Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.
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Artículo de método
Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas
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Resumen
Resumen
Los lípidos y proteínas en células eucariotas se intercambian continuamente entre los compartimentos celulares, a pesar de que estos conservan su composición y funciones distintivo a pesar de la intensa tráfico interorganelle molecular. Las técnicas descritas en este documento son poderosos medios de estudiar las proteínas y la movilidad de los lípidos y el tráfico in vivo y en su entorno fisiológico. La recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) se utilizan ampliamente técnicas de formación de imágenes en vivo de células para el estudio de tráfico intracelular a través de la vía endocítica-exo, la continuidad entre orgánulos o subcompartimentos, la formación de complejos de proteínas, y la proteína de localización en microdominios lipídicos, todos los cuales se pueden observar en condiciones fisiológicas y patológicas. Las limitaciones de estos enfoques se deben principalmente a la utilización de las proteínas de fusión fluorescentes, y sus posibles desventajas incluyen artefactos sobreexpresande iones en las células y la posibilidad de diferencias en el plegamiento y la localización de las proteínas etiquetadas y nativas. Por último, como el límite de resolución de la microscopía óptica (aproximadamente 200 nm) no permitir la investigación de la estructura fina de la sala de emergencias o los subcompartimentos específicos que puede originarse en las células bajo estrés (es decir, la hipoxia, la administración del fármaco, la expresión sobre-de transmembrana proteínas residentes ER) o bajo condiciones patológicas, combinamos imágenes de células vivas de las células transfectadas cultivadas con ultraestructural análisis basado en la microscopía electrónica de transmisión.
Introducción
El descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes espectrales, y el desarrollo paralelo de la microscopía de fluorescencia, se han abierto por completo nuevas avenidas para la investigación del comportamiento de proteínas en las células. Técnicas tales como la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP), que son posibles debido a la capacidad intrínseca de fluoróforos para extinguir su fluorescencia bajo iluminación intensa, se basan en imágenes de células vivas confocal y el uso de transfectaron proteínas de fusión fluorescente 1-3. Son ampliamente utilizados para evaluar no sólo la localización de las proteínas, sino también su movilidad y el transporte vesicular, que puede revelar pistas importantes en cuanto a su función 4.
La característica única de las células eucariotas es la presencia de compartimentos intracelulares que tienen composiciones de lípidos y de proteínas específicas. Aunque orgánulos son físicamente isolated, que necesitan comunicarse unos con otros y compartir componentes moleculares con el fin de mantener la homeostasis celular. La vía secretora garantiza que las proteínas y lípidos sintetizados en el ER llegar al destino final correcto en el que ejercen su función. Orgánulos intracelulares también se pueden conectar por los sitios de contacto dinámicos que permiten a las moléculas (lípidos) para ser intercambiados directamente entre compartimentos. Además, muchas proteínas tienen que reunidos en grandes complejos heteroméricos o asociada a determinadas especies de lípidos (balsas lipídicas / microdominios) para llegar a ser funcionalmente activo o ser transportado a su destino final. Todos estos aspectos biológicos influyen en gran medida las propiedades cinéticas de las proteínas, y por lo tanto puede ser investigado apropiadamente por medio de las técnicas descritas a continuación.
Nuestro grupo ha utilizado ampliamente FRAP y FLIP combinado con microscopia electrónica para estudiar la arquitectura de la sala de emergencia y de sus subsistemasdominios. El ER es la primera estación de la vía secretora y juega un papel clave en proteínas y lípidos de clasificación 5. Es un orgánulo muy dinámico cuya subdominios distintos reflejar sus muchas funciones diferentes (es decir, las proteínas y la biosíntesis de lípidos y la trata de personas, plegamiento de proteínas, Ca 2 + de almacenamiento y liberación, y el metabolismo de xenobióticos). Sin embargo, a pesar de que son morfológicamente, espacialmente, y funcionalmente distintos, estos dominios son continuas entre sí, y su abundancia relativa se pueden modificar en las células bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Los más conocidos y dominios generalmente espacialmente segregados de la sala de emergencias son la envoltura nuclear, y el RE liso y áspera, sin embargo, nosotros y otros han demostrado que hay estructuras ER con una arquitectura más elaborada y la organización tridimensional en varios tipos de células y tejidos en condiciones fisiológicas que también pueden ser inducidos por medio de estímulos estresantes tales como la hipoxia, la drogala administración, o la sobre-expresión de proteínas transmembrana-ER residente 2,6 (y las referencias en él).
