Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

Resumen

Aquí se presenta una aplicación de la técnica de deflexión de haz fototérmica en combinación con un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, para supervisar microsegundos y milisegundos dinámica y de la energética de cambios estructurales asociados con la asociación de calcio a un sensor de calcio neuronal, elemento regulador aguas abajo Antagonista Modulador .

Resumen

Desviación del rayo fototérmica junto con fotoacústica calorimetría y rallado térmica pertenece a la familia de métodos fototérmicos que controlar el volumen y el tiempo de entalpía perfil cambios de luz inducidos cambios conformacionales en proteínas en microsegundos a milisegundos escalas de tiempo que no son accesibles mediante parada tradicional instrumentos de flujo. Además, puesto que se sondean cambios globales en el volumen y / o entalpía, estas técnicas se pueden aplicar a las proteínas y otras biomacromoléculas que carecen de un fluoróforo y una etiqueta o cromóforo. Para monitorear la dinámica y energética de los cambios estructurales asociados con Ca ^{2 +} vinculante a los transductores de calcio, tales sensores de calcio neuronales, un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, se emplea para la foto-trigger un rápido aumento (τ <20 microsegundos) en el calcio libre concentración y el volumen asociado y entalpía cambios se probaron utilizando la técnica de deflexión de haz fototérmica.

Introducción

Métodos foto-térmica, como la calorimetría fotoacústica, desviación del rayo fototérmica (PDB), y rallado transitorias acoplado con excitación láser de nanosegundos representan una poderosa alternativa a los transitorios espectroscopias ópticas para los estudios con resolución temporal de los intermedios de corta duración ^1,2. En contraste con las técnicas ópticas, como la absorción transitoria y espectroscopia de IR, que supervisan el perfil de tiempo de los cambios de absorción en el cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar la dependencia del tiempo de los cambios de calor / volumen y por lo tanto son herramientas valiosas para la investigación de los perfiles de tiempo de ópticamente procesos "silenciosos". Hasta el momento, la calorimetría fotoacústica y rallado transitoria se ha aplicado con éxito para estudiar la dinámica de conformación de procesos foto-inducidos, incluyendo la migración ligando diatómico en globinas ^3,4, ligando con la proteína sensor de oxígeno FixL ^5, electrón y el transporte de protones en hemo-cobre oxidasas ⁶ unND fotosistema II, así como la foto-isomerización en la rodopsina ⁷ y dinámica de conformación en criptocromo ^8.

Para ampliar la aplicación de técnicas fototérmica a los sistemas biológicos que se carece de un cromóforo y / o fluoróforo interna, la técnica de PBD se combinó con el uso del compuesto enjaulado a la foto-gatillo de un aumento en la concentración de ligando / sustrato dentro de unos pocos microsegundos o más rápido, dependiendo en el compuesto enjaulado. Este enfoque permite el monitoreo de la dinámica y de la energética de los cambios estructurales asociados con el ligando / sustrato unión a las proteínas que se carece de un fluoróforo interna o cromóforo y en escala de tiempo que no es accesible con instrumentos de parada de flujo comercial. Aquí una aplicación de PBD para supervisar la termodinámica del compuesto jaula, Ca ^{2 +} DM-nitrofen, foto-escisión, así como la cinética del Ca ^{2 +} asociación para el dominio C-terminal del sensor de calcio neuronal de Downcorriente Reguladora Element Antagonista Modulador (SUEÑO) se presenta. El Ca ^{2 +} es foto-liberado de Ca ^{2 +} DM-nitrofen dentro de 10 microsegundos y vuelve a enlazar a una jaula unphotolysed con una constante de tiempo de ~ 300 microsegundos. Por otro lado, en la presencia de apoDREAM se observa una cinética adicional que se produzca en la escala de tiempo de milisegundos y refleja la unión a la proteína ligando. La aplicación de PBD para sondear las transiciones conformacionales en los sistemas biológicos ha sido de alguna manera limitado debido a las dificultades instrumentales, por ejemplo ardua la alineación de la sonda y haz de bombeo para lograr una señal fuerte y reproducible PBD. Sin embargo, un diseño meticuloso de una instrumentación configuración, un control preciso de la temperatura, y una alineación cuidadosa del haz de la sonda y la bomba proporcionan una señal de PBD consistente y robusto que permite la monitorización de volumen resuelta en el tiempo y cambios de entalpía en una amplia escala de tiempo de 10 microsegundos a unos 200 ms. Además, en modificaciónciones del procedimiento experimental para asegurar la detección de muestra y de referencia trazas bajo temperatura idéntica, la composición del tampón, la orientación célula óptica, la potencia del láser, etc reduce significativamente el error experimental en volúmenes y entalpías de reacción medidos.

