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DOI:

10.3791/50964

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22 de noviembre de 2013

 ,  ,  , 
1Center for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London

En este artículo

Resumen

La larva de la polilla de la cera Galleria mellonella se creó recientemente como un modelo in vivo para estudiar la infección por Legionella pneumophila. Este sentido, demostrar las técnicas fundamentales para caracterizar la patogénesis de la Legionella en las larvas, incluyendo la inoculación, la medición de la virulencia bacteriana y la replicación, así como la extracción y el análisis de hemocitos infectados.

Resumen

Legionella pneumophila, el agente causante de una neumonía grave llamado enfermedad de los legionarios, es un importante patógeno humano que infecta y se replica dentro de los macrófagos alveolares. Su virulencia depende del sistema de punto / ICM de secreción de tipo IV (T4SS), que es esencial para establecer una vacuola permisiva de replicación conocido como la Legionella contiene vacuolas (LCV). L. infección pneumophila puede modelarse en ratones, sin embargo la mayoría de las cepas de ratones no son permisivas, lo que lleva a la búsqueda de nuevos modelos de infección. Recientemente hemos demostrado que las larvas de la polilla de la cera Galleria mellonella son adecuados para la investigación de L. infección pneumophila. G. mellonella se utiliza cada vez más como un modelo de infección por patógenos humanos y existe una buena correlación entre la virulencia de varias especies bacterianas en el insecto y en modelos de mamíferos. Un componente clave de las defensas inmunológicas de las larvas son hemocitos, profesióncol fagocitos, que ocupan y destruyen invasores. L. pneumophila es capaz de infectar, formar un LCV y replicarse dentro de estas células. Aquí demostramos protocolos para el análisis de L. virulencia pneumophila en la G. modelo mellonella, incluyendo cómo hacer crecer infecciosa L. pneumophila, pretratar las larvas con inhibidores, infectan a las larvas y cómo extraer las células infectadas para la cuantificación y la microscopía de inmunofluorescencia. También describe la forma de cuantificar la replicación bacteriana y la aptitud en ensayos de competición. Estos enfoques permiten la detección rápida de mutantes para determinar los factores importantes en L. virulencia pneumophila, que describe una nueva herramienta para ayudar a la comprensión de este patógeno complejo.

Introducción

Los modelos animales de infección han demostrado ser muy valiosa en la determinación de los factores de virulencia bacteriana. Sin embargo, los modelos de invertebrados han ganado una mayor atención como una alternativa viable a los modelos de mamíferos tradicionales de la infección. Las larvas de la polilla de la cera, Galleria mellonella se utiliza cada vez más para estudiar una serie de importantes patógenos humanos, incluyendo las bacterias Gram-positivas y Gram-1 negativas 2,3 y varios hongos patógenos 4,5. El uso de un modelo de insectos tiene un número de ventajas sobre los modelos de mamíferos tradicionales, como un invertebrado, G. mellonella no está sujeta a las limitaciones éticas de los modelos de mamíferos. Además, las larvas pueden mantenerse fácilmente, infectado por inyección sin anestesia, se someten a un tratamiento previo con inhibidores químicos 6 y sostener la incubación a 37 ° C 7. Curiosamente, una buena correlación entre la patogenicidad de varios microorganismos en G. mellonella y modelos de mamíferos de la infección se ha establecido 2,8. El aumento de la comprensión del sistema inmune de G. mellonella también ha ayudado en la caracterización de este organismo modelo. Aunque los insectos no tienen un sistema inmune adaptativo como se encuentra en los mamíferos, tienen defensas celulares y humeral sofisticadas que incluyen la producción de péptidos antimicrobianos 9. Hemocitos son el principal mediador de las defensas celulares y son los más numerosos tipo de célula que se encuentra en la hemolinfa (o sangre) de G. mellonella 10, estas células son fagocitos profesionales y realizan funciones similares a los macrófagos y neutrófilos humanos por tanto de tomar y degradar las bacterias en un compartimento lisosomal 10,11-fago y la formación de nódulos alrededor de las bacterias invasoras, restringir físicamente la replicación bacteriana 12.

Legionella pneumophila es un patógeno respiratorio que causa neumonitis severaun (enfermedad del legionario) en poblaciones susceptibles, como los ancianos o inmunocomprometidos 13. Legionella se encuentra por doquier en las fuentes de agua tanto en el medio ambiente y el hombre, en los que es un patógeno de varias especies de amebas de agua dulce 14,15. Legionella sobrevive y replica dentro de estos fagocitos profesionales mediante la utilización de un complejo multi-proteína conocida como el Punto / ICM (defectuoso en el tráfico de orgánulos multiplicación / intracelular) tipo 4 sistema de secreción (T4SS) para trasladar más de 275 proteínas efectoras en la célula huésped 16-20. Estas proteínas sirven para subvertir las vías normales fagocíticas célula huésped, que conduce a la creación de la Legionella contiene vacuolas (LCV). El LCV evita la fusión con los lisosomas y en su lugar recluta retículo endoplasmático (ER) vesículas deriva-, lo que resulta en un compartimento especializado que se asemeja a la RE rugoso 21,22. L. pneumophila es considerado un camino humano accidentalplasminógeno; las mismas estrategias que le permiten replicarse dentro de las amebas, también permiten la replicación en macrófagos alveolares humanos 23.

Hosts de mamíferos se han caracterizado como modelos para la infección por Legionella humana como ratones y cobayas 24,25. Sin embargo, la mayoría de las cepas de ratón son resistentes a la infección por Legionella 26 con la excepción de la endogámica albino Un / J de ratón, que desarrolla una auto-limitación de la infección leve, 24. Aunque el modelo de conejillo de indias se asemeja más a la enfermedad humana 25, la falta de mutantes y el aumento de costo desalienta su uso 27. Además, varios modelos de invertebrados se han desarrollado para la infección por Legionella pneumophila incluyendo Caenorhabditis elegans 28, Drosophila melanogaster 29 y varias especies de amebas 30-32. Sin embargo, estos modelos tienen puntos débiles, la virulencia en el C. elegans Sistema no es Dot / ICM-dependiente 28, lo que limita la utilidad de este modelo. El modelo de Drosophila se ha demostrado su eficacia en la investigación de los factores de virulencia bacteriana 29 y parece ser prometedor, sin embargo, este modelo no se ha caracterizado completamente. Amebas unicelulares son los anfitriones ambientales de L. pneumophila y son ideales para la investigación de la acción de factores de virulencia a nivel molecular 33 sin embargo carecen de varios importantes mediadores de la respuesta de las células huésped de mamífero a la infección, como las caspasas 34. Las debilidades de los modelos existentes, junto con el alto costo y las preocupaciones éticas relacionadas con la experimentación de los mamíferos, ha llevado a la búsqueda de otros organismos modelo adecuados 29,35.

Recientemente hemos demostrado que G. mellonella es un modelo adecuado para L. pneumophila patogenia 36,37. Este protocolo detalla las técnicas experimentales utilizadas para infectaring G. larvas mellonella, analizar la moralidad de las larvas, la extracción de hemocitos para el recuento y la inmunofluorescencia y la determinación de la replicación por viable CFU cuenta de larvas infectadas.

Protocolo

1. Preparación de L. pneumophila para la infección

  1. Preparar carbón extracto de levadura placas (CYE) (carbón de leña 2 g / L de activado, extracto de 10 g / L de levadura, 13 g / L de agar, 10 g / l de N-(2-acetamido)-2-aminothanesulfonic ácido (ACES), 1 g / L de α-cetoglutarato, 0,4 g / l de L-cisteína HCl y 0,25 g / l de pirofosfato férrico, pH 6,9).
    Nota: Si es necesario, añadir a la kanamicina (25 mg / ml) y / o cloranfenicol (6 g / ml) a placas de CYE.
    1. Llevar a cabo todas L. trabajo pneumophila a nivel de contención de bioseguridad 2 (BSL-2) en una cabina de seguridad microbiológica (MSC) en el cumplimiento de las normas locales.
  2. Racha de L. pneumophila desde -80 ° C stocks de glicerol sobre las placas CYE
  3. Incubar las placas durante 4 días a 37 ° C.
    Nota: La incubación de las placas durante 4 días aumenta significativamente la virulencia de L. pneumophila en G. mellonella sobre la incubación durante 3 días.
  4. Un día antes de la infección, resuspender una fu buclell de bacterias (que contiene varias colonias) en 1 ml de precalentado (37 ° C) ACES extracto de levadura (AYE) caldo y medir la absorbancia a 600 nm (DO 600) usando un espectrofotómetro.
  5. Inocular un cultivo de 3 ml AYE fresca (con antibióticos si es necesario) a una DO600 final de 0,1.
    1. Incluya un medio de comunicación sólo controlar para garantizar la esterilidad de los medios de comunicación.
  6. Incubar a 37 ° C en una incubadora de agitación a 200 rpm durante 21 horas.
    Nota: Las bacterias se cultivan hasta la fase post-exponencial de la infección 38. Crecimiento durante 21 horas permite a los experimentos para ser estandarizados.
    Nota: Si es necesario para la inducción de proteínas, añadir 0,5 mM isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante la noche.
  7. Mida el diámetro exterior 600 (bacterias deben estar en fase de crecimiento post-exponencial, OD 600 2,5-3).
  8. Diluir cultivo bacteriano para dar 1 x 10 9 UFC / ml en solución salina estéril tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS).
    Nota: En base a los resultados anteriores, una DO 600 de 1 corresponde a 1 x 10 9 UFC / ml, sin embargo, esto debe ser confirmado por diferentes L. cepas pneumophila.
    Nota: si se requiere la inducción de una proteína a partir de un plásmido, añadir 1 mM de IPTG al inóculo.
  9. Placa del inóculo como se describe en la sección 9 como un control para garantizar el UFC espera está presente en el inóculo.

