Submillisecond Cambios conformacionales en proteínas resueltas por fototérmica Desviación de haz

Resumen

Aquí se presenta una aplicación de la técnica de deflexión de haz fototérmica en combinación con un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, para supervisar microsegundos y milisegundos dinámica y de la energética de cambios estructurales asociados con la asociación de calcio a un sensor de calcio neuronal, elemento regulador aguas abajo Antagonista Modulador .

Resumen

Desviación del rayo fototérmica junto con fotoacústica calorimetría y rallado térmica pertenece a la familia de métodos fototérmicos que controlar el volumen y el tiempo de entalpía perfil cambios de luz inducidos cambios conformacionales en proteínas en microsegundos a milisegundos escalas de tiempo que no son accesibles mediante parada tradicional instrumentos de flujo. Además, puesto que se sondean cambios globales en el volumen y / o entalpía, estas técnicas se pueden aplicar a las proteínas y otras biomacromoléculas que carecen de un fluoróforo y una etiqueta o cromóforo. Para monitorear la dinámica y energética de los cambios estructurales asociados con Ca ^{2 +} vinculante a los transductores de calcio, tales sensores de calcio neuronales, un compuesto de calcio enjaulado, DM-nitrofen, se emplea para la foto-trigger un rápido aumento (τ <20 microsegundos) en el calcio libre concentración y el volumen asociado y entalpía cambios se probaron utilizando la técnica de deflexión de haz fototérmica.

Introducción

Métodos foto-térmica, como la calorimetría fotoacústica, desviación del rayo fototérmica (PDB), y rallado transitorias acoplado con excitación láser de nanosegundos representan una poderosa alternativa a los transitorios espectroscopias ópticas para los estudios con resolución temporal de los intermedios de corta duración ^1,2. En contraste con las técnicas ópticas, como la absorción transitoria y espectroscopia de IR, que supervisan el perfil de tiempo de los cambios de absorción en el cromóforo circundante; técnicas fototérmicos detectar la dependencia del tiempo de los cambios de calor / volumen y por lo tanto son herramientas valiosas para la investigac....

Protocolo

1. Preparación de muestra

1. Llevar a cabo la preparación de la muestra y todas las manipulaciones de la muestra en un cuarto oscuro para prevenir un uncaging no deseado.
2. Solubilizar DM-nitrofen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoxifenil) - N, N, N ', N'-tetrakis [(oxi-carbonilo) metil] -1,2-etanodiamina) en HEPES 50 mM tampón, mM de KCl, pH 7,0 a una concentración final de 400 mM 100 (ε _{350 nm} = 4330 M ^-1 cm ^{-1 9).}
3. Añadir _CaCl2 de la solución madre 0,1 M para conseguir una proporción deseable de [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrofen]. Para las proteínas con _Kd para el Ca ^{2 +<....}

Resultados

Un ejemplo representativo de PBD traza de Ca ^{2 +} foto de liberación de Ca ^{2 +} DM-nitrofen se muestra en la Figura 3. La fase rápida corresponde a la foto-disociación de Ca ^{2 +} DM-nitrofen y Ca ^{2 +} liberación, mientras que la fase lenta refleja Ca ^{2 +} vinculante a la jaula nonphotolysed. La trama de la muestra de amplitud PBD para la fase de rápido y lento escala a la amplitud del compuesto de referencia como una función del factor de dependido tempe.......

Discusión

El principio físico detrás de métodos fototérmica es que una molécula fotoexcitado disipa el exceso de energía a través de la relajación vibracional al estado fundamental, lo que resulta en el calentamiento térmico de la ^1,12 disolvente circundante. Para disolventes tales como agua, esto produce una rápida expansión de volumen (? V _ª). Moléculas en estado excitado también pueden someterse a procesos fotoquímicos que producen cambios de volumen no térmicos _(nonth? V) debido a la escisión .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)-1,2-diaminoetano-N,N,N',N' -Ácido tetraacético	Life Technologies	D-6814	DM-nitrofeno, compuesto de calcio de jaula, mantenga las soluciones madre en la oscuridad para evitar la fotodisociación
Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanosulfónico, N-(2-Hidroxietil)piperazina-N′ -(Ácido 2-etanosulfónico)	Tampón Sigma Adrich	0909C	HEPES
Ferricianuro de potasio (III)	Sigma Aldrich	702587	compuesto de referencia para mediciones de PBD
cromato de sodio	Sigma Aldrich	307831	compuesto de referencia para mediciones de PBD
Diodo láser He-Ne 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	uso como haz de sonda para mediciones de PBD
Osciloscopio,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz con banda
láser Nd:YAG	Continuum	ML II	haz de bomba para mediciones de PBD
M355; Espejo láser Nd:YAG	Espejo láser Edmund Optics	47-324	para línea láser de 355 nm
M1 y M2; Espejo de diodo láser	Edmund Optics	43-532	visilbe espejo plano láser, rango de longitud de onda 300-700 nm
P1 y P2; Diafragma de iris	Edmund Optics	62-649	orificio de alfiler para dar forma a la sonda y los haces de pum
L1; lente biconvexa	Thorlabs	LB1844	una lente para enfocar el haz de la sonda en el detector, EFL 50 mm, rango de longitud de onda 350-2.000 nm
DM, espejo dicroico	Thorlabs	DMLP505	un espejo dicroico de paso largo con una longitud de onda de corte de 505 nm
F1; Filtro de borde	Andower	500FH90-25	un filtro de paso largo con una longitud de onda de corte de 500 nm
Soporte de cubeta con control de temperatura	Quantum Northwest	FLASH 300