Protocolo

1. Preparación de muestra

1. Llevar a cabo la preparación de la muestra y todas las manipulaciones de la muestra en un cuarto oscuro para prevenir un uncaging no deseado.
2. Solubilizar DM-nitrofen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenil) - N, N, N ', N'-tetrakis [(oxi-carbonilo) metil] -1,2-etanodiamina) en HEPES 50 mM tampón, mM de KCl, pH 7,0 a una concentración final de 400 mM 100 (ε _{350 nm} = 4330 M ^-1 cm ^{-1 9).}
3. Añadir _CaCl2 de la solución madre 0,1 M para conseguir una proporción deseable de [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrofen]. Para las proteínas con _Kd para el Ca ^{2 +} asociación mayores de 10 micras, la proporción de ^{[Ca2 +]:} [DM-nitrofen] de 1:01 es preferible evitar la unión de foto-lanzado Ca ^{2 +} para uncaged DM-nitrofen . En efecto, teniendo en cuenta el valor _{de Kd} para DM-nitrofen ser 10 nM y la concentración total de DM-nitrofen y Ca ^{2 +} para ser 400 mM, ~ 90% de una proteína fijadora de calciocon K _d = 10 M estarán en el apoform. Por otro lado, para el estudio de Ca ^{2 +} unión a proteínas con _Kd <10 M, es preferible disminuir la ^{[Ca2 +]:} relación de [DM-nitrofen] a 0,95 para prevenir Ca ^{2 +} complejación con el apo- proteína antes de la jaula fotodisociación.
4. Solubilizar el compuesto de referencia, K ₃ [Fe (III) (CN) _6] o Na ₂ CrO _4, en el mismo tampón que para la muestra.

2. Configuración del Experimento

1. La configuración experimental básico se muestra en la Figura 2.
2. Utilice un agujero de pasador (P ₂₎ para ajustar el diámetro del haz de sonda (632 nm de salida de láser de He-Ne, ~ 5 mW de potencia de láser) a 1 mm y propagar el haz de sonda a través del centro de una célula se coloca en una temperatura controlado soporte de la celda utilizando un M ₁ espejo.
3. Use un espejo (M ₂₎ detrás de la muestra para centrar el haz de sondaen un centro de detector sensible a la posición.
4. Enfocar el haz de sonda en el centro del detector de tal manera que la diferencia en el voltaje entre los dos primeros diodos y dos diodos parte inferior, así como la diferencia en el voltaje entre los dos diodos en el lado izquierdo y derecho del detector es cero.
5. Posteriormente, la forma de un diámetro del haz de la bomba, una salida de 355 nm de Q-switched Nd: YAG, FWHM 5 nseg) usando un agujero de alfiler 3 mm (P ₁₎ colocado entre dos espejos del láser 355 nm.
6. Copropagate el haz de bomba a través del centro de la cubeta como se demuestra en la Figura 2. Es importante que los dos rayos láser se propagan a través del centro de la célula óptica en forma casi colineal para obtener un ángulo de desviación medible y por lo tanto de alta amplitud de la señal PBD. En condiciones experimentales, el ángulo de la intersección de los haces de sonda y de la bomba es menor que 15 °.
7. Use un compuesto de referencia para alinear la sonda y la bombahaz para lograr una señal de PBD satisfactoria, es decir, una buena relación S / N y estable amplitud PBD en escalas de tiempo más largas (~ 100 ms).
8. Ajustar la posición del haz de la bomba con respecto al haz de la sonda por un ajuste incremental de 355 espejos láser nm.
9. Medir la amplitud de la señal de referencia de PBD como una diferencia entre dos fotodiodos superior e inferior en el detector sensible a la posición. La señal de PBD debe exhibir un rápido aumento de la amplitud en una escala de tiempo rápida (<10 microsegundos) y permanecer estable en 100 mseg escala de tiempo como se demuestra en la Figura 3. Balón a la variabilidad del tiro de la amplitud AP está dentro del 5% de la amplitud de la señal y la reproducibilidad de la señal se ve afectada principalmente por las vibraciones.
10. Comprobar la linealidad en la amplitud de la señal PBD con respecto a la energía calorífica liberada por la medición de la dependencia lineal de la señal de PBD en la potencia del láser de excitación y en el número de Einsteins absorbida, E _una= ^(1-10-A), donde A corresponde a la absorbancia de referencia a la longitud de onda de excitación.
11. Mantener la potencia del láser por debajo de aproximadamente 1000 mu J y la absorbancia del compuesto de muestra / referencia a la longitud de onda de excitación de menos de 0,5 para evitar la absorción múltiple de fotones y disminución de la potencia del haz de la bomba, respectivamente, y garantizar la linealidad de la señal de PBD.

3. PBD Medidas

1. Comience con la medición de las huellas PBD para la referencia. Coloque la solución del compuesto de referencia en una célula de cuarzo de 0,5 cm x 1,0 cm x 1,0 cm o 1,0 cm y la posición de la celda en el soporte de temperatura controlada. Ambas longitudes de trayectoria proporcionan amplitud PBD comparables.
2. Detectar la señal de PBD referencia como una función de la temperatura en el rango de temperatura de 16-35 ° C con el incremento de temperatura de 3 ° C.
3. En cada cambio de temperatura, compruebe la posición del haz de prueba en el detector sensible a la posición y volverajustar la posición al centro del detector, si es necesario.
4. Comprobar la linealidad de la señal de PBD como una función de la [(dn / dt) / C _p ρ] plazo de acuerdo con la Ecuación 2.
5. Colocar la solución de la muestra en la misma célula óptica como para el compuesto de referencia manteniendo la misma orientación de la célula óptica como para la medición de referencia.
6. Detectar los rastros de PBD de la muestra en el mismo rango de temperatura como para la referencia y comprobar la linealidad de la amplitud de la muestra PBD con respecto a la [(dn / dt) / C _p ρ] plazo.

4. Análisis de Datos

La magnitud de la desviación es directamente proporcional al cambio de volumen debido al calentamiento de la muestra (? V _ª) y cambio de volumen no térmico _(nonth? V) de acuerdo con la Ecuación 1:

La amplitud de la muestra (A _S) Y de referencia (A _r) señal de PBD puede ser descrito usando las Ecuaciones 2 y 3, respectivamente.

Señal de PBD es directamente proporcional al parámetro de respuesta del instrumento (K) y el número de Einsteins absorbida _(Ea). El primer término en la ecuación 2, (dn / dt) (1/ρC _p) Q, corresponde al cambio de la señal debido a la calor liberado al disolvente. El dn / dt término representa el cambio dependiente de la temperatura en el índice de refracción, ρ es la densidad del disolvente, C _p es la capacidad calorífica. Todos los parámetros son conocidos por el agua destilada y se pueden determinar para una solución tampón mediante la comparación de una señal de PBD para el compuesto de referencia en agua destilada y en un tampón apropiado. Q es la cantidad de calor returned para el disolvente. El ρ (dn / d ρ) es un término constante-unidad menos que es independiente de la temperatura en el rango de temperatura de 10-40 ° C ^10. Plazo _ABS Delta n corresponde al cambio en el índice de refracción debido a la presencia de especies absorbentes en la solución y que es insignificante si la longitud de onda del haz de la sonda se desplaza en relación con los espectros de absorción de cualquier especie en la solución. La señal que surge a partir del compuesto de referencia (A _r) se expresa por la Ecuación 3 donde E _{h ν} es la energía del fotón a la longitud de onda de excitación, E _{h ν} = 80,5 kcal / mol para 355 nm de excitación.

1. Tome la amplitud de la señal de PBD referencia como la diferencia entre la señal de predisparo y PBD mensaje de activación como se demuestra en la Figura 3. De manera similar, determinar la amplitud de la rápida (A _s ^rápido) y de fase lenta (A _s ^lenta) De la señal de muestra de PBD.
2. Para eliminar el parámetro de respuesta del instrumento, K, la escala de la amplitud de la señal de la muestra PBD por la amplitud de la señal de PBD de la referencia. La relación de la señal de muestra para la señal de referencia se obtiene la ecuación 4 y se puede escribir como:
   
   
3. Usando esta ecuación, determinar el calor liberado a la solución (Q) y cambio de volumen no térmico _(nonth? V) asociado con una reacción foto-iniciada de la pendiente y la intersección, respectivamente, de una parcela de [(A _s / A _r) E _{h ν]} plazo frente a la temperatura término dependiente [(dn / dt) (1/ρCp)].
4. Para determinar el volumen de reacción y el cambio de entalpía para el rápido y el lento proceso, escalar el volumen observado y el cambio de entalpía para el rendimiento cuántico apropiado de acuerdo con las ecuaciones 5-7.
   
   
   
   
   
   Para un proceso de múltiples pasos con una cinética que ocurren en la escala de tiempo entre 10 microsegundos ~ 200 mseg, el volumen y cambios de entalpía asociadas con los pasos individuales de la reacción pueden ser determinadas. Las amplitudes y tiempos de vida para los pasos individuales se analizaron ajustando los datos a la función f (t) que describe el perfil de tiempo del volumen y cambios de entalpía.
   
   donde α ₀ corresponde a la A _s ^rápido y α _i corresponde a A _s ^lenta para cada proceso individual y τ _i son la vida útil de los pasos de reacción individuales. A partir de la temperatura de la dependencia de la constante de velocidad FOr procesos individuales (K _i = 1 / τ _i) los parámetros de entalpía de activación y de entropía se puede determinar fácilmente mediante gráficos Eyring.

Resultados

Un ejemplo representativo de PBD traza de Ca ^{2 +} foto de liberación de Ca ^{2 +} DM-nitrofen se muestra en la Figura 3. La fase rápida corresponde a la foto-disociación de Ca ^{2 +} DM-nitrofen y Ca ^{2 +} liberación, mientras que la fase lenta refleja Ca ^{2 +} vinculante a la jaula nonphotolysed. La trama de la muestra de amplitud PBD para la fase de rápido y lento escala a la amplitud del compuesto de referencia como una función del factor de dependido tempe...

Discusión

El principio físico detrás de métodos fototérmica es que una molécula fotoexcitado disipa el exceso de energía a través de la relajación vibracional al estado fundamental, lo que resulta en el calentamiento térmico de la ^1,12 disolvente circundante. Para disolventes tales como agua, esto produce una rápida expansión de volumen (? V _ª). Moléculas en estado excitado también pueden someterse a procesos fotoquímicos que producen cambios de volumen no térmicos _(nonth? V) debido a la escisión ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-1,2-diaminoetano-N,N,N',N' -Ácido tetraacético	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofeno, compuesto de calcio de jaula, mantenga las soluciones madre en la oscuridad para evitar la fotodisociación
Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N′ -(Ácido 2-etanosulfónico)	Tampón Sigma Adrich	0909C	HEPES
Ferricianuro de potasio (III)	Sigma Aldrich	702587	compuesto de referencia para mediciones de PBD
cromato de sodio	Sigma Aldrich	307831	compuesto de referencia para mediciones de PBD
Diodo láser He-Ne 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	uso como haz de sonda para mediciones de PBD
Osciloscopio,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz con banda
láser Nd:YAG	Continuum	ML II	haz de bomba para mediciones de PBD
M355; Espejo láser Nd:YAG	Espejo láser Edmund Optics	47-324	para línea láser de 355 nm
M1 y M2; Espejo de diodo láser	Edmund Optics	43-532	visilbe espejo plano láser, rango de longitud de onda 300-700 nm
P1 y P2; Diafragma de iris	Edmund Optics	62-649	orificio de alfiler para dar forma a la sonda y los haces de pum
L1; lente biconvexa	Thorlabs	LB1844	una lente para enfocar el haz de la sonda en el detector, EFL 50 mm, rango de longitud de onda 350-2.000 nm
DM, espejo dicroico	Thorlabs	DMLP505	un espejo dicroico de paso largo con una longitud de onda de corte de 505 nm
F1; Filtro de borde	Andower	500FH90-25	un filtro de paso largo con una longitud de onda de corte de 500 nm
Soporte de cubeta con control de temperatura	Quantum Northwest	FLASH 300