2. Preparación de las larvas

  1. Compra suficiente G. mellonella larvas de un proveedor comercial. Las larvas se envían en la etapa 5 º o 6 º estadio (aproximadamente entre 2 a 3 cm de longitud) y son adecuados para su uso inmediato.
    Nota: Un método que describe cómo trasera larvas se ha descrito previamente 39.
    Nota: Las larvas se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por dos semanas y no requieren de alimentos. Deseche inmediatamente cualquier larvas que presenten signos de la fase de pupa.
  2. Preparar el recipiente para larva por placing un círculo de 10 cm de papel de filtro en la parte inferior de un plato de Petri de 10 cm.
  3. Con unas pinzas de punta roma, colocar diez larvas sanas de tamaño aproximadamente similar en la placa de Petri.
    Nota: Deseche insalubres insectos de color marrón con manchas de color o mirando. Larvas sanas son uniformemente cremosa de color sin zonas de coloración oscura y son capaces de enderezarse rápidamente si entregado.

3. La infección de G. mellonella larvas

  1. Preparar la plataforma de inyección con cinta adhesiva un círculo de papel de filtro a la superficie.
  2. Firmemente con cinta adhesiva una punta P1000 horizontalmente al papel de filtro para crear una plataforma de inyección. Este no necesita ser estéril.
  3. Esterilizar un pocillo de microtitulación jeringa 20 l mediante la aspiración de etanol al 70% e incubando durante al menos 10 min.
    1. Use guantes a prueba de pinchazos mientras se inyecta,
  4. Retire el etanol residual aspirando y expulsando agua estéril varias veces.
  5. Using la jeringa, aspirado 10 l de la L. pneumophila 1 x 10 9 suspensión UFC / ml.
  6. Tome una larva y suavemente pero con firmeza convertirlo en su espalda, se inclinó sobre la punta P1000.
  7. Coloque la punta de la jeringa en el proleg delantero, derecha de las larvas.
  8. Suavemente, inserte la punta de la aguja en el proleg, asegurándose de que está dentro de las larvas, y suavemente inyectar todo el contenido de la jeringa.
    Nota: Si la jeringa se inserta correctamente, debería ser posible para recoger las larvas utilizando sólo la jeringa para colocarlo en la cámara.
    1. Después de la inyección, observar las larvas durante unos pocos segundos. Las larvas comenzará a gatear tras un par de segundos, pero no debe excretar fluido.
  9. Brevemente observar las larvas unas pocas horas después de la infección; infección con 10 7 UFC de L. 130b pneumophila no causa síntomas en su primer 5-8 h pi Por lo tanto, si las larvas se pone gris / negro antes de este punto, tque el experimento debe ser interrumpido.
    Nota: La inoculación de larvas con IPTG 1 mM no afecta a la viabilidad de las larvas en el curso del experimento.
  10. De la misma manera, inyectar un total de 10 larvas por condiciones incluyendo 10 larvas inyectado con D-PBS para servir como un control para analizar la mortalidad de las larvas.
  11. Platos de cinta de Petri cerradas y coloque en un envase secundario.
  12. Incubar en una incubadora bacteriana estándar a 37 ° C, durante la duración del experimento.

