Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.
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Artículo de método
Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los lípidos y proteínas en células eucariotas se intercambian continuamente entre los compartimentos celulares, a pesar de que estos conservan su composición y funciones distintivo a pesar de la intensa tráfico interorganelle molecular. Las técnicas descritas en este documento son poderosos medios de estudiar las proteínas y la movilidad de los lípidos y el tráfico in vivo y en su entorno fisiológico. La recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) se utilizan ampliamente técnicas de formación de imágenes en vivo de células para el estudio de tráfico intracelular a través de la vía endocítica-exo, la continuidad entre orgánulos o subcompartimentos, la formación de complejos de proteínas, y la proteína de localización en microdominios lipídicos, todos los cuales se pueden observar en condiciones fisiológicas y patológicas. Las limitaciones de estos enfoques se deben principalmente a la utilización de las proteínas de fusión fluorescentes, y sus posibles desventajas incluyen artefactos sobreexpresande iones en las células y la posibilidad de diferencias en el plegamiento y la localización de las proteínas etiquetadas y nativas. Por último, como el límite de resolución de la microscopía óptica (aproximadamente 200 nm) no permitir la investigación de la estructura fina de la sala de emergencias o los subcompartimentos específicos que puede originarse en las células bajo estrés (es decir, la hipoxia, la administración del fármaco, la expresión sobre-de transmembrana proteínas residentes ER) o bajo condiciones patológicas, combinamos imágenes de células vivas de las células transfectadas cultivadas con ultraestructural análisis basado en la microscopía electrónica de transmisión.
Introducción
El descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes espectrales, y el desarrollo paralelo de la microscopía de fluorescencia, se han abierto por completo nuevas avenidas para la investigación del comportamiento de proteínas en las células. Técnicas tales como la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP), que son posibles debido a la capacidad intrínseca de fluoróforos para extinguir su fluorescencia bajo iluminación intensa, se basan en imágenes de células vivas confocal y el uso de transfectaron proteínas de fusión fluorescente 1-3. Son ampliamente utiliza....
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Protocolo
1. El plásmido, cultivo celular, y la transfección con ER proteínas fluorescentes
- El plásmido usado en este estudio consiste en una versión mejorada de GFP fusionada en su extremo C-terminal a la región de la cola de la isoforma ER de rata citocromo b (5) (abreviado aquí como B (5)) a través de una secuencia de engarce. La región de la cola contiene toda la secuencia (Pro94-Asp134) que permanece asociado a la membrana después de la escisión de tripsina de B nativa (5), incluyendo el TMD 17-residuo (dominio transmembrana), flanqueado por secuencias polares aguas arriba y aguas abajo (UPS y DPS) . El enlazador consiste en el epítopo myc seguido de [(Gly)
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Resultados
La Figura 2 muestra un estudio FRAP ejemplo de la movilidad de la proteína. La movilidad de la proteína EGFP D-ER se demuestra por la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching rápida en RPEO blanqueados. Para el análisis cuantitativo, la media hora y la fracción celular se obtuvieron a partir de los datos medidos experimentalmente mediante el ajuste de la siguiente ecuación monoexponencial:
F (t) = F + mensaje (post F rec-F)
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Discusión
Los protocolos y métodos de formación de imágenes descritos en el presente documento se han utilizado para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes TA transfectadas residentes en el ER de las células vivas. También hemos analizado el efecto de la expresión sobre-de estas proteínas en la arquitectura de este compartimiento subcelular por medio de análisis ultraestructurales.
La combinación de imagen confocal de células vivas y microscopía electrónica representa.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Fundación Filarete por su ayuda y apoyo en la publicación de este artículo. También nos gustaría agradecer Centro Europeo di nanomedicina para el uso del microscopio electrónico de transmisión Tecnai G2.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) sin rojo de fenol | Invitrogen | 31053028 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Estreptococo | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamina 200 mM solución | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfección | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase Inc. | OF-0005 | |
| Glutaraldehído Grado I | Sigma Aldrich | G5882 | |
| Cacodilato de sodio Trihidrato | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Tetróxido de osmio Solución al 4% | Microscopía Electrónica Ciencia | 19150 | |
| Acetato de uranilo dihidrato | Sigma Aldrich | 73943 | |
| Óxido de propileno | Sigma-Aldrich | 82320 | |
| Kit de medio de inclusión EPON | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Citrato de plomo | Microscopía electrónica Science | 17800 | |
| Centrífuga de sobremesa | Microscopio | 5415 D | |
| Leica Microsystems | TCS SP5 | ||
| Sistema de incubación en jaula de CO2 | OkoLab | ||
| Ultramicrotomo | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cuchillo de diamante | Diatome | Ultra 45 ° | |
| Microscopio electrónico de transmisión | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc | ||
| Cámara de células de cultivo de acero para cubreobjetos de 24 mm | Bioscience Tools | CSC-25 | |
| Rejillas de microscopía electrónica Ciencia de | la microscopía electrónica | G300Cu |
Referencias
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
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