Recientemente, también hemos demostrado la presencia de tales estructuras en los modelos celulares de enfermedades humanas 1,7. Procedentes de las cisternas apiladas de RE liso, se les dio el nombre colectivo de retículo endoplásmico liso organizada (RPEO) en 2003 6, a pesar de que también se conocen como karmellae, laminillas y ER cristaloide sobre la base de su arquitectura, que, al igual que su tamaño, puede variar. Después de que las células son transfectadas con GFP fusionado a la región citosólica de cola-anclado (TA) proteínas ER-residente (d EGFP-ER), la tendencia débilmente dimerizing de GFP en trans altera dramáticamente la organización y estructura de la sala de emergencias. FRAP y FLIP experimentos mostraron que d EGFP-ER es libre de difundirse dentro de RPEO, y el hecho de que se mueve desde el ER reticular a la RPEO y viceversa </ Em>, indica que los agregados son continuas con la ER reticular circundante. El análisis ultraestructural nos ha permitido correlacionar los datos de fluorescencia con una descripción detallada de la arquitectura RPEO y organización a nivel de nanoescala: RPEO siempre están compuestos de pilas de cisternas emparejado del RE liso pero pueden tener diferentes formas de organización espacial, como dispuestos regularmente sinusoidal matrices o espirales o matrices tubulares "cristaloides" hexagonales. Estos reordenamientos conducen a morfologías cúbicos 8 que, ya que se han encontrado en las células bajo condiciones fisiológicas 9 y siguientes tensiones tales como la hipoxia 10, el tratamiento de drogas 11, y el cáncer 9, pueden tener un potencial significativo como marcadores ultraestructurales.
Después de esta primera demostración del uso de proteínas de fusión GFP, utilizamos los experimentos de imagen para analizar la proliferación de dominios ER en respuesta a los tratamientos farmacológicos 12, assess la tendencia de las proteínas fluorescentes para oligomerise en las células 13, y para investigar el papel de un mutante, ALS ligado a proteína TA en la formación de agregados intracelulares de origen ER que pueden ser relevantes para su 1,8 patogenicidad. Se ha sugerido que la formación de agregados intracelulares (que se produce en muchas enfermedades neurodegenerativas 14) puede ser un mecanismo protector diseñado para evitar las interacciones entre las proteínas mutantes tóxicos y los componentes de las células circundantes 15.
Lo que sigue es una descripción de una combinación de métodos de microscopía óptica y electrónica para la investigación de las construcciones cuyo C-terminal de dominios hidrofóbicos se insertan en la membrana del ER, y un análisis de su comportamiento dinámico y los efectos de su sobre-expresión de dominio ER arquitectura en células cultivadas (véase la Figura 1 para un diagrama de flujo del protocolo experimental).
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Protocolo
1. El plásmido, cultivo celular, y la transfección con ER proteínas fluorescentes
- El plásmido usado en este estudio consiste en una versión mejorada de GFP fusionada en su extremo C-terminal a la región de la cola de la isoforma ER de rata citocromo b (5) (abreviado aquí como B (5)) a través de una secuencia de engarce. La región de la cola contiene toda la secuencia (Pro94-Asp134) que permanece asociado a la membrana después de la escisión de tripsina de B nativa (5), incluyendo el TMD 17-residuo (dominio transmembrana), flanqueado por secuencias polares aguas arriba y aguas abajo (UPS y DPS) . El enlazador consiste en el epítopo myc seguido de [(Gly) 4 Ser] 3, y todo el ADNc se insertó en los sitios Hind3-Xba1 del vector de expresión de mamíferos pCDNA3. Los detalles de la construcción de este plásmido se han descrito en una publicación anterior en la que se conoce como GFP-ER 16.
- Crecer células COS-7 en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de queso Fetal de suero bovino, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina en una incubadora a 37 ° C y 10% de CO 2.
- La transfección. Placa 3 x 10 5 células sobre un cubreobjetos de vidrio redonda en una placa de 6 pocillos y, al día siguiente, transfectar con el sistema JetPEI como se describe por el fabricante. Tenga en cuenta que la relación JetPEI / ADN óptima ha sido probado con el fin de establecer la máxima eficiencia de la transfección dependiendo de la plásmido y la línea celular utilizada: en nuestro caso, un JetPEI: relación de ADN de 2:01 conduce a 70-80% de eficiencia de transfección.
2. Vivo de fluorescencia confocal de barrido Microscopía
- Imágenes de células vivas. Coloque el cubreobjetos en la que las células transfectadas se sembraron en una cámara de cultivo celular de acero para cubreobjetos 24 mm relleno con DMEM w / o rojo de fenol, suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% penicilina / estreptomicina, 25 mM de HEPES , 50 mg / ml de cicloheximida y 1:100 OxyFluor para evitar que las muestras de photobleaching. Un microscópicas confocal SP5e equipado con una incubadora de CO2 a temperatura controlada (37 º C y 5% CO 2) se utiliza para experimentos de imagen de células vivas, con d GFP-ER se visualizó usando un láser de 488 nm y un filtro de 525/50 emisión del paso de banda.
- Recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP). Dibujar una región de interés (ROI), correspondiente a una estructura Oser y lejía usando 20 iteraciones y una combinación de 488 nm (100% de un láser de 30 mW de argón, correspondiente a 5.5-6 mW en la muestra) y 405 nm (60% de una 30 mW diodo láser de 405, lo que corresponde a 11,6 mW en la muestra) láseres que, en nuestra experiencia, conduce a fotoblanqueo eficiente y rápida.
- Registre la recuperación de la fluorescencia en las regiones de interés blanqueados mediante la adopción de un único fotograma cada 10 segundos durante 10 minutos (tiempo de píxel = 1,61 microsegundos / px).
- Pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP). Dibuje un retorno de la inversión correspondiente a una estructura RPEO, y blanqueador como se describió anteriormente. El blanqueo se repite cada 30 segundos,y las imágenes post-blanqueamiento se registran cada 10 segundos durante 30 minutos (tiempo de píxel = 1,61 microsegundos / px).
- FRAP y el análisis de la FLIP. Todas las imágenes son analizadas utilizando software ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html ). En los experimentos FRAP, la recuperación de la fluorescencia de la ROI blanqueada se mide con el tiempo y se normalizaron a la fluorescencia total de células blanqueada, que siempre se comprueba para ser constante en el tiempo.
- Para los experimentos de FLIP, dibuje un retorno de la inversión fuera de los RPEO blanqueada y cubriendo toda la célula. Medir su intensidad de fluorescencia con el tiempo y normalizar para los niveles de fluorescencia de un retorno de la inversión dibujadas en una célula sin blanquear con el fin de corregir para cualquier disminución de la fluorescencia causada por la propia formación de imágenes.
- En todos los experimentos, se resta la señal de fondo (determinado en un área fuera de las células) de las intensidades fluorescentes de las regiones de interés. Por último, trazar los resultados utilizando Grsoftware aphPad Prism.
3. Análisis ultraestructural por Medio de Microscopía Electrónica de Transmisión
Dada la toxicidad de muchos de los reactivos, todos los procedimientos deben llevarse a cabo usando un laboratorio apropiado. abrigo y los guantes bajo una campana de humos.
- Después de retirar el cubreobjetos de la placa de Petri, fijar las células restantes cultivadas en la parte inferior del plato como una monocapa usando filtrada 2% de glutaraldehído en 0,1 M de tampón de cacodilato, pH 7,4, durante 10 min a temperatura ambiente.
- Raspar las células utilizando un raspador de teflón y transferirlos a 1,5 ml de tubos de Eppendorf. Sedimentar las células por medio de centrifugación a 9000 g durante 10 min. Eliminar el sobrenadante, añadir fijador fresco, y dejar toda la noche a 4 ° C.
- Lavar los pellets con el tampón, a continuación, después de fijar con una solución de 1% de tetróxido de osmio en tampón cacodilato durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Enjuague con agua Milli-Q, y en la mancha bloque con1% de acetato de uranilo en agua destilada durante entre 20-60 min.
- Deshidratar las muestras en el aumento de serie de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, y 100% durante 10 min cada uno), y se lava brevemente dos veces en óxido de propileno (15 min cada uno).
- Infiltrarse en las muestras en una mezcla de óxido de propileno + Epon (01:01) (de 2 horas para la noche).
- Insertar en resina epoxi Epon curado a 60 ° C durante al menos 24 horas.
- Sección los bloques de resina recortadas manualmente utilizando un ultramicrotomo LEICA UC6 equipado con un cuchillo de diamante 45 ° para obtener secciones con un espesor de 60-70 nm. Recoge las secciones sobre rejillas de cobre de malla 300.
- Teñir las secciones de la red con una solución saturada de acetato de uranilo (20 min) y citrato de plomo (7 min), lavar bien las rejillas sumergiéndolas en agua filtrada bidestilada, y déjelos secar a temperatura ambiente.
- Las rejillas teñidos se observan con un microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2, y las imágenes se capturaron con una bottcámara CCD montada om-con diferentes ampliaciones finales (generalmente van de 6,000-39,000 X).
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Resultados
La Figura 2 muestra un estudio FRAP ejemplo de la movilidad de la proteína. La movilidad de la proteína EGFP D-ER se demuestra por la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching rápida en RPEO blanqueados. Para el análisis cuantitativo, la media hora y la fracción celular se obtuvieron a partir de los datos medidos experimentalmente mediante el ajuste de la siguiente ecuación monoexponencial:
F (t) = F + mensaje (post F rec-F)
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Discusión
Los protocolos y métodos de formación de imágenes descritos en el presente documento se han utilizado para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes en el ER de las células vivas. También hemos analizado el efecto de la expresión sobre-de estas proteínas en la arquitectura de este compartimiento subcelular por medio de análisis ultraestructurales.
La combinación de imagen confocal de células vivas y microscopía electrónica representa...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Fundación Filarete por su ayuda y apoyo en la publicación de este artículo. También nos gustaría agradecer Centro Europeo di nanomedicina para el uso del microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) sin rojo de fenol | Invitrogen | 31053028 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Estreptococo | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamina 200 mM solución | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfección | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehído Grado I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Cacodilato de sodio Trihidrato | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Tetróxido de osmio Solución al 4% | Microscopía Electrónica Ciencia | 19150 | |
| Acetato de uranilo dihidrato | Sigma Aldrich | 73943 | |
| Óxido de propileno | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| Kit de medio de inclusión EPON | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Citrato de plomo | Microscopía electrónica Science | 17800 | |
| Centrífuga de sobremesa | Microscopio | 5415 D | |
| Leica Microsystems | TCS SP5 | ||
| Sistema de incubación en jaula de CO2 | OkoLab | ||
| Ultramicrotomo | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cuchillo de diamante | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Microscopio electrónico de transmisión | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Cámara de células de cultivo de acero para cubreobjetos de 24 mm | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Rejillas de microscopía electrónica Ciencia de | la microscopía electrónica | G300Cu |
Referencias
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