Artículo de método

Nucleofection de roedores neuroblastos para el Estudio de la Migración Neuroblast

DOI:

10.3791/50989

⸱

12 de noviembre de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, 2MRC Centre for Developmental Neurobiology, King's College London

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migración de los neuroblastos es un paso crucial en la neurogénesis postnatal. El protocolo se describe aquí se puede utilizar para investigar el papel de los reguladores candidatos de la migración de los neuroblastos mediante el empleo de ADN / ARN de horquilla pequeña (shRNA) nucleofection y un ensayo de migración de neuroblastos 3D con aislados de la corriente migratoria rostral posnatal roedor.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La zona subventricular (SVZ) situado en la pared lateral de los ventrículos laterales juega un papel fundamental en la neurogénesis adulta. En este área restringida del cerebro, células madre neurales proliferan y generan constantemente neuroblastos que migran tangencialmente en cadenas a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) para alcanzar el bulbo olfatorio (OB). Una vez en el OB, los neuroblastos cambiar a la migración radial y a continuación, se diferencian en neuronas maduras capaces de incorporar en la red neuronal preexistente. La migración de los neuroblastos adecuada es un paso fundamental en la neurogénesis, lo que garantiza la correcta maduración funcional de las neuronas recién nacidas. Dada la capacidad de los neuroblastos derivados de ZVS para apuntar a áreas lesionadas en el cerebro, la investigación de los mecanismos intracelulares que subyacen a su movilidad no sólo mejorará la comprensión de la neurogénesis, pero también puede promover el desarrollo de estrategias de neurorregenerativas.

Este manuscrito describe un detalladoprotocolo para la transfección de roedor primario RMS neuroblastos postnatales y el análisis de su motilidad utilizando un ensayo in vitro de 3D ​​en la migración recapitulando su modo de migración observada in vivo. Ambos neuroblastos rata y ratón pueden ser rápida y eficiente a través de nucleofection transfectadas con el plásmido de ADN, pequeña horquilla (sh) ARN corto de interferencia o (si) oligos de ARN objetivo genes de interés. Para el análisis de la migración, las células se nucleofected reaggregated en 'gotas colgantes, y posteriormente embebidos en una matriz tridimensional. Nucleofection per se no menoscabe significativamente la migración de los neuroblastos. El tratamiento farmacológico de los neuroblastos nucleofected y reaggregated también se puede realizar para estudiar la función de las vías de señalización implicadas en la migración de los neuroblastos.

Introducción

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En el cerebro de mamífero posnatal, la generación de nuevas neuronas (neurogénesis) se produce durante toda la vida y se limita a dos nichos neurogénicos: la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la zona subgranular de la circunvolución dentada del hipocampo 1. Varios estudios recientes han demostrado el importante papel de la neurogénesis adulta en la facilitación de las tareas de aprendizaje y memoria 2,3. Además, la evidencia de la proliferación y el reclutamiento de células progenitoras neurales después de una lesión cerebral 4-7 plantea la posibilidad de la activación farmacológica de la neurogénesis en la reparación neural.

Neurogénesis postnatal es regulado estrictamente en todas sus fases, que incluyen la proliferación neuronal progenitor, migración, diferenciación, supervivencia, y la integración sináptica definitiva de neuronas recién nacidas 8. Progenitores neurales (neuroblastos) derivadas de células madre en la ZVS migran a grandes distancias a través de la migratoria rostralcorriente (RMS) hacia el bulbo olfatorio (OB), donde maduran hasta convertirse en neuronas funcionales 9. Neuroblastos migratorios son predominantemente unipolar, con un cuerpo celular alargado que se extiende un único proceso de liderazgo. Estas células se mueven en las cadenas de una manera colectiva, deslizando una sobre la otra 10. La migración es un paso crucial para la posterior maduración de los progenitores derivados de SVZ en neuronas funcionales 11 y es controlado por múltiples factores y moléculas de orientación incluyendo: molécula de adhesión celular neural polisialiladas (PSA-NCAM) 12, Efrinas 13, integrinas 14, aberturas 15, factores de crecimiento y neurotransmisores 16 17, sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso no se entiende completamente. La investigación de las vías de señalización intracelular que regulan la migración de neuroblastos no sólo proporcionará una mejor comprensión de la neurogénesis adulta, sino que también contribuirá al desarrollo de la nueva terapéuticaenfoques para promover la reparación del cerebro.

