere controles para el enfriamiento de la señal y la interferencia 22,23. Ensayos Puede llevarse a cabo utilizando la química tradicional "de sobremesa", con grandes volúmenes, o puede ser empleado en protocolos basado en una microplaca, con un mayor rendimiento, pero posiblemente el error más alto de medición. Si bien hay varios protocolos ampliamente citados para la detección fluorescente de los EEA en los suelos 24, muchos laboratorios emplean variaciones sutiles en estos protocolos, a menudo sin darse cuenta, o debido a la diferencias en el equipo de laboratorio o reactivos. Aparentemente pequeñas diferencias en los detalles de los protocolos fuertemente pueden afectar medido EEA 25,26 y la falta de enzimas estandarizados hace que sea difícil para calibrar ensayos entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, existe una necesidad importante para la difusión de protocolos detallados para fomentar la normalización de los análisis del EEE.

En nuestro protocolo, muestras de suelo se preparan mediante la combinación de muestras de suelo con un tampón de pH y homogeneizando con un mezclador. Las suspensiones se inoculan a continuación con una cantidad no limitante de marcado fluorescentemente C-, N-, o sustrato de la P-rico, elegido en función de la pregunta específica de investigación de interés. Uso de suelos fangosos en los ensayos de la enzima sirve como un control para reducir al mínimo las limitaciones de difusión sustrato. Los restos fluorescentes se enfriaron rápidamente hasta que se escinden de sus respectivos sustratos, y por lo tanto la actividad de la enzima se pueden detectar como el colorante fluorescente se libera del sustrato BY una reacción catalizada por la enzima. El aumento de la intensidad de fluorescencia a través del tiempo refleja la velocidad de la reacción catalizada por la enzima.

El concepto general de la enzima de ensayo de fluorescencia es que los sustratos sintéticos unidos con un resto fluorogénico (tinte fluorescente), se añaden a las muestras de suelo 27. Durante la degradación de sustrato catalizada por la enzima, el enlace se rompe entre el colorante fluorescente y el sustrato. El colorante fluorescente liberado del sustrato se utiliza en consecuencia como una evaluación indirecta de la actividad enzimática, y se puede cuantificar usando un lector de microplacas para detectar la intensidad de la fluorescencia del colorante. En resumen, la cuantificación de la fluorescencia se logra cuando el tinte liberado emite luz de una longitud de onda después de absorber la luz de una longitud de onda diferente. La intensidad de fluorescencia se registra por un lector de placas capaz tanto de excitación y de detección. La actividad enzimática puede ser cuantificado posteriormente en base al conocido conce fluorescente-dyentrations del sustrato (es decir, cantidades conocidas de sustrato sintético añaden a muestras de suelo) junto con referencia a una curva de dilución estándar de las intensidades de fluorescencia para el resto fluorogénico específico del sustrato usada en el ensayo (es decir, 4-metilumbeliferona (MUB) o 7-amino -4-metil-cumarina (MUC)). (Por favor refiérase a la sección de protocolo para detalles específicos sobre la actividad enzimática de la cuantificación).

Ensayos de enzimas del suelo Laboratorio son útiles para evaluar la función de la comunidad microbiana, pero hay varias limitaciones técnicas que los usuarios deben reconocer 10. Ensayos de fluorescencia pueden sufrir interferencias causadas por impurezas y / o inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz, por lo que debe tener cuidado al manipular sustratos fluorescentes 25. Partículas de suelo y / o material orgánico en los suelos fangosos también pueden interferir con la intensidad de fluorescencia, conocido como el efecto de extinción 26.Por otra parte, los ensayos enzimáticos de laboratorio sólo evalúa a los EEA potenciales en condiciones de laboratorio. Ensayos in vitro miden los EEA en condiciones donde la difusión del sustrato y la abundancia se limitantes. Por lo tanto, los datos aportados por estos ensayos pueden no ser un buen indicador de la EEA en virtud de las condiciones del suelo in situ 10. En general, la actividad enzimática es muy útil para comparaciones relativas en las que los tipos de suelo son similares. Sin embargo, cuando se utiliza este método para comparar las actividades de los suelos que difieren en sus propiedades físicas o químicas, debe utilizarse precaución. Esto es debido al hecho de que las diferencias en el tipo de suelo y la temperatura pueden alterar drásticamente el estado de en la cinética de enzimas in situ. Otra limitación es que relativamente pocos sustratos están disponibles comercialmente (en comparación con el medio ambiente natural). Además, los sustratos sintéticos utilizados para los ensayos de enzimas son relativamente simples (fácilmente soluble) puede no representar con precisión los sustratos de suelo presentes o dise in situ. Otro factor a considerar es que el uso de suelos fangosos incorporará la actividad de algunas enzimas estabilizadas (es decir, inmovilizados por la materia orgánica o arcillas) que pueden no ser activo en condiciones in situ 2. Ensayos enzimáticos Laboratorio también no proporcionan información sobre la persistencia de las enzimas en el suelo (las tasas de rotación de la enzima) o información sobre las especies de microbios específicos que están produciendo las enzimas del suelo.

Protocolo

1. Ensayo Set-up

  1. Label 3 placas de pocillos profundos: "muestra", "MUB estándar" y "estándar MUC".
  2. Verter cada estándar (MUB de 0, 2,5, 5, 10, 25, 50, y 100 mM) y el sustrato (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) en embalses, premarcan limpias separadas (orientada en filas) .
  3. Pipetear la norma MUB adecuada en pocillos correspondientes de la placa estándar MUB (Tabla 1).
    1. Pipetear 200 l de 0 M MUB en la fila A de la placa estándar MUB.
    2. Pipetear 200 l de 2,5 M MUB en la fila B de la placa estándar MUB.
    3. Pipetear 200 l de 5 M MUB en la fila C de la placa estándar MUB.
    4. Pipetear 200 l de 10 mM MUB en la fila D de la placa estándar MUB.
    5. Pipetear 200 l de 25 mM MUB en la fila E de la placa estándar MUB.
    6. Pipetear 200 l de 50 mM MUB en la fila F de la placa estándar MUB.
    7. Pipetear 200 l de 100 μM MUB en la fila G de la placa estándar MUB.
    8. Repita los pasos 1.3.1 - 1.3.8 de las normas MUC en los correspondientes pocillos de la placa estándar MUC.
  4. Suelos fangosos Prep para cada muestra de suelo.
    1. Pesar 2,75 g de campo de tierra húmeda en la licuadora.
    2. Añadir 91 ml de tampón de 50 mM. Mezclar a temperatura alta durante 1 min.
    3. Vierta el contenido licuadora en un recipiente de vidrio limpio por lo menos tan grande como la pipeta de 8 canales con una barra de agitación.
    4. Colocar sobre una placa de agitación, mezcla lechada suelo en baja.
    5. Pipetear 800 l de suspensión del suelo en la primera columna de la placa de la muestra (Tabla 2).
    6. Repita en 1 ª columna de la norma MUB y placas estándar MUC (Tabla 1).
    7. Enjuague batidora, placa de agitación y revuelo bar con DI H2O o tampón entre las muestras de suelo.
    8. Repita los pasos 1.4.1 - 1.4.7) para cada muestra, para pasar a la siguiente columna con cada muestra posterior suelos (Tablas 1 y2).
  5. Pipetear el sustrato apropiado (en este ejemplo, 200 mM concentraciones) en los correspondientes pocillos de la placa de la muestra (Tabla 2).
    1. Pipetear 200 l de sustrato de BG en la fila A de la placa de la muestra.
    2. Pipetear 200 l de sustrato de CB en la línea B de la placa de la muestra.
    3. Pipetear 200 l de sustrato NAG en la fila C de la placa de la muestra.
    4. Pipetear 200 l de sustrato PHOS en la fila D de la placa de la muestra.
    5. Pipetear 200 l de sustrato XYL en la sección E de la placa de la muestra.
    6. Pipetear 200 l de sustrato AG en la fila F de la placa de la muestra.
    7. Pipetear 200 l de sustrato LAP en la fila G de la placa de la muestra.
    8. Repita los pasos 1.5.1 - 1.5.7 para cada placa muestra la temperatura de incubación.

2. La incubación de las placas de ensayo

  1. Sellar las placas de pozo profundo ("muestra", "estándar MUB" y "estándar MUC4 ;) con esteras de placas.
  2. Invierta cada uno (sellado) placa con la mano hasta que la solución se mezcla a fondo (~ 10 veces).
  3. Colocar las placas en la incubadora apropiada para el período de tiempo de incubación requerido (Tabla 3).
  4. Registre el tiempo inicial Tiempo 0. También registre los tiempos de incubación apropiados para que sepa cuándo debe retirar la placa de la incubadora (Tabla 3).
  5. Al final de cada período de incubación, las placas de centrífuga sellados durante 3 min a ~ 2.900 x g.
  6. Después de la certificación, transferir 250 l de cada pocillo de las placas de pocillos profundos incubadas en los correspondientes pocillos en placas de 96 pocillos de fondo plano negro (una placa de color negro se utilizará para cada placa de pozo profundo se incubó). Es importante para transferir muestras de las placas de pocillos profundos incubadas en los mismos pozos (es decir, A1 ... A12, etc) en las placas de fondo plano de 96 pocillos negros (Tabla 1, 2).

3. Medidas fluorescentes enun fluorómetro de microplacas

  1. Siguiendo las instrucciones del fabricante para el lector de placas fluorométrico utilizado, establecer la longitud de onda de excitación a 365 nm y longitud de onda de emisión de 450 nm (o utilizar filtros adecuados).
  2. Lea las tres placas en el fluorómetro. Importante: Las muestras y placas estándar (es decir MUB o MUC) deben leerse con la misma ganancia.
    1. Ajuste el espectrofotómetro a la ganancia automática y leer las placas MUC y MUB estándar.
    2. Set de ganancia en manual, y reducir el valor de ser óptima al siguiente número más bajo, redondeados a los cinco más cercano, para cada placa estándar. Repita 2x para cada plato.
    3. Ajuste la ganancia en automático y ejecutar la Placa de la muestra. Vuelva a ejecutar la placa de muestra de forma manual para que coincida con la mayor ganancia para cada una de las placas estándar (es decir MUB y MUC).

4. Análisis de Datos

  1. Introduzca datos de la curva de fluorescencia estándar en hoja de cálculo para MUB (Cuadro 4a) Y estándar MUC (Tabla 4b)
    1. Convertir (M) a las concentraciones (mol) (Tablas 4a y 4b).
  2. Para los datos de la curva de fluorescencia estándar de cada muestra, calcular la pendiente, intersección, y R 2 valores para MUB y MUC (mol) concentraciones estándar. Aceptable R 2 valores deben exceder 0,98 para cada muestra (Tablas 4a y 4b). Puede ser útil para visualizar las curvas de calibración en un gráfico de dispersión; con fluorescencia se lee representará gráficamente como la variable dependiente (eje y) y la concentración estándar (mol) trazada como la variable independiente (eje x) (Figura 1).
  3. Usted usará los valores y-intercepción pendiente y curva estándar MUB y MUC para calcular el sustrato datos de fluorescencia cruda muestra + en los EEA potenciales. Primero debe introducir los datos de fluorescencia del sustrato + primas de la muestra en una nueva hoja de cálculo (Cuadro 5a ). También tendrá que introducir el tiempo de incubación (h) y el peso seco del suelo para cada muestra (Tabla 5b). Nota, los tiempos de los valores introducidos en este ejemplo son 3 horas, ya que las muestras se incubaron a 25 ° C (Tabla 3).
    1. Restar los valores de intersección de la curva estándar a partir de los valores de fluorescencia de muestras correspondientes y luego dividir por la pendiente de la curva estándar correspondiente (tabla 5c). Para lograr esto, reorganizar la ecuación de línea estándar para resolver para la concentración de enzima de la muestra (x); x = (YB) / m donde: [Y = fluorescencia de la muestra de lectura en bruto, b = intersección de MUB o curva de MUC estándar; m = pendiente de MUB o MUC curva estándar].
    2. Multiplique muestra mmol, de la etapa 4.3.1, por 91 ml (volumen tampón usado en suspensión de suelo) (Tabla 5d).
    3. Divide el valor obtenido en el paso 4.3.2 por el tiempo de incubación de la muestra específica y masa seca del suelo (Cuadro 5e): [amt enzima. (& #956; mol) x 91 ml x incubación (h) x suelo seco (g) x 0,8 ml x 1000]
      Nota: 0.8 ml es el volumen de estiércol líquido utilizado en cada pocillo, y 1000 corrige por el importe real del suelo en cada pocillo.
    4. Multiplicar el valor obtenido en el paso 4.3.3 por 1000 para obtener las unidades deseadas (actividad nmol / g suelo seco / hr) (Tabla 5f).

Resultados

Los ensayos enzimáticos se pueden utilizar para cuantificar los EEA potenciales y para comparar las actividades entre muestras similares. A continuación, presentamos los resultados representativos de un estudio climático experimental comparando los suelos que han experimentado las condiciones climáticas ambientales (ACN) a los suelos que fueron expuestos a elevadas de CO 2 y los tratamientos de calentamiento (EHN) (Figuras 2-6). La cubierta vegetal en todas las parcelas fueron característicos de una pradera de hierba mixta norteña dominada por la gramínea C4 Bouteloua gracilis (HBK) Lag. y dos C3 hierbas, Hesperostipa comata Trin y Rupr. y Pascopyrum smithii (Rydb.); aproximadamente el 20% de la vegetación se compone de juncias y hierbas. Más información sobre la descripción del sitio y diseño de campo experimental se puede encontrar en las referencias 28-30. Los suelos se obtuvieron de dos profundidades (0-5 cm y 5-15 cm) dentro de cada una de las parcelas de tratamiento utilizando un núcleo 1.5 cm de diámetro para evaluar EEA suelo en respuesta a la alteración del clima condiciones. En nuestros ejemplos (es decir, las Figuras 2-6), el tamaño de la muestra es (N = 3). Independientemente de este tamaño mínimo de la muestra, la variación es relativamente pequeño en la mayoría de los casos (como se demuestra por las barras de error) y refleja con fuerza variabilidad en los EEA potenciales entre las parcelas de tratamiento. Análisis de la varianza (ANOVA) y Tukey post hoc de comparaciones múltiples se utiliza para identificar cambios significativos en la actividad enzimática entre parcelas de tratamiento y las profundidades del suelo.

Los siguientes resultados representativos se han proporcionado para demostrar cómo este alto rendimiento, ensayo fluorométrico puede ser utilizado para probar (1) efectos del EEE general en los suelos, (2) cómo estequiometría EEE puede ser indicativo de los procesos a nivel de ecosistema y (3) la relación entre la temperatura de incubación y el EEE. Suelo EEE de se estudian habitualmente relacionar los cambios en la función microbiana al ciclo de nutrientes del suelo; indicadores útiles para evaluar la demanda de nutrientes microbianos en respuesta al cambio climático, la comunidad de plantas shifts, y más ampliamente el funcionamiento del ecosistema 31-33. Estequiometría AEMA ha sido adoptada más recientemente como un índice para evaluar el ciclo de nutrientes bioquímicos del suelo por la intersección de la teoría estequiométrica ecológica y la teoría metabólica de la ecología para evaluar los posibles desequilibrios de nutrientes microbianos correspondientes a las condiciones ambientales 5. Numerosos estudios han sugerido que las relaciones estequiométricas de ancho son indicativos de las limitaciones de crecimiento de nutrientes 34-36, y como nutrientes del suelo se convierten limitada, microbios responder mediante la asignación de los recursos metabólicos para producir enzimas específicas para adquirir nutrientes deficientes 37. Ecoenzymatic C: N: P relaciones de estequiometría tanto, son útiles para identificar los cambios relativos en el potencial de demandas de nutrientes de la comunidad microbiana en respuesta a diversas perturbaciones ambientales 5. Por último, sensibilidades a la temperatura de los EEA pueden ser útiles para evaluar la diversidad funcional de las comunidades microbianas del suelo es probablemente influenciada por los cambios de temperatura 7,38. Sensibilidades a la temperatura de enzimas pueden variar ampliamente entre los suelos para una sola clase de la enzima, y las comunidades microbianas que producen enzimas han demostrado cambios en la actividad de la enzima que corresponden a cambios en el clima de las condiciones históricas 7. Por lo tanto las preguntas de actividad enzimática relacionadas con la ecología térmica de las EE pueden ser una forma útil de evaluar la dinámica funcional microbianas y procesos de los ecosistemas bajo el suelo en respuesta a los cambios climáticos 39,40.

En este ejemplo, el potencial de C-, las actividades de adquisición de P-enzimas ensayadas en 0-5 profundidades cm del suelo N-, y no difirieron por el tratamiento experimental (Figura 2a). Sin embargo, en profundidades de 5-15 cm del suelo, varios EEA potenciales difirieron significativamente (Figura 2b). Por ejemplo, las enzimas degradadoras de C-β-1 ,4-glucosidasa y β-D-celobiohidrolasa fueron más bajos en las parcelas de EHN (p ≤ 0,038, Figura 2b) en comparación con las parcelas de ACN. El minero N y Palizing enzimas (β-1 ,4-N-acetilglucosaminidasa y fosfatasa, respectivamente) también fueron más bajos en las parcelas EHN (p ≤ 0,012, Figura 2b) en comparación con ACN al 5-15 cm profundidad del suelo.

Cálculo y trazado de la suma de todos los C-, N-, o potenciales EEA P-El ciclismo puede ser un enfoque útil para observar los patrones más amplios sobre posibles actividades de C en el suelo-, N-y / o P-ciclos (Figura 3). En este ejemplo, se calculó la suma de β-1 ,4-glucosidasa, β-D-celobiohidrolasa, β-xilosidasa, y α-1 EEA potenciales ,4-glucosidasa para representar las actividades potenciales C en bicicleta. La suma de β-1 ,4-N-acetilglucosaminidasa y L-leucina aminopeptidasa se calculó para representar las actividades potenciales de N en bicicleta. Fosfatasa fue utilizado para representar las actividades potenciales P ciclismo. En este ejemplo, el potencial de los EEA para el total de C-, N-y P-cycling tendieron más baja en el EHN parcelas en comparación con las parcelas de ACN en las profundidades de 5-15 cm del suelo (Figure 3). Sin embargo, esta tendencia fue significativa sólo para las actividades totales de ciclo de N y P (p ≤ 0,046, figura 3). EEA suelo no difirieron significativamente entre las parcelas de tratamiento en 0-5 profundidades cm del suelo (Figura 3). Los resultados de este ejemplo indican tendencias contrastantes en el grupo funcional de la enzima-actividad (es decir, C-N-, o enzimas que degradan P) entre las parcelas de tratamiento (ACN vs EHN) en respuesta a la profundidad del suelo. Por ejemplo, C-, N-y EEA suelo P-degradantes en las parcelas ambiente (ACN) tendieron a incrementarse a profundidades más bajas en comparación con los suelos expuestos a elevadas de CO 2 y calefacción (EHN), lo que demuestra un patrón inverso (Figura 3a-c ).

Estequiometría de enzima es otro enfoque útil para evaluar las actividades de enzimas potenciales en el medio ambiente (Figura 4). La demanda microbiana por los nutrientes se determina por la estequiometría elemental de la biomasa microbiana en relación con el medio ambientela disponibilidad de nutrientes 32. Del mismo modo, los microbios producen enzimas específicas (es decir, C,-N-, o enzimas P-degradantes) para satisfacer las demandas de nutrientes dentro de sus entornos de suelo, también se hace referencia como estequiometría ecológica 41. La relación de los EEA potenciales es una forma de evaluar demandas de nutrientes microbianos. Por ejemplo, una relación de 1:1 entre dos enzimas grupos funcionales (por ejemplo, en C: N adquisición de nutrientes) sugiere que la demanda de N es alto en relación a la demanda de C cuando se considera la biomasa microbiana de C: N en el ámbito comunitario es típicamente 8:01 42. En este ejemplo, la enzima suelo estequiometría de C: N, C: P, o N: P actividades difieren significativamente entre las parcelas de tratamiento en 0-5 cm de profundidad del suelo (Figuras 4a-c). Sin embargo, el potencial de enzima C: P y N: P fueron mayores en el NHE parcelas en comparación con las parcelas de ACN en las profundidades de 5-15 cm de suelo (p = 0,05; figuras 4b y 4c). Esta observación sugiere que hayes relativamente mayor EEA P mineralización en comparación con el C y N EEE las parcelas de ACN (en comparación con EHN) en las profundidades de 5-15 cm del suelo. Enzima C: N ratios de actividad de adquisición demostraron una tendencia similar a la demostrada por los EEA total de C con alto C: N, debido a mayores potenciales EEA C en las parcelas de ACN en la profundidad más baja en comparación con EHN (Figura 4a).

La temperatura puede influir fuertemente en los EEA suelo. Sin embargo, en los ensayos típicos de laboratorio, las enzimas del suelo se miden a una única temperatura que pueden no corresponder a las condiciones de temperatura in situ. Nuestro método de ensayo de la enzima de fluorescencia nos permite considerar los efectos de la temperatura in situ mediante la incorporación de múltiples temperaturas de incubación en laboratorio para la comparación. El uso de las incubaciones de laboratorio a temperaturas múltiples nos permite analizar la cinética enzimática de datos dependientes de la temperatura usando Arrhenius trama y Q 10 cálculos. Arrhenius parcela se utiliza para visualizar la energía de activación, y se nos trazaing el logaritmo de la actividad enzimática (variable dependiente eje y) como una función de la temperatura inversa convertido a grados Kelvin (1 / K) en el eje x (variable independiente es decir, las Figuras 5a-c). La energía de activación se define comúnmente como la energía mínima requerida para catalizar una reacción química (es decir, degradar un sustrato dado en productos más pequeños). Para nuestros propósitos, la energía de activación sirve como un indicador de la sensibilidad a la temperatura de las reacciones catalizadas por enzimas. Energía de activación mayor indica una sensibilidad a la temperatura de la enzima. Del mismo modo, las energías de activación (es decir, las figuras 5d-f) corresponden directamente a Q 10 valores (es decir, las figuras 6a-c). Una explicación más detallada de las fórmulas utilizadas para calcular la energía de activación y la aplicación práctica se puede encontrar en muchas Trabajos anterior 40,43-45. Gráficas de Arrhenius, la energía de activación, y Q 10 parcelas proporcionan información redundante y no debetodo ser utilizado en el mismo manuscrito para presentar los datos para su publicación (Figuras 5 y 6). Por lo tanto, cuando se utilizan estas técnicas, es necesario elegir el tipo de gráfico más adecuado para su temperatura enzima - cinética de los datos 10. Todos los tipos de gráficos (de Arrhenius y Q 10) se presentan aquí con fines de demostración, para proporcionar ejemplos visuales de la forma de presentar los resultados de la enzima.

En nuestros ejemplos, se evaluó la cinética de enzimas potenciales para potencial C-, N-, y P-EEA entre ambas parcelas de tratamiento en las dos profundidades del suelo (Figura 5, Figura 6). El hallazgo demuestra que la sensibilidad a la temperatura de la EEA no fue significativamente diferente entre las parcelas de tratamiento en cualquiera de las profundidades del suelo para la energía de activación, como se demuestra en los gráficos de Arrhenius (Figuras 5a-c) y energías de activación correspondientes (Figura df) y (como es lógico) para Q 10 ploTS (en este ejemplo entre el 15 ° C y 25 ° C incubaciones de laboratorio; las figuras 6a-c). Esto sugiere que la cinética de enzimas no fueron influenciados por los tratamientos experimentales de campo de este estudio en particular.

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Tabla 1. Diseño de la placa de pozo profundo para las concentraciones estándar de fluorescencia con muestras de suelo. Plantilla de la organización y las normas de carga de fluorescencia (MUB o MUC) con muestras de suelo en la placa de pozos profundos antes de la incubación. Nota: Las columnas representan las mismas muestras de suelo (800 l de adiciones de lodos de suelos). Un gradiente de concentraciones estándar de fluorescencia se carga para cada fila (200 l adiciones). Cada celda representa la concentración estándar de fluorescencia más adiciones de lodos de suelos. Por ejemplo, S1 - S12 representan muestras de suelo (800 l de suspensión de los suelos); MUB 0-100 M = 4-Methylumbelliferone concentraciones (200 l adiciones). En este ejemplo, la fila H está abierto, y es por consiguiente disponibles para incluir una concentración estándar de fluorescencia más alto si es necesario. Esta decisión de aumentar las concentraciones de la curva estándar puede ser necesario para una mayor actividad enzimática potencial (y / o las concentraciones de sustrato utilizado) para sus muestras específicas del suelo. El potencial de la actividad enzimática de las muestras debe estar dentro del rango de los valores de la curva estándar. Haz clic aquí para ver la tabla más grande .

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Tabla 2. Diseño de la placa de pozo profundo para las muestras de suelo con sustrato. Plantilla para la organización y la carga de muestras de suelo y sustratos en la placa de pozos profundos antes de la incubación. Nota: Las columnas representan las mismas muestras de suelo (800 l de modoil adiciones de lodos). Los diferentes sustratos se cargan a través de cada fila (200 l adiciones). Cada celda representa muestras de suelo, además de la adición del sustrato. Por ejemplo, S1 - S12 representan muestras de suelo únicos (800 l de suspensión de los suelos). Sustratos (200 mu l adiciones) incluyen: BG = 4-metilumbeliferil β-D-glucopiranósido; CB = 4-metilumbeliferil β-D-celobiósido; NAG = 4-metilumbeliferil N-acetil-β-D-glucosaminida; PHOS = 4-metilumbeliferil fosfato: XYL = 4-metilumbeliferil-β-D-xilopiranósido, AG = 4-metilumbeliferil α-D-glucopiranósido; y LAP = hidrocloruro de L-Leucina-7-amido-4-metil-cumarina. En este ejemplo, la fila H está abierta, y, en consecuencia, a disposición de incluir otro sustrato para evaluar otra posible actividad enzimática si se desea. Haga clic aquí para ver la tabla más grande .

Temperatura Tiempo
4 ° C ~ 23 hr
15 ° C 6 hr
25 ° C 3 hr
35 ° C 1.5 hr

Tabla 3. Temperaturas Incubadora requerido por períodos de tiempo de incubación correspondiente temperaturas de incubación y los períodos de tiempo correspondientes para el procedimiento de ensayo de enzima..

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Tabla 4. MUB y cálculos de la curva estándar MUC. Demuestra cómo organizar a) MUB y b) los datos de fluorescencia prima MUC (mol) para calcular posteriormente la pendiente, intersección, y los valores de R cuadrado. Para el cálculo de la pendiente, intersección, y los valores de R cuadrado de sus curvas de concentración estándar, seleccione (o parcela) laMUB y / o datos de fluorescencia en bruto MUC como la variable dependiente (eje y) y la concentración estándar (mol) como la variable independiente (eje x). Nota:. MUB = 4-metilumbeliferona; MUC = 7-amino-4-metil-cumarina Haga clic aquí para ver la tabla más grande .

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Tabla 5. . Cálculos actividad enzimática Muestra cómo a) organizar los datos en bruto de fluorescencia de la muestra y, posteriormente, realizar los pasos necesarios (bf) para calcular los EEA en: Actividad mmol / g suelo seco / hr. Nota: S1 - S12 representan muestras únicas de suelo. Los sustratos incluyen: BG = 4-metilumbeliferil β-D-glucopiranósido; CB = 4-metilumbeliferil β-D-celobiósido; NAG = 4-metilumbeliferil N-acetil-β-D-glucosaminida; PHOS = 4-metilumbeliferil phosphate: XYL = 4metilumbeliferil-β-D-xilopiranosido, AG = 4metilumbeliferil α-D-glucopiranósido, y LAP = clorhidrato de L-leucina-7-amido-4-metil-cumarina. Haz clic aquí para ver la tabla más grande .

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Figura 1. MUB parcela curva estándar. Visualización Diagrama de dispersión de las curvas de calibración con los datos de fluorescencia primas como la variable dependiente (eje Y) y la concentración estándar (mol) como la variable independiente (eje x).

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Figura 2. C, N y P actividades enzimáticas ciclismo. EEA potenciales en la calefacción de la pradera y elevadas concentraciones de CO 2 con baño propioenriquecimiento (PHACE) sitio en las parcelas testigo (ACN: expuestas a condiciones climáticas ambientales) y las parcelas de tratamiento (EHN: expuestos a una mayor temperatura y elevadas de CO 2). Enzimas del suelo se ensayaron a una) profundidades 0-5 cm del suelo y b) profundidades de 5-15 cm del suelo. Las barras verticales representan la media ± SE Nota: ACN = ambiente - Parcelas climáticos; EHN = elevadas de CO 2 y solares de calefacción. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3. Total de C, N y P ciclismo enzima relaciones estequiométricas La suma de los EEA potenciales que participan en la adquisición de una) C, b) N, y c) P-para ambos grupos de tratamiento en el experimento de PHACE a 0-5 cm y 5. - profundidades de 15 cm de suelo. Vbares ertical representan la media ± SE Nota: ACN = ambiente - Parcelas climáticos; EHN = elevadas de CO 2 y las parcelas de calefacción. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 4. Estequiometría de enzima para el total de C, N, y la actividad de las enzimas P ciclismo actividad adquisición Enzyme relaciones estequiométricas de la calefacción de la pradera y elevadas concentraciones de CO 2 de Enriquecimiento (PHACE) sitio en las parcelas de control. (ACN: expuestos a las condiciones ambientales climáticas) y las parcelas de tratamiento (EHN: expuesto a un aumento de la temperatura y elevada de CO 2). Total del suelo a) C: N, b) C: P yc) N: P se trazan para ambos grupos de tratamiento a 0-5 cm y 5-15 cm de profundidad del suelo. Las barras verticales representan la media ± SE Nota: ACN= Ambiente - parcelas climáticos; EHN = elevadas de CO 2 y solares de calefacción. Haz click aquí para ver más grande la figura .

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Figura 5. . Total de C, N y P en bicicleta energías de activación de la enzima Sensibilidad a la temperatura de los EEA potenciales muestra mediante gráficas de Arrhenius para el total de a) C, b) N, y c) P enzimas degradantes, así como los correspondientes valores de energía de activación para d total) C , e) N, y f) P enzimas que degradan entre parcelas de tratamiento y la profundidad del suelo de la calefacción de la pradera y elevadas concentraciones de CO 2 de Enriquecimiento () Sitio PHACE. Las barras verticales de energía de activación (es decir, df) representan la media ± SE Nota: ACN = ambient - parcelas climáticos; EHN = elevadas de CO 2 y solares de calefacción. Para la publicación, es importante tener en cuenta que el autor suele optar por presentar cualquiera de gráficas de Arrhenius (es decir, ac) o los valores de energía de activación (es decir, df), pero no tanto en la trama-tipos. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 6. Total de C, N y P ciclismo enzima Q10 sensibilidades (15-25 ° C). Temperatura de potenciales EEA medidos como Q 10, basado en las incubaciones de laboratorio a 15 ° C y 25 ° C para el total de a) C, b) N, y c) P enzimas que degradan entre las parcelas de tratamiento y la profundidad del suelo en la calefacción de la pradera y elevadas concentraciones de CO 2 </ Sub> Enriquecimiento (PHACE) sitio. Las barras verticales de Q10 representan la media ± SE Nota: ACN = ambiente - Parcelas climáticos; EHN = elevadas de CO 2 y solares de calefacción. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Discusión

La medición basada en el laboratorio de potenciales EEA suelo puede proporcionar pistas importantes sobre las respuestas microbianas a su entorno abiótico, así como sus consecuencias para el funcionamiento del ecosistema. Los resultados de este ejemplo conjunto de datos sugieren que existen diferencias mínimas en la actividad enzimática del suelo o la cinética entre las parcelas de tratamiento climático. Sin embargo, las tendencias inversas entre parcelas alentar una mayor investigación de covariables que pueden influir en la producción de los EEA microbianos tales como la humedad del suelo, el pH del suelo o el crecimiento de las plantas. En general, la evaluación de los EEA en términos de (1) a efectos del EEE general en los suelos, (2) la estequiometría del EEE (3) energía gráficas de Arrhenius / activación, y (4) Q 10 proporciona un amplio espectro de enfoques que pueden ser indicativos de procesos a nivel de ecosistema de la que para caracterizar robusta dinámica funcional de los ecosistemas del suelo.

Ensayos EEE basadas en la fluorescencia De alto rendimiento son una herramienta útil que se utiliza ampliamente para examinar posibles EEA en los suelos yotros entornos. Es importante destacar que las posibles actividades reflejan el tamaño del grupo de enzimas, pero no por ellos mismos cuantifican las tasas de producción o sobre las ventas de la enzima 46. Aunque la técnica es relativamente sencilla, las diferencias aparentemente menores entre los protocolos de laboratorio pueden dificultan la comparabilidad de los resultados 13. Por desgracia, actualmente no tenemos controles positivos estandarizados adecuados para SEAE. El uso de las relaciones estequiométricas es uno de los enfoques para superar estos desafíos. De lo contrario, el advenimiento de técnicas de alto rendimiento ha avanzado el estudio de las enzimas en el medio ambiente 4. Interpretación cuidadosa de los datos generados por estos ensayos puede aclarar las tendencias importantes en la actividad microbiana.

La robustez del protocolo se deriva de la capacidad de seleccionar para las condiciones específicas para las muestras individuales, pero esto también puede dar lugar a limitaciones. Se requerirá una serie de modificaciones para garantizar las muestras se miden con precisión para sitios de campo individuales:

Buffer

El tampón se selecciona dependerá del pH del suelo. Buffering también estabiliza la intensidad de fluorescencia de las normas fluorescentes, que es altamente dependiente del pH 27,47. El buffer de pH que normalmente utilizamos para hacer la suspensión del suelo es un acetato de sodio 50 mM o tampón Tris que se elige para el ácido particular, la constante de disociación de la memoria intermedia (pKa) al mejor suelo partido - los niveles de pH de la muestra. El acetato de sodio tiene un pKa de 4,76, y tris tiene un pKa de 8,06 por lo que las cantidades de estos dos tampones variará con el fin de alcanzar el pKa deseado para la muestra individual. Tampón fosfato (pKa = 7,2) ha sido sugerido para suelos neutros / ligeramente básicos. Sin embargo, advertimos que la prueba de la variabilidad analítica en los estudios preliminares antes de usar este buffer, como altas concentraciones de fosfatos pueden interferir con la actividad de la enzima.

Manipulación y almacenamiento de sustratos fluorescentes

jove_content "> ensayos de fluorescencia pueden sufrir interferencias causadas por impurezas y / o inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz, por lo que debe tener cuidado al manipular sustratos fluorescentes. Recomendamos minimizar cualquier exposición a la luz de la etiqueta fluorescente sustratos y MUB y normas MUC . Uso de botellas de vidrio de color ámbar o cubrir el material de vidrio y recipientes que se utilicen para la fabricación y el almacenamiento de los sustratos y las normas fluorescentes es muy recomendable; papel de aluminio para envolver artículos de vidrio y envases funciona bien la misma manera, la inoculación de las placas de manera eficiente y la transferencia a las incubadoras oscuras es la mejor práctica Recomendamos.. almacenamiento de sustratos y normas (-20 ° C) durante un máximo de dos meses (mientras que los protege de la luz), y sustratos de descongelación (5 ° C) ~ 24-48 horas antes de comenzar el ensayo (s) enzima.

Diseño y replicación

Para mejor explicar bien a las variaciones de la muestra, así, implementar negative ensayo controles y se recomienda (si es posible) de ensayo se replica. Variación normalmente se produce debido a las diferencias en la cantidad de partículas de suelo en cada pozo y los errores de pipeteo. Por lo tanto, una fuerte mezcla y buena técnica de pipeteo se minimizar sustancialmente bien a la variación también. Por otra parte, es altamente recomendable la implementación de un control de ensayo negativo (solución tampón sustrato +) para supervisar las incoherencias de sustrato a través del tiempo. Esto se puede controlar fácilmente al leer las placas de enzimas mediante la comparación de los pozos de control negativo (que normalmente utilizamos la última columna en las placas de 96 pocillos). Controles de sustrato negativos son típicamente estables, por lo tanto, la señal aumenta muy por encima del límite de detección, que es indicativo de la contaminación o inestabilidad sustrato, que requiere un reemplazo del sustrato y / o soluciones estándar.

Para maximizar el rendimiento, el protocolo incluye varios EEA potenciales en un solo micro pozo profundo, aunque otros protocolos realizan un tipo deensayo por placa (es decir, un sustrato por placa), ya que diferentes EEA ocurren a un ritmo diferente. Independientemente, la optimización de la enzima se debe realizar en los suelos antes de realizar esta alta en toda aproximación, o el enfoque de la placa única. Sustratos múltiples pueden ser utilizados en una sola placa si las velocidades de reacción son relativamente consistentes para cada enzima dentro del período de tiempo de la incubación.

Nuestro protocolo recomienda ~ 2,75 g de suelo para hacer que la solución en suspensión, mientras que ~ 1 gramo se recomienda en otros protocolos 24. Sugerimos que el uso de más suelo (si es posible) es un método eficaz para mejorar la captura dentro de la muestra la variación del suelo en los niveles de actividad de la enzima. En este protocolo, se incubamos 800 l de suspensión de suelo con 200 l de sustrato, mientras que otros sólo incuban 200 l de suspensión de suelo con 50 l de sustratos. Esto es simplemente una función de ampliación que a la larga no cambia la actividad medida. También hay ventajas prácticaspara el uso de volúmenes más grandes. Uno, es más fácil evitar las partículas del suelo, mientras que el pipeteado en placas de 96 pocillos de fondo plano negro antes de grabar intensidades en el fluorómetro correspondiente. En segundo lugar, el volumen adicional es útil en el caso de derrames accidentales durante la transferencia de las placas negras de 96 pocillos de fondo plano para el fluorómetro antes de grabar intensidades de fluorescencia relacionados con las enzimas. Incluso las pequeñas desviaciones en el volumen se reducirá significativamente la fluorescencia entre pozos. Por último, debido a la naturaleza de alto rendimiento de este protocolo, que comúnmente elegimos confiar en la replicación experimental para representar la variación en los niveles de actividad de la enzima en lugar de realizar el ensayo se replica. Siempre es buena práctica incluir repeticiones analíticas, pero en la práctica, sentimos nuestro protocolo proporciona una compensación equilibrada entre repeticiones analíticas y experimentales dados los recursos limitados. Asimismo, nuestro enfoque utiliza un suelo relativamente más bien homogeneizada (2,75 g) por ensayo 25, que es inherentently disminuye dentro del suelo variaciones. La decisión de utilizar réplicas de análisis debe ser considerado cuidadosamente mediante pruebas de error analítico en estudios preliminares 48. Sin embargo, se recomienda que los diseños experimentales con menos de 4 repeticiones del tratamiento del grupo deberían considerar seriamente el uso de ensayo repeticiones.

Suelos, Volúmenes Buffer, y la optimización de concentración de sustrato

El tampón de suelo: relación de la concentración de sustrato es una variable importante que influye fuertemente en la fluorescencia medida cuando se realizan ensayos de la enzima. La cantidad de suelo en la suspensión añadida a ensayar o la concentración de sustrato puede ser necesario ajustar en función de la actividad de las enzimas en la muestra de suelo. Las cantidades seleccionadas para este ejemplo se basaron en pruebas anteriores de estos suelos para garantizar que la disponibilidad de sustrato fue limitante, y que estábamos midiendo las tasas potenciales máximas bajo las condiciones de ensayo (V max) 44,45. Sin embargo, para muestras de suelo que tienen altas concentraciones de enzimas, la cantidad de suelo o de la concentración de sustrato debe ser aumentada. Hemos encontrado que el aumento de las concentraciones de sustrato (y el ajuste de la curva estándar en consecuencia) puede afectar a la linealidad de la curva. Por lo tanto, se recomienda la reducción de las cantidades de suelo y / o ajustes proporcionales para amortiguar el volumen según sea necesario. No obstante, es importante optimizar la concentración de sustrato para cada tipo de suelo ensayado porque EEA medidos pueden variar en un orden de magnitud mayor entre las concentraciones de sustrato saturado y sub-26 saturados. Por lo tanto, las diferencias entre los tratamientos experimentales (etc.) son susceptibles de tipo II error estadístico y menos probable que se detecten en condiciones sub-saturación, y el error estadístico 27,35. Para optimizar las concentraciones de sustrato, enzima ensayos preliminares deben realizar en muestras de suelo representativas utilizando una amplia gama de concentraciones de sustrato. Despuésel registro de la fluorescencia, simplemente trazar los datos (de manera similar al ejemplo curva estándar; Figura 1) para identificar la concentración de sustrato (eje x) que corresponde a la actividad enzimática (eje y) donde los niveles fuera de pendiente (~ 0). Del mismo modo, la concentración de sustrato que corresponde al punto donde los niveles de pendiente fuera (~ 0) es una buena indicación de la concentración de sustrato óptima para que el suelo en particular.

Este ensayo mide la fluorescencia en última instancia, en un momento dado producido por el resto fluorogénico que se escinde del sustrato como resultado de la despolimerización sustrato mediada por enzima. Por lo tanto, el paso 5 (la adición del sustrato) es crítico y debe llevarse a cabo tan eficientemente como sea posible a fin de minimizar el tiempo entre cuando se añade el sustrato a los suelos y cuando se incuban los ensayos. Del mismo modo, una vez que el sustrato entra en contacto con la muestra, las reacciones enzimáticas empezarán a producirse. Se recomienda utilizar un multi-canalpipetear por esta razón. Se recomienda encarecidamente a ser eficientes con la pipeta multicanal antes del día va a realizar sus ensayos enzimáticos. Para lograr esto, se puede practicar el pipeteo con agua hasta que usted puede transferir fácilmente los volúmenes en las placas de 96 pocillos con su pipeta.

Suelo Quenching

El enfriamiento se refiere a la disminución de la intensidad de fluorescencia causada por partículas y / o materia orgánica en los suelos lodos-incubaciones 26. El enfriamiento se puede influir mediante el ajuste de la tierra: relaciones de amortiguamiento 25. Debido a la fluorescencia de fondo a partir de muestras individuales, es crítico para funcionar con muestras estándares para tener en cuenta para el fondo (enfriamiento rápido) de fluorescencia. Aunque algunos protocolos pueden usar una sola concentración después de la prueba de que la señal es lineal, se recomienda encarecidamente la implementación de un control de enfriamiento estándar para cada muestra para el mejor control de los efectos de la extinción. El no hacerlo resultará en un soportecurva de ARD no aplicable a la muestra, y una estimación incorrecta de la actividad enzimática. La adición de estándares para suelos fangosos no es sensible al tiempo, como la adición estándar no afecta a la fluorescencia de fondo de la muestra.

Además NaOH

La adición de NaOH se utiliza en algunos protocolos para optimizar las mediciones de actividad enzimática fluorométricos porque el colorante fluorescente liberado de los sustratos sintéticos exhibe fluorescencia pico a pH> 9,0 26,49. Al considerar esta sugerencia, la concentración de NaOH necesaria para el pH de la suspensión del suelo (es decir, a pH> 9) variará dependiendo de la particular de suelo y el tampón de pH utilizado 26. Sin embargo, otros argumentan que NaOH puede no ser necesario debido a la intensidad de la señal es en general muy alta, incluso a pH más bajo, y porque introduce una fuente adicional de error de medición. Por ejemplo, el efecto de las adiciones de NaOH en pH de la suspensión y por lo tanto Fluore MUB o MUCcambios scence en el tiempo 25. Sustratos MUB enlaces se han mostrado para demostrar el aumento de la fluorescencia constante durante 20 minutos después de las adiciones de NaOH antes de los niveles de conicidad; mientras MUC ha demostrado constante disminución de la fluorescencia durante un máximo de 60 min 26. Por lo tanto, es importante para estandarizar el tiempo entre NaOH adición y medición de fluorescencia. Alternativamente, si los niveles de fluorescencia son suficientemente detectable sin la adición, la realización de los ensayos sin adición de NaOH ha sido sugerido como una alternativa igualmente aceptables 26.

Temperatura

Sensibilidad a la temperatura debería tenerse en cuenta a la hora de decidir la temperatura de incubación. Si el principal interés es entender la cinética de enzimas, utilizando tres o más temperaturas, como se ilustra mediante los gráficos de Arrhenius (en la sección de resultados) es un enfoque sólido. Si el sitio muestra tiene característicamente baja temperatura, tales como suelos de permafrost, entonces el duration de incubación puede necesitar ser ampliado para permitir a las enzimas para reaccionar en las temperaturas de incubación más fríos. Mientras que la cinética de enzimas tradicionales sugiere que un aumento en la temperatura debe resultar en aumento de la actividad de la enzima, hemos encontrado que las enzimas pueden ser específicos en términos de sensibilidad a la temperatura 50 sitio. Por lo tanto, para comprender la actividad enzimática potencial específica del sitio es muy importante que la temperatura de incubación y la duración se ajustan para reflejar los valores del sitio de campo.

Conclusión

EEs son conductores críticos de los procesos biogeoquímicos en los suelos, y por lo tanto tenemos que ser capaces de medir sus actividades. Hay muchos retos para la medición de los EEA en los suelos, incluyendo la interferencia y la inhibición. A pesar de estos desafíos, los protocolos estandarizados (como el que se describe aquí) se pueden aplicar universalmente para medir EEA para una amplia gama de enzimas. Si bien es bastante fácil para generar datos de calidad siguiendo estos protocolos, el deinterpretación de estos datos en un contexto ecológico requiere una cuidadosa consideración de lo que estos ensayos son realmente midiendo, y cómo los EEA en condiciones de ensayo puede ser diferente a los menores en condiciones in situ.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Esta publicación fue financiada por las enzimas de la Investigación Investigación Red de Coordinación para el Medio Ambiente con el apoyo de la Fundación de Ciencia Nacional de EE.UU. (DEB # 1,021,559). Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias de EE.UU. (DEB # 1021559), y el Departamento de la Oficina de Energía de la Ciencia (Biológica y Ambiental de la Investigación) EE.UU.. Las opiniones, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones de la NSF EE.UU..

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivos:
4-Metilumbeliferil &alfa;-D-glucopiranósido (AG)Sigma AldrichM9766Degradación
de azúcar 4-Metilumbelliferil β-D-glucopiranósido (BG)Sigma AldrichM3633Degradación de azúcar
4-Metilobeliferil β-D-celobiósido (CB)Sigma AldrichM6018celulosa
Clorhidrato de L-leucina-7-amido-4-metilcumarina (LAP)Sigma AldrichL2145Degradación
de proteínas 4-Metilumbelifenil N-acetil-β-D-glucosaminida (NAG)Sigma AldrichM2133Degradación de quitina
4-Metilobeliferil fosfato (PHOS)Sigma AldrichM8883Mineralización
de fósforo4-Metilumbelliferil-β-D-xilopiranósido (XYL)Sigma AldrichM7008Degradación de la hemicelulosa
4-Metilumbeliferona (MUB)Sigma AldrichM1381
7-Amino-4-metilcumarina (MUC)Sigma AldrichA9891
50 mM Tampón anhidro de acetato de sodioFisher ScientificS210-500suelos ácidos y neutros
50 mM Tris tampón de baseFisher ScientificBP154-1suelos básicos
Equipment
Bel-Art Scienceware depósitos de pipeteo desechablesFisher Scientific14-512-65depósito de pipeteo
Electronic; Eppendorf Xplorer; FisherScientific13-684-2658 canales Pipeta de 8 canales, rango: 50-1.200 μ l
TipOne 101-1,250 μ l Puntas naturales de longitud extendidaUSA Scientific1112 - 172010 estantes de 96 puntas (960 puntas)
Placa calefactora; superficie de calentamiento: 10 pulgadas x 10 pulgadas.Fisher Scientific11-100-100SHLab disco de laboratorio placa de agitación magnética
batidorade guerra Fisher Scientific14-509-7PDos velocidades; Recipiente de acero inoxidable de 1 L (34 oz)
Dispensadores de tapa de botella BRAND Dispensette IIIFisher Scientific13-688-231Dispensador; rango: 5-50 ml
Wheaton Unispense μ Bombas peristálticas PFisher Scientific13-683-7Dispensador opcional
Barra agitadora magnéticaFisherbrand Fisher Scientific1451363SIXSe utiliza para remover la lechada del suelo después de mezclarla
Cuencos de vidrio PyrexKitchen5304218Taza de natillas con borde Pyrex de 10 oz
Costar Placas sólidas negras de 96 pocillosFisher Scientific07-200-590Se utiliza para el paso del lector de placas
Bloques de ensayo Costar de 96 pocillosFisher Scientific07-200-700Fondo en V; 2 ml; estériles
Tapetes de tapón Thermo Scientific Nunc de 96 pocillosFisher Scientific14-387-93Alfombrilla estéril de tapón de 96 pocillos para pocillos cuadrados
Centrífuga equipada con soportes para placas de pocillos profundosThermo Scientific3121Centra-GP8 (este modelo ya no está disponible)
Lector de microplacas multifuncional Tecan Infinite serie 200Tecan30016058Lector de placas (este modelo ya no está disponible)
Degradación de la de World

Referencias

  1. Burns, R. G., Dick, R. P. Enzymes in the environment: activity, ecology, and applications. 86, CRC. (2002).
  2. Burns, R. G. Enzyme activity in soil: Location and a possible role in microbial ecology. Soil Biology and Biochemistry. 14 (82), 423-427 (1982).
  3. Bandick, A. K., Dick, R. P. Field management effects on soil enzyme activities. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1471-1479 (1999).
  4. Burns, R. G., et al. Soil enzymes in a changing environment: Current knowledge and future directions. Soil Biology and Biochemistry. 58, 216-234 (2013).
  5. Sinsabaugh, R. L., Hill, B. H., Follstad Shah, J. J. Ecoenzymatic stoichiometry of microbial organic nutrient acquisition in soil and sediment. Nature. 462, 795-798 (2009).
  6. Sinsabaugh, R. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology Letters. 11, 1252-1264 (2008).
  7. Wallenstein, M., Allison, S. D., Ernakovich, J., Steinweg, J. M., Vol Sinsabaugh, R. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 245-258 (2011).
  8. Wallenstein, M. D., McMahon, S. K., Schimel, J. P. Seasonal variation in enzyme activities and temperature sensitivities in Arctic tundra soils. Global Change Biology. 15, 1631-1639 (2009).
  9. Steinweg, J. M., Dukes, J. S., Wallenstein, M. D. Modeling the effects of temperature and moisture on soil enzyme activity: Linking laboratory assays to continuous field data. Soil Biology and Biochemistry. 55, 85-92 (2012).
  10. Wallenstein, M. D., Weintraub, M. N. Emerging tools for measuring and modeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology and Biochemistry. 40, 2098-2106 (2008).
  11. Sinsabaugh, R. L. Phenol oxidase, peroxidase and organic matter dynamics of soil. Soil Biology and Biochemistry. 42, 391-404 (2010).
  12. Allison, S. Soil minerals and humic acids alter enzyme stability: implications for ecosystem processes. Biogeochemistry. 81, 361-373 (2006).
  13. Deng, S., Popova, I. E., Dick, L., Bench Dick, R. scale and microplate format assay of soil enzyme activities using spectroscopic and fluorometric approaches. Applied Soil Ecology. 64, 84-90 (2013).
  14. Sinsabaugh, R., Klug, M. J., Collins, H. P., Yeager, P. E., Peterson, S. O. Standard Soil Methods For Long Term Ecological Research. Robertson, G. P., Coleman, D. C., Bledsoe, C. S., Sollins, P. , Oxford University Press. (1999).
  15. Tabatabai, M. A. Methods of Soil Analysis. Page, A. L., Miller, R. H., Keeney, D. R. 2, American Society of Agronomy, Inc. 903-947 (1994).
  16. Parham, J. A., Detection Deng, S. P. quantification and characterization of B-glucosaminidase activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  17. Jacks, T. J., Kircher, H. W. Fluorometric assay for the hydrolytic activity of lipase using fatty acyl esters of 4-methylumbelliferone. Analytical Biochemistry. 21 (67), 279-285 (1967).
  18. Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis Research. 17 (80), 393-402 (1980).
  19. Jasinski, J. P., Woudenberg, R. C. 7-Amino-4-methylcoumarin. Acta Crystallographica Section C. 50, 1954-1956 (1994).
  20. Hoppe, H. G. SIGNIFICANCE OF EXOENZYMATIC ACTIVITIES IN THE ECOLOGY OF BRACKISH WATER - MEASUREMENTS BY MEANS OF METHYLUMBELLIFERYL-SUBSTRATES. Mar. Ecol.-Prog. Ser. 11, 299-308 (1983).
  21. Somville, M. Measurement and Study of Substrate Specificity of Exoglucosidase Activity in Eutrophic Water. Applied and Environmental Microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  22. Darrah, P. R., Harris, P. J. A fluorimetric method for measuring the activity of soil enzymes. Plant and Soil. 92, 81-88 (1986).
  23. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and Soil. 175, 147-152 (1995).
  24. Saiya-Cork, K. R., Sinsabaugh, R. L., Zak, D. R. The effects of long term nitrogen deposition on extracellular enzyme activity in an Acer saccharum forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 34, 1309-1315 (2002).
  25. DeForest, J. L. The influence of time, storage temperature, and substrate age on potential soil enzyme activity in acidic forest soils using MUB-linked substrates and l-DOPA. Soil Biology and Biochemistry. 41, 1180-1186 (2009).
  26. German, D. P., et al. Optimization of hydrolytic and oxidative enzyme methods for ecosystem studies. Soil Biology and Biochemistry. 43, 1387-1397 (2011).
  27. Marx, M. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil Biology and Biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  28. Parton, W. J., Morgan, J. A., Wang, G., Del Grosso, S. Projected ecosystem impact of the Prairie Heating and CO2 Enrichment experiment. New Phytologist. 174, 823-834 (2007).
  29. Morgan, J., et al. C4 grasses prosper as carbon dioxide eliminates desiccation in warmed semi-arid grassland. Nature. 476, (2011).
  30. Carrillo, Y., Pendall, E., Dijkstra, F. A., Morgan, J. A., Newcomb, J. M. Response of soil organic matter pools to elevated CO2 and warming in a semi-arid grassland. Plant and Soil. , (2011).
  31. Allison, S. D., Vitousek, P. M. Responses of extracellular enzymes to simple and complex nutrient inputs. Soil Biology and Biochemistry. 37, 937-944 (2005).
  32. Moorhead, D. L., Sinsabaugh, R. L. A theoretical model of litter decay and microbial interaction. Ecological Monographs. 76, 151(2006).
  33. Allison, S. D., Weintraub, M. N., Gartner, T. B., Waldrop, M. P. Soil Biology. Shukla, G., Varma, A. 22, Springer. Berlin Heidelberg. 229-243 (2011).
  34. Treseder, K. K., Vitousek, P. M. Effects of soil nutrient availability on investment in acquisition of N and P in Hawaiin rain forests. Ecology. 82 (2001), 946-954 (2001).
  35. Fujita, Y., de Ruiter, P., Wassen, M., Heil, G. Time-dependent, species-specific effects of N:P stoichiometry on grassland plant growth. Plant and Soil. 334, 99-112 (2010).
  36. Elser, J. J., Dobberfuhl, D. R., MacKay, N. A., Schampel, J. H. Organism Size, Life History, and N:P Stoichiometry. BioScience. 46, 674-684 (1996).
  37. Allison, V. J., Condron, L. M., Peltzer, D. A., Richardson, S. J., Turner, B. L. Changes in enzyme activities and soil microbial community composition along carbon and nutrient gradients at the Franz Josef chronosequence, New Zealand. Soil Biology and Biochemistry. 39, 1770-1781 (2007).
  38. German, D. P., Marcelo, K. R. B., Stone, M. M., Allison, S. D. The Michaelis - Menten kinetics of soil extracellular enzymes in response to temperature: a cross-latitudinal study. Global Change Biology. 18, 1468-1479 (2012).
  39. German, D. P., Chacon, S. S., Allison, S. D. Substrate concentration and enzyme allocation can affect rates of microbial decomposition. Ecology. 92, 1471-1480 (2011).
  40. Fierer, N., Craine, J. M., McLauchlan, K., Schimel, J. P. Liter quality and the temperature sensitivity of decomposition. Ecology. 86, 320-326 (2005).
  41. Sterner, R. W., Elser, J. J. Ch. 5. Ecological Stoichiometry: The Biology of Elements from Molecules to the Biosphere. Sterner, R. W., Elser, J. J. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 179-230 (2002).
  42. Cleveland, C., Liptzin, D. C:N:P stoichiometry in soil: is there a "Redfield ratio" for the microbial biomass. Biogeochemistry. 85, 235-252 (2007).
  43. Logan, S. R. The origin and status of the Arrhenius equation. Journal of Chemical Education. 59, 279(1982).
  44. Trasar-Cepeda, C., Gil-Sotres, F., Leirós, M. C. Thermodynamic parameters of enzymes in grassland soils from Galicia, NW Spain. Soil Biology and Biochemistry. 39, 311-319 (2007).
  45. Menten, L., Michaelis, M. Die kinetik der invertinwirkung. Biochem Z. 49, 333-369 (1913).
  46. Wallenstein, M. D., Haddix, M. L., Lee, D. D., Conant, R. T., Paul, E. A. A litter-slurry technique elucidates the key role of enzyme production and microbial dynamics in temperature sensitivity of organic matter decomposition. Soil Biology and Biochemistry. 47, 18-26 (2012).
  47. Chrost, J. Fluorescence correction for measurements of enzyme activity in natural waters using methylumbelliferyl-substrates. Archiv für Hydrobiologie. 106, 79(1986).
  48. Reed, G. F., Lynn, F., Meade, B. D. Use of Coefficient of Variation in Assessing Variability of Quantitative Assays. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9, 1235-1239 (2002).
  49. Mead, J. A. R., Smith, J. N., Williams, R. T. Studies in detoxification. 67. Biosynthesis of the glucuronides of umbelliferone and 4- Methylumbelliferone and their use in fluorimetric determination of b-glucuronidase. Biochemical Journal. 61, 569-574 (1955).
  50. Haddix, M. L., et al. The Role of Soil Characteristics on Temperature Sensitivity of Soil Organic. Matter. Soil Sci. Soc. Am. J. 75, 56-68 (2011).

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