4. El pretratamiento de las larvas con un inhibidor químico

  1. Antes de la infección, preparar larvas para inyección tal como se describe en la sección 3.1 hasta 3.6.
  2. Inyectar 10 l de una solución de la citocalasina D 100 M en la parte delantera, izquierda Proleg de 10 larvas.
    Nota: inhibidor se inyecta en una Proleg diferente de la suspensión bacteriana para reducir la lesión a las larvas.
  3. Inyectar 10 l de DMSO en 10 larvas como un control.
  4. Incubar las larvas en37 ° C durante 4 h.
  5. Inyectar larvas pretratada como se describe en la sección 3 en la parte delantera, justo Pròleg con 1 x 10 7 UFC de L. PESO pneumophila o un control de PBS.

5. Análisis de la mortalidad de las larvas

  1. En 18 h después de la infección (pi), examinar todas las larvas infectadas para la mortalidad.
  2. Para comprobar la mortalidad, utilice unas pinzas de punta roma a entregar las larvas y mirar para el movimiento de las piernas, las larvas sanas debe enderezarse rápidamente. La pigmentación indica una fuerte reacción inmune a la infección. Si hay algún movimiento, contar como vivos.
  3. Registre el número de larvas muertas y vivas.
  4. Repita este proceso en todos los otros puntos de tiempo seleccionados.
    Nota: Si se continuó la incubación durante más de tres días, las pupas se puede ver. Retire cualquier pupas y la eutanasia por congelación a - 20 ° C antes de que ocurra la metamorfosis.

6. La extracción de hemolinfa

  1. Seleccione al azar treslarvas y colocar en un tubo de 14 ml en los puntos de tiempo seleccionados, tales como 5 y 18 h pi,
  2. Coloque este tubo en hielo durante 5-10 minutos, hasta que se observa ningún movimiento de las piernas de las larvas.
  3. Colocar las larvas anestesiadas sobre una placa de Petri y, utilizando un bisturí, hacer una incisión entre dos segmentos de cerca de la cola de las larvas.
  4. Apriete las larvas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml estéril para recoger la hemolinfa.
    1. Piscina hemolinfa a partir de al menos tres individuos. Una larvas da entre 15-50 l de hemolinfa dependiendo del tamaño.
      Nota: Durante la extracción de la hemolinfa es muy fácil para interrumpir el intestino, lo que resulta en la contaminación potencial de las muestras. Reducir la contaminación mediante la reducción de las larvas cerca de la cola (lejos del intestino), sin embargo, siempre se requiere la selección de antibióticos en placas cuando las bacterias.
      Nota: Para evitar la hemolinfa se pongan marrones y coagulante, proceso de la hemolinfa dentro de 10 minutos después de la recogida.
  5. Deseche el cuerpo de la larva en un nuevo 14 ml tubo Falcon, sello y lugar a - 20 ° C durante la noche para asegurarse de que las larvas están muertos.
  6. Autoclave larvas muertas y disponer de acuerdo con las normas locales.

7. Determinación de la viabilidad de hemocitos

  1. Extracto de hemolinfa como se describió anteriormente.
  2. Mezclar 20 l de hemolinfa se extrajo con 20 l de 0,02% (v / v) de azul de tripano en PBS en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
  3. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Carga 10 l de hemolinfa en un hemocitómetro y contar las células viables (no azules).
  5. Cuente cada muestra por triplicado para reducir el error.

8. Procesamiento de Extraídas hemocitos de inmunofluorescencia microscopía

  1. Mezclar la hemolinfa agrupada extraído de al menos tres larvas y pipeta en un cubreobjetos de vidrio 10-15 mm en una placa de 24 pocillos.
    Nota: Los cubreobjetos no requieren tratamiento como hemocitos pueden adherirse al vidrio.
  2. Añadir 0,5 ml de D-PBS y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo.
  3. Se centrifuga la placa durante 10 minutos a 500 xg a temperatura ambiente (RT) utilizando un soporte de la placa centrífuga hermética a los aerosoles.
  4. Examine cada pocillo utilizando un microscopio invertido para comprobar que los hemocitos se han adherido.
  5. Eliminar el sobrenadante y lavar cuidadosamente las células tres veces mediante la adición de 0,5 ml de D-PBS a la pared del pozo, balanceo de la placa 2-3x y la eliminación de la D-PBS con una pipeta.
  6. Fijar las células por adición de 0,5 ml de 4% (v / v) de paraformaldehído (PFA) en PBS.
  7. Incubar las células durante entre 20-30 min a TA.
  8. Lavar las células tres veces con D-PBS, como antes.
  9. Añadir 0,5 ml de 15 mM de NH4Cl en PBS para saciar PFA residual y se incuba a TA durante 15 min.
  10. Lavar las células tres veces con D-PBS.
    Nota: En esta etapa, los cubreobjetos se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C.
  11. Añadir 0,5 ml de 0,1% de Triton X-100 en PBS e incubar durante 5 min a TA para permeabilizar las células.
  12. Bloquear durante 1 hora con solución de bloqueo (2% (w / v) de BSA en PBS).
  13. Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo a la dilución especificada por el fabricante.
  14. Lavar 3 veces con PBS.
  15. Incubar durante 1 hora con el anticuerpo secundario y DAPI para la visualización de bacterias como anteriormente.
  16. Lavar 3 veces con PBS.
  17. Montar los cubreobjetos utilizando una gota de reactivo de montaje en portaobjetos de vidrio.
  18. Incubar toda la noche en la oscuridad a RT para secar completamente la solución de montaje.
  19. Imagen desliza en un microscopio de fluorescencia.

9. La cuantificación de UFC bacteriana

  1. Añadir 100 mg / ml de espectinomicina en CYE placas para evitar la contaminación por la flora intestinal. L. 130b cepa pneumophila es naturalmente resistente a la espectinomicina 40.
  2. Antes de la extracción de hemolinfa, pesar 1,5 ml tubos de centrífuga.
  3. Extracto de hemolinfa como se describe en la sección 6 y colocar en pesado tUBE, añadir 1 l de 5 mg / ml digitonin, mezclar bien e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente para lisar hemocitos.
  4. Volver a pesar el tubo con la hemolinfa y determinar el peso de la hemolinfa extraída.
  5. Realizar diluciones seriadas diez veces de la hemolinfa en medios AYE estéril.
  6. Con un lápiz, dividir la base de una placa CYE en seis sectores y etiqueta iguales.
  7. Placa tres gotas de 25 l de cada dilución (empezando por el más diluida) en cada sección de la placa.
  8. Las placas se incuban con las tapas planifiquen la noche a 37 ° C.
  9. Una vez que las gotas se han secado completamente, gire la placa de una y se incuba a 37 ° C por lo menos durante dos días más.
  10. Cuantificar las bacterias extraídas por recuento de las colonias en cada dilución y normalizar para el peso de la hemolinfa extraída.

10. Determinación del Índice de Competitividad (IC)

  1. Confirme que ambas cepas crecen igualmente bien en el caldo de cultivo y en placas de agar CYE prior para intentar el índice competitiva.
  2. Preparar suspensiones bacterianas mutantes resistentes WT o kanamicina como se describe en el apartado 1 y se mezcla en una proporción de 1:1.
    1. Placa de diluciones en serie del inóculo en CYE espectinomicina (100 mg / ml) y CYE espectinomicina / kanamicina
  3. Infect larvas y hemolinfa extracto en puntos de tiempo adecuado como se describe más arriba.
  4. Determinar los recuentos viables mediante la extracción de la hemolinfa y placas de diluciones en serie a la espectinomicina CYE y CYE espectinomicina / kanamicina.
  5. Calcular el índice competitiva (IC) de la siguiente manera: IC = (salida mutante / salida WT) / (inóculo mutante / PESO inóculo).

Resultados

Aquí se demuestra que G. mellonella es una respuesta adecuada, fácil de usar modelo para estudiar L. infección pneumophila. Anteriormente se ha demostrado que L. virulencia pneumophila en macrófagos, amebas y modelos de mamíferos es dependiente de la presencia del sistema de secreción de punto / ICM 41-43. G. larvas mellonella fueron infectadas como se describe anteriormente y la virulencia del tipo salvaje (WT) y una cepa de punto / ICM-deficientes en comparación. La infección con 10 7 UFC de L. 130b cepa pneumophila resultó en una mortalidad del 100% en un plazo de 24 h después de la infección (pi). Sin embargo, la L. cepa Δ dotA pneumophila, que no dispone de un sistema de secreción Dot / ICM T4SS funcional, era no virulenta en este ensayo (Figura 1). Esto demuestra que L. virulencia pneumophila en G. mellonella depende de la translocación de efectores Dot / ICM, haciendo de este modelo adecuado para la caracterización dela función de estas proteínas.

Recientemente, se demostró que la inhibición de la fagocitosis por tratamiento citocalasina aumentó la susceptibly de las larvas a la infección por la levadura Candida albicans 6. Como L. pneumophila es un patógeno intracelular, se decidió determinar si la absorción de las bacterias es crucial en su patogénesis en este modelo. Las larvas fueron pretratadas con 10 l de 100 mM citocalasina D (CyD) durante 4 horas a 37 ° C, y luego infecta con 10 7 UFC de L. PESO 130b pneumophila y mortalidad supervisado a las 24 horas pi tratamiento con el inhibidor por sí sola no afectó la supervivencia de las larvas. Sin embargo, previamente tratada, las larvas infectadas muestra una supervivencia significativamente mayor (P = 0,0066, prueba de t desapareada) en comparación con los tratados con DMSO, los insectos infectados (Figura 2). El efecto del tratamiento CyD fue abolida por 48 horas pi (resultados no mostrados), lo que puede ser debido a la vida media del fármaco en G.mellonella. Esto demuestra que la absorción de L. pneumophila en G. hemocitos mellonella es un aspecto crucial de la virulencia bacteriana.

Con el fin de validar la expresión y determinar la localización subcelular de una proteína efectora en G. mellonella, hemocitos se extrajeron y procesaron para microscopía de inmunofluorescencia. Las larvas fueron infectadas con WT y Δ dotA L. pneumophila 130b que expresa un fragmento del efector T4SS bien definida, SIDC 41 a 918, fusionado a 4 HA etiquetas N-terminales. Este efector fue demostrado de obligar a la LCV a través de un dominio de unión phosphoinositide-4-fosfato-44. El uso de anti-HA (rojo) y anti-legionela (verde) anticuerpos, 4HA-SIDC 41-918 localizado en el LCV en hemocitos infectadas (Figura 3). Esta localización se ha mostrado previamente en la discoideum amebas Dictyostelium y en los macrófagos de mamíferos 44,45 confirmando la Comparability de este modelo.

La importancia de las proteínas de virulencia es generalmente determinada por la comparación de la cinética de crecimiento de tipo salvaje y las bacterias mutantes. Con el fin de seguir la cinética de replicación bacterianas en el transcurso de la infección, se sacrificaron tres larvas en cada punto de tiempo (0, 5, 18, y 24 horas pi), la hemolinfa recogieron y agruparon y el CFU/0.1g de hemolinfa extraída determinado. Después de una inmersión inicial en 5 pi h, la UFC de las bacterias WT aumenta hasta 24 horas pi sin embargo, la cepa Δ dotA no experimenta la replicación y se borra en 18 horas pi (Figura 4).

La capacidad de L. pneumophila para causar la lisis de los macrófagos de una forma dependiente de T4SS mucho tiempo se ha documentado 46, sin embargo no hay estudios similares se han realizado in vivo. La concentración de hemocitos circulantes se determinó a 5, 18, y 24 horas pi Las larvas fueron infectadas con WT o Δ dotA L. pneumophila 130b, hemocitos extraídos de insectos infectados y las células viables contados por el método de exclusión con azul de tripano. A las 5 h pi ninguna diferencia en los recuentos de hemocitos entre las cepas podría ser visto (Figura 5). Sin embargo, en 18 horas pi hubo una caída significativa en la concentración de hemocitos en WT, pero no Δ dota, las larvas infectadas. Esta diferencia se mantuvo a las 24 horas pi La caída en el número de hemocitos, combinado con la presencia de bacterias intracelulares como se ve por inmunofluorescencia, sugiere que L. pneumophila se replica dentro de hemocitos luego los lyses, lo que permite que las bacterias se someten a varias rondas de replicación.

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Figura 1. La infección con L. pneumophila induce Dot / ICM-dependiente de la mortalidad de las larvas. 10 larvas fueron infectadas con PBS solo o 10 7 UFC de tipo salvaje (WT) o Δ dotA L. pneumophila 130b, se incubaron a 37 º C durante 72 horas y la hora de la muerte de las larvas grabado. Todas las larvas infectadas con el WT sucumbió a la infección dentro de las 24 h después de la infección (pi), sin embargo no se observó mortalidad en las larvas inoculadas con PBS solo o de la cepa Δ dotA. Los resultados son la media de tres experimentos separados, ± desviación estándar.

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Figura 2. La mortalidad es dependiente de la internalización bacteriana. 10 L. pneumophila larvas fueron pretratados con 10 l de 100 mM citocalasina D (CyD) durante 4 horas a 37 ° C y después se infectaron con 10 7 WT y la mortalidad un control en larvas pretratada 24 h pi demostrado de manera significativa (P = 0,0066, no apareado T-test) redujo la mortalidad. Los resultados representan el mean de al cuatro experimentos independientes ± desviación estándar con 10 larvas por condición.

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Figura 3. Imágenes de inmunofluorescencia de las proteínas efectoras en hemocitos extraídos. Hemocitos fueron extraídos de las larvas infectadas con L. pneumophila 130b WT o Δ dotA expresar 4HA-SIDC 41-918 a 5 células pi hr fueron teñidas utilizando anti-HA (rojo) y anti-legionela (verde) anticuerpos y las manchas de ADN DAPI (azul) para visualizar los núcleos. 4HA-SIDC 41-918 se observó PESO circundante, pero no Δ Dota, bacterias. La barra de escala 5 micras.

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Figura 4. L. pneumophila se replica dentro de G. mellonella de una manera de punto / ICM-dependiente. Las larvas fueron infectadas con pneumophila WT o Δ dotA L. y a 0, 5, 18, ​​y 24 horas PI la hemolinfa de insectos infectados tres agrupados, en placas sobre placas de CYE y la UFC y determina normalizado para el inóculo y para el peso de la hemolinfa extraída. PESO L. pneumophila replicado en el transcurso del experimento, mientras que la cepa Δ dotA se aclaró dentro de 18 horas pi resultados son la media de tres experimentos independientes ± desviación estándar.

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Figura 5. La infección con L. PESO resultados pneumophila en la destrucción de hemocitos significativa. hemocitos se extrajeron a 5, 18, ​​y 24 horas pi a partir de larvas infectadas con pneumophila WT o Δ dotA L. y las células viables se contaron usando un hemocitómetro. No hay diferencia en lanúmero de células se observó en 5 pi h entre las cepas sin embargo en 18 horas PI sólo aproximadamente el 15% de hemocitos permanecen en las larvas infectadas con la cepa PESO comparación con la cepa Δ dotA. Los resultados son la media de tres experimentos separados, ± desviación estándar.

Discusión

Modelo larval The Galleria mellonella para la infección por Legionella pneumophila es una herramienta útil para estudios in vivo de la patogénesis. Aquí se muestra que un número de aspectos de la infección de los macrófagos puede ser recapitulado en el G. modelo mellonella, incluyendo el papel de la Dot / ICM T4BSS en la virulencia y la replicación bacteriana y la localización del punto / ICM-efector SIDC. Además, hemos demostrado que un inhibidor químico de la polimerización de la actina reduce significativamente la mortalidad de las larvas, imitando los resultados obtenidos en macophages 47 y elementos de prueba de que se requiere la internalización de la bacteria que causa la mortalidad de las larvas. Anteriormente, se ha demostrado que las variaciones en la virulencia entre L. cepas pneumophila visto en otros modelos de infección pueden ser verificados en G. Se requiere mellonella y que la inducción de factores de virulencia en fase de crecimiento post-exponencial de la virulencia bacteriana 36, lo que confirma que G. mellonella es un modelo adecuado para L. infección pneumophila.

La determinación de la UFC de L. pneumophila a partir de las larvas infectadas de forma individual o en infecciones mixtas aumenta en gran medida la utilidad del modelo. Anteriormente, varios factores han descubierto que tiene efectos sutiles sobre la replicación bacteriana en uno o más modelos de infección 29,48-51. Aunque las larvas no poseen un sistema inmune adaptativo, la presencia de la respuesta inmune innata proporciona una selección más fuerte en comparación con los macrófagos solos, que puede servir para amplificar fenotipos sutiles. Por lo tanto, es posible que, mientras estas cepas probablemente no afectará significativamente la mortalidad de las larvas, que pueden demostrar disminución de la replicación bacteriana o de la aptitud en la G. modelo mellonella. Así como la replicación de L. pneumophila en las larvas, hemos demostrado el agotamiento de hemocitos significativa tarde en la infección. Como L.Se espera pneumophila para lisar las células huésped al final de su ciclo de replicación, la medición de agotamiento de hemocitos también puede servir como una medida indirecta de la replicación bacteriana. Agotamiento de hemocitos previamente se ha correlacionado con la mortalidad de los insectos en la infección por 3,52, aunque los resultados recientes sugieren que esta imagen es más complejo que primero belived 37. Recientemente, se ha demostrado que la inanición de las larvas conduce a una mayor susceptibilidad a la infección a través de una supresión de las respuestas inmunes 53. En los ensayos descritos aquí, las larvas no fueron alimentados durante la duración del estudio y no se sabe qué tan bien larvas alimentadas respondería a L. infección pneumophila.

Una de las ventajas de G. mellonella como organismo modelo es la facilidad de extracción y cuantificación de los hemocitos de las larvas infectadas. Vídeos anteriores han demostrado varios métodos para la extracción de los hemocitos de insectos 54,55 sin embargo, el conocidohod que aquí se presenta es simple y conveniente para su procesamiento inmediato. Una vez extraído, hemocitos son fáciles de cuantificar, utilizado para inmunofluorescencia, microscopía electrónica de transmisión 36 o 56 o la citometría de flujo y cultivadas infectadas ex vivo 3 permitiendo que la respuesta de las células a la infección al ser investigado en detalle. Esto aumenta significativamente la flexibilidad del modelo. Una advertencia de inmunofluorescencia en G. mellonella es la oferta limitada de anticuerpos validados contra G. proteínas mellonella. Sin embargo, los estudios han demostrado la creación de anticuerpos contra proteínas de larvas 57 y los anticuerpos contra las proteínas relacionadas con la inmunidad humanos se encontró que reconocer G. proteínas mellonella 11 demuestran el potencial de inmunofluorescencia en G. hemocitos mellonella.

La facilidad de G. infección mellonella permite rápidos, pantallas medianas rendimiento que podríanser utilizado para comparar la virulencia de varias especies y cepas de Legionella y podría ser utilizado para analizar más factores de virulencia identificados previamente tales como moléculas de adhesión 58 o el sistema de secreción de tipo 2 59 que son necesarios para la virulencia en otros modelos. Además, el uso de este modelo permitirá la identificación y la caracterización adicional de los factores de virulencia novedosos incluyendo proteínas efectoras secretadas y translocados. Recientemente, se ha demostrado que la actividad de la fosfolipasa C de L. pneumophila tiene un papel en G. mellonella virulencia 60 y que la proteína efectora de punto / ICM SdhA se requiere para la virulencia 37. Además, recientemente hemos demostrado que existe una correlación entre los fenotipos observados en G. mellonella y en la cepa 37 del ratón A / J.

Esto pone de relieve el valor de esta herramienta para complementar protozoo ambiental y huésped unicelular y murimodelos de infección ne. El G. modelo mellonella se convertirá en aún más valiosa en el futuro, una vez que la secuencia genómica larval estará disponible y las herramientas más genéticos están establecidos. Medidas en este sentido incluyen la reciente publicación que detalla el transcriptoma asociada al sistema inmunológico 61 y la formación de una iniciativa para promover el silenciamiento de genes en Lepidoptera spp 62.

Mediante el uso de G. larvas mellonella, tenemos un número de lecturas rápidas y sencillas de la virulencia bacteriana que pueden ser utilizados para investigar la patogénesis de L. pneumophila. El establecimiento de estos ensayos y más amplia proyección de L. cepas pneumophila serogrupos y aumentarán la utilidad de esta nueva herramienta y contribuirán a nuestra comprensión de la L. patogénesis pneumophila.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

CR Harding fue apoyado por la beca WT086724 Wellcome Trust.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material/ Equipo
extracto de levadura >ACES (AYE)4 g ACES, 4 g extracto de levadura, 0,4 g α-cetoglutarato, pH 6,9, 400 ml H2O, esterilizado en autoclave, 4 ml de solución de hierro*, 4 ml de solución de cisteína*
*Agregue ingredientes estériles después de la esterilización en autoclave
Placas deextracto de levadura tamponado con carbón vegetal (CYE)Como en el caso anterior, con la adición de 0,6 g de carbón activado y 6 g de agar
Solución estéril de hierro (pirofosfato férrico)SigmaP65260,6 mM solución, estéril filtrada
Solución estéril de cisteína estérilSigmaC78803,3 mM solución, estéril filtrada
G. mellonella (gusanos de cera)Livefood UKW250
Anti-HA-tetrametil Rhodamina Isotiocianato ( TRITC)SigmaH9037
Anti<-em>Legionella LPSCambridge BiosciencesPA1-7227
Anti-Conejo IgG Alexa488Jackson Immunoreach711-485-152
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)SigmaI6758
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbeccos (D-PBS)SigmaD8662
ParaformaldehídoAgar ScientificR1026
Cloruro de amonio (NH4Cl)SigmaA9434
Solución de azul de tripanoSigmaT8154
DigitoninaSigmaD141
Citocalasina DBiomol InternationalBML-T109-0001
[encabezado]
Material
Microtiter JeringaSigma24544
Contador de células, doble, mejorado Centrífuga
Para placas de centrifugación
MicroscopioPara el recuento de células viables
Guante a prueba de pinchazosPiel
de Neubauer VWR 631-0926 Microscopio de fluorescencia Cualquier microscopio con filtros adecuados para los fluoróforos requeridos invertido de tortuga

Referencias

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