Este manuscrito describe un protocolo detallado para estudiar el papel de los reguladores de candidatos de la migración de los neuroblastos in vitro utilizando nucleofection y un ensayo de migración 3D. Nucleofection es una técnica de transfección de células basado en un método mejorado de electroporación. Corriente eléctrica específica de tipo celular y solución nucleofection permiten la transferencia de macromoléculas polianiónicos tales como ADN y shRNA vectores y siRNA oligonucleótidos directamente en el núcleo de la célula y permiso de transfección de dividir lentamente o mitóticamente inactivas las células como neuronas embrionarias de mamíferos y 18. Este método es rápido, relativamente fácil de realizar y los resultados en la transfección altamente reproducible de una amplia gama de tipos de células incluyendo los neuroblastos primarios y las neuronas 19-21.

La disociación de tejido RMS permite el aislamiento de los neuroblastos migratorios, que puede ser nucleofected con éxito con ADN / SHRVectores NA o oligos siRNA dirigidos genes de interés. Tras nucleofection, neuroblastos se reaggregated en gotas colgantes y posteriormente embebidos en una matriz de Matrigel en tres dimensiones. Estas condiciones permiten a los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares que recapitulan el modo de migración observado in vivo, proporcionando así un excelente sistema modelo para investigar las vías de señalización implicadas en la migración de los neuroblastos y para evaluar la influencia de los tratamientos farmacológicos en la motilidad de estas células.

Protocolo

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Este procedimiento es conforme a los reglamentos del RU Home Office (Ley de Procedimientos Científicos Animal, 1986). Los científicos deben seguir las directrices establecidas y aprobadas por sus órganos reguladores animales institucionales y nacionales.

1. Disección y disociación de rata RMS neuroblastos

  1. Preparar las soluciones necesarias para la disección RMS y disociación:

Medio de disección (100 ml)
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) - 98,5 ml
5 M de HEPES, pH 7,4 a 0,5 ml
La penicilina-estreptomicina (10.000 unidades / ml y 10.000 g / ml) - 1 ml

Medio de disociación (2 ml)
HBSS - 1.760 ml
10x Tripsina (2,5%) - 200 l
Dnase1 (1 mg / ml) - 40 l

Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) + 10% de suero de ternera fetal (FCS) (40 ml)
DMEM -36 ml
FCS - 4 ml

El medio completo (12 ml)

Medianas Neurobasal - 11,46 ml
B27 Suplemento - 250 l
L-Glutamina (200 mm) - 125 l
Glucosa (45%) - 165 l

2. Filter-esterilizar el% de FCS DMEM + 10 y el medio completo y preequilibrate en un 37 ° C / 5% de CO 2 incubadora.

  1. Disección
    1. Sacrificar una camada de ratas P6-P7 (unos 12 cachorros) por dislocación cervical y decapitar con unas tijeras.
    2. Hacer una incisión anteroposterior en la piel a lo largo de la sutura sagital medial desde la nariz hasta el cerebelo con una hoja de bisturí. Pelar la piel y repita la misma incisión a lo largo del cráneo.
    3. Retire suavemente las aletas craneales con fórceps y retirar con cuidado el cerebro con una espátula, teniendo cuidado de incluir los bulbos olfatorios.
    4. Cortar el tercero más caudal del cerebro y lo descarta.
    5. Picar ªe tejido cerebral en 1,4 mm de espesor rebanadas coronales utilizando un cortador de tejidos.
    6. Coloque las rebanadas en platos que contenían medio disección fría y separe con cuidado usando una aguja.
    7. El RMS aparece como un triangular, zona translúcida en el centro de las secciones de obstetricia y como una pequeña área circular en rodajas de cerebro más caudales. Cortar las RMS de cada rebanada con un cuchillo microquirúrgico, teniendo cuidado de evitar la inclusión de tejido circundante. En crías de ratas P7, por lo general los ~ 8 rebanadas más rostral (incluyendo OB) contienen el RMS.
    8. Recoger los fragmentos de RMS con una pipeta Pasteur de plástico y colocarlos en un plato pequeño que contiene medio de disección en frío en hielo.
    9. Cuando la disección es completa, la transferencia de los fragmentos de RMS en un tubo de 15 ml con una pipeta de plástico. Deja fragmentos para ubicarse en la parte inferior del tubo.
  2. Disociación
    1. Sustituya el medio de disección con 2 ml de medio de disociación.
    2. Se tritura los fragmentos de RMS por suavemente pipetting la suspensión de fragmentos de arriba abajo sobre 10 veces con una pipeta P1000.
    3. Deje el tubo con los fragmentos de tejido en un 37 ° C baño de agua durante 2 min.
    4. Pipetear la solución de nuevo 10 veces y asegurarse de que los fragmentos han disociado (la suspensión debe enturbiarse).
    5. Inactivar la tripsina mediante la adición de 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS.
    6. Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min.
    7. En la alícuota Mientras tanto, la cantidad requerida de ARNsi / ADN en tubos de Eppendorf (generalmente 3-5 g de ADN / shRNA o 5-9 ARNsi g oligo por nucleofection, sin embargo, la cantidad de ADN / ARNsi puede requerir optimización).
    8. Retire el exceso de medios y resuspender el botón celular por pipeteo suave en 5 ml de DMEM precalentado + 10% FCS.
    9. Realizar un recuento de células. Esperar ~ 1 × 10 6 células por rata cachorro cerebro. Se requiere un mínimo de 2,5 x 10 6 células por cada nucleofection, mientrasresultados óptimos se logran utilizando 3-4 x 10 6 células por nucleofection.
    10. Centrifugar la suspensión de células a 433 xg durante 5 min. Asegúrese de eliminar la mayor cantidad media de lo posible.

2. Nucleofection

  1. Inmediatamente resuspender el sedimento de células en ratas (o el ratón si el uso de células de ratón) solución nucleofection neurona previamente se incubó a temperatura ambiente. Utilice 100 l por nucleofection Nota:. Típicamente una camada de ratas de 12 crías es suficiente para llevar a cabo 4 nucleofections y una camada de ratón (12 cachorros) es suficiente para llevar a cabo 2 nucleofections.
  2. Transferir 100 l de la suspensión celular a cada tubo Eppendorf que contenía ARNsi / ADN y mezclar suavemente 2-3x por pipeteado con una pipeta P200.
  3. Añadir la muestra (suspensión cell-DNA/siRNA) a la parte inferior de la nucleofectioncuvette, teniendo cuidado de evitar burbujas.
  4. Nucleofect mediante el programa G-013 (para las células de rata) o O-005 (paracélulas de ratón). Uno nucleofection tarda aproximadamente 5 seg.
  5. Añadir rápidamente 1 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS a la muestra nucleofected.
  6. Repita los pasos 2,4 y 2,5 para el resto de las muestras. Nota: para obtener resultados óptimos, todo el procedimiento nucleofection no debe durar más de 5 minutos.
  7. Transfiera cada muestra a un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de DMEM precalentado + 10% de FCS utilizando la pipeta de plástico proporcionado por el kit nucleofection. Evitar la transferencia de cualquier residuo celular para el tubo.
  8. Centrifugar las muestras a 433 xg durante 5 min.
  9. Quite cuidadosamente todo exceso de medio y resuspender el precipitado en 25 a 30 l de precalentado DMEM + FCS al 10% utilizando una pipeta P20. No utilice más de 30 l de medio.
  10. Pipetear la suspensión como una gota en el lado interior de una tapa de la placa de p35.
  11. Invertir la tapa sobre el plato de p35 que contiene 2 ml de medio completo (véase también la Figura 1).
  12. Deja en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante almenos de 5 horas y un máximo de 7 horas. Un mayor tiempo de incubación permite una mejor reagregación de grupos de células.
  13. Transfiera las gotas que cuelgan de la tapa en el medio completo en el plato con una pipeta P1000 con una punta de corte.
  14. Se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante 24 h para nucleofections de ADN y 48 h para nucleofections siRNA / shRNA.

3. Incorporación

  1. Preparar medio completo (25 ml) y preequilibrate que a 37 ° C / 5% de CO 2 durante unas pocas horas.
  2. Saque las alícuotas congeladas de la matriz de la membrana basal de -80 ° C congelador y descongelar en hielo en la cámara frigorífica.
  3. Para cada nucleofection preparar un plato de 6 cm que contiene hasta ocho 13 mm coverlips estériles.
  4. Colocar las cápsulas en una caja de hielo cubierta con papel film. Es importante mantener los cubreobjetos fresco para evitar la solidificación de la matriz durante el procedimiento de incrustación.
  5. Para mantener la humedad, coloque una tira de tejido húmedo dentro de un plato de 15 cm que wenfermo puede utilizar para almacenar hasta tres placas de 6 cm que contienen los neuroblastos embebidos.
  6. Añadir medio completo a la matriz descongelada en una relación de 01:03. Por ejemplo, mezclar 40 l de medio completo con 120 l de la matriz con la pipeta. Esta cantidad de matriz es suficiente para incrustar agregados en ocho cubreobjetos de 12 mm.
  7. La transferencia de los grupos de células reaggregated a un tubo de 15 ml y centrifugar a 433 xg durante 5 min.
  8. Retire el exceso de medios y resuspender el precipitado en 10 l de medio completo.
  9. Coloque 2 l de suspensión de agregados de células en cada cubreobjetos estéril y añadir 18 l de matriz / mezcla de medio completo. Use la punta de la pipeta para ampliar la matriz a través de todo el cubreobjetos.
  10. Colocar inmediatamente el recipiente de 6 cm que contiene los cubreobjetos en el plato de 15 cm y dejar en la incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 15-20 min. Cuando la matriz se ha solidificado, añadir con cuidado 5 ml de medio completo a cada 6 cm plato toma el cuidado de empujarpor cualquier cubreobjetos flotante con una punta de pipeta.
  11. Incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% CO 2 para permitir que los neuroblastos migran fuera de los agregados celulares.

4. Ensayo de Migración 3D

  1. Preparar las soluciones necesarias para la inmunotinción.
    1. Prepare la solución de bloqueo:
      Solución de bloqueo de cabra (50 ml)
      Tampón fosfato salino (PBS) - 5 ml
      Suero de cabra - 7,5 ml
      10% de Triton X-100 - 1,5 ml
      BSA - 50 mg
      H 2 O - 36 ml
    2. Se filtra y se almacena a 4 º C.
    3. Preparar la solución de fijación:
      La fijación de solución (100 ml)
      El paraformaldehído (PFA) - PRECAUCIÓN 4 g: siempre manejar PFA bajo una campana
      La sacarosa - 20 g (opcional)
      PBS hasta 100 ml
    4. En un plato caliente y con agitación constante disolver la PFA en 80 ml de PBS mantuvo a 65 ° C.
    5. Una vez que la PFA se haya disuelto, añadir 20 g de sacarosa.
    6. Ajustar el pH a7.4 (por lo general mediante la adición de ~ 60 l 1 M NaOH por 100 ml de solución).
    7. Llevar a un volumen total de 100 ml con PBS.
  2. La inmunotinción
    1. Coloque cubreobjetos en una placa de 24 pocillos.
    2. Enjuague cubreobjetos con PBS 2x.
    3. Fijar los agregados neuroblast RMS con solución fijadora durante 45 minutos a temperatura ambiente.
    4. Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado - en una plataforma oscilante).
    5. Bloquee durante 30-60 min con solución de bloqueo de cabra.
    6. Diluir anticuerpos primarios en solución de bloqueo de cabra e incubar durante la noche a 4 ° C. (Si se desea, faloidina fluorescente (1:400) y el colorante Hoechst (1:10.000) pueden también ser añadidos a la solución de anticuerpo primario para visualizar la actina filamentosa y núcleos).
    7. Enjuague cubreobjetos con PBS 3 veces (5 min / lavado).
    8. Diluir los anticuerpos secundarios de cabra en solución de bloqueo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.
    9. Enjuague coverslips con PBS 3 veces (5 min / lavado)
    10. Monte cubreobjetos con medio de montaje fluorescente y dejar secar al aire durante la noche a temperatura ambiente.
  3. Análisis de migración
    1. Captura de imágenes de agregados neuroblast RMS fijos con un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de 10X. Incluye una barra de escala de la imagen de una muestra en.
    2. Para configurar la escala para la cuantificación, mida la barra de escala en la imagen mediante la selección de la herramienta 'Recta' en la barra de herramientas ImageJ.
    3. Elija la opción "Analizar" y haga clic en 'establecer la escala'.
    4. En la ventana de escala establecida la "distancia conocida" y marque la casilla "global" para mantener la misma configuración para todas las mediciones.
    5. Utilice la herramienta de línea segmentada "en la barra de herramientas ImageJ para medir la distancia desde el borde de la suma a la más lejana neuroblast migrado en 6 sectores diferentes alrededor de todo el conjunto (Figura 3B). Considere sólo aislados agagregados para su análisis.
    6. Calcular una distancia media de migración desde los 6 valores obtenidos para cada agregado.
    7. Mida 10-20 agregados para cada condición en cada experimento y piscina resultados independientes de un mínimo de tres experimentos independientes. Incluya siempre un control nucleofection (GFP o un sh / control siRNA por ejemplo.).

Resultados

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Los neuroblastos se pueden aislar con éxito a partir de tejido disecado RMS (Figura 1A) y embebidos en una matriz tridimensional. Las células aisladas a partir de cualquiera de rata o de ratón postnatal de RMS son inmunopositivas para marcadores neuroblast migratorias, tales como doblecortina (DCX), tubulina βIII o PSA-NCAM (Figuras 1B-C).

Neuroblastos disociadas se pueden nucleofected de manera eficiente con el ADN (por ejemplo. Un plásmido de GFP-codificación, Figura 2) o plásmidos shRNA (Figura 4) para lograr el agotamiento de la proteína, que puede ser evaluado mediante análisis de transferencia Western (Figura 4B) o inmunofluorescencia (no se muestra) .

Las células nucleofected con plásmidos que codifican GFP migran radialmente hacia fuera racimos neuroblast reaggregated (Figura 3A). La cuantificación de la relativa distancia migrada 24 h después de la incorporación (Figura 3B) no muestra diferencias en la migración entre GFP-posit ive células y células nonnucleofected GFP-negativos (Figura 3C), lo que indica que nucleofection per se no interrumpe la migración. También hay ninguna diferencia significativa en la medida de la migración entre los neuroblastos nucleofected y neuroblastos migran directamente de explantes RMS (datos no presentados).

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Figura 1. La disección de los neuroblastos RMS. (A) Representación esquemática de la disección de los neuroblastos RMS. Para una descripción detallada, por favor referirse al texto. (B) Las células de rata RMS aislados son immunopositive para los fabricantes de neuroblastos migratorios DCX y tubulina βlll. Bar, 20 m. (C) Las células que migran fuera del RMS explantes ratón expresan la neuroblast migratoria marcadores DCX y PSA-NCAM. Bar, 20 micras.0989/50989fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Figura 2. Ratón nucleofection neuroblastos. Disociada ratón RMS neuroblastos se nucleofected con pMAX-GFP, reaggregated, incrustados en una matriz tridimensional y permite migrar durante 6 horas. Los neuroblastos migran fuera de un grupo de células reaggregated (superior, contraste de fase fotos) muestran una alta eficiencia de transfección (abajo, canal GFP fotos). Los paneles de las columnas de la derecha muestran altos cuadros de ampliación correspondientes a los recuadros resaltados en los paneles de la columna izquierda. Bares, 20 micras. Haz click aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 3. Migración de ensayo 3D. (A) neuroblastos de rata se nucleofected con pMAX-GFP (GFP) o pCAG-IRES-EGFP 22 (EV), reaggregated, incrustado en la matriz y de izquierda a migrar durante 24 h. Las células fueron fijadas y se inmunotiñeron para GFP (verde) y βIII tubulina (rojo). Bar, 50 m. (B) Medición de distancia de migración utilizando ImageJ. El grupo de células reaggregated está dividida en 6 sectores iguales. La distancia entre el borde de la agrupación (línea de puntos) y la célula migrado más lejos se mide para cada sector. (C) Cuantificación de la distancia relativa migró por las células nucleofected, células nonnucleofected (GFP-positivas) y de control (-GFP negativo) . Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

figure-results-4"Figura 4" fo: content-width = "6 pulgadas" src = "/ files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width = "500px" />
Figura 4. Monitoreo de la migración de los neuroblastos después shRNA nucleofection. (A) neuroblastos de rata se nucleofected con un shRNA vector de control (PCA-b-EGFPm5 silenciador 3, que también expresa EGFP 23) o el mismo vector que contiene una, una proteína actina-agrupación shRNA orientación Fascin 24. Las células fueron reaggregated más de 48 horas, embebidas en la matriz y se dejaron migrar durante 24 horas. Los agregados se fijaron y se inmunotiñeron para GFP (verde) y βIII tubulina (rojo). Bar, 50 m. (B) fascin Efectiva agotamiento se puede detectar 50 horas después de shRNA nucleofection por Western blot. La actina se muestra aquí como control de carga (C) Análisis cuantitativo de distancia de migración relativa mostrando que el agotamiento fascin entorpece seriamente la migración de los neuroblastos. (Media ± SEM; ** p <0.01, n = 3 experimentos independientes). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La migración de los neuroblastos a lo largo de los RMS a la ubicación final en el OB es un paso fundamental en la neurogénesis postnatal. Sin embargo, los mecanismos moleculares que controlan este proceso complejo están lejos de ser plenamente comprendido.

El procedimiento experimental descrito aquí permite el estudio de la migración de los neuroblastos in vitro. Hemos adaptado un protocolo previamente publicado para el aislamiento de los neuroblastos RMS de ratón o de rata postnatal temprano 25. Para lograr resultados óptimos es importante para dominar el paso de la disección, ya que es crucial para mantener el intervalo de tiempo entre la disección y nucleofection a un mínimo. Después de nucleofection, neuroblastos pueden reaggregated, incrustados en una matriz de tres dimensiones y se dejaron migrar durante un período de 24 horas. Alternativamente, para fines distintos de la migración (por ejemplo, inmunofluorescencia o análisis de transferencia Western), las células se pueden sembrar inmediatamente después de nucleofection en polyornithine/laminin-cubreobjetos recubiertos, donde sobreviven hasta 4-5 días. Ratón y rata neuroblastos migran en Matrigel en un grado similar, sin embargo las células de ratón parecen tener una tendencia más fuerte a migrar en las cadenas de que las células de rata.

Dependiendo del objetivo del estudio, los neuroblastos pueden nucleofected con diferentes plásmidos que codifican proteínas fluorescentes o proteínas de tipo / mutante silvestres de interés. Para los plásmidos de expresión de proteínas óptimos con un promotor CAG (promotor de β-actina con potenciador de CMV y β-globina cola poli-A) 26 son altamente recomendados. Por otra parte, oligos siRNA o plásmidos shRNA pueden nucleofected para derribar blancos de interés. Agotamiento de proteína eficaz puede ser visualizado por inmunofluorescencia o por Western blot (generalmente lisar agregados incrustados de 1 de rata crías con 50 l de tampón de lisis estándar).

Nucleofection es un método relativamente sencillo para transfectar neuroblastos primarios, ofrece una alternativa más fácil y más rápido a vitransfección mediada por vector RAL, y puede lograr alta (~ 70-80%) la eficacia de transfección. Es fundamental trabajar con rapidez durante el procedimiento nucleofection, desde que salió de neuroblastos en la solución nucleofection por un tiempo prolongado reduce drásticamente la viabilidad celular.

El rendimiento promedio de la celda de la disección RMS es relativamente baja para los ratones P7 (~ 5 x 10 5 células / cerebro) en comparación con las ratas P7 (~ 1 x 10 6 células / cerebro) y se requieren al menos 3 x 10 6 células por nucleofection para lograr la transfección con ~ 50% de eficiencia. Por otra parte, los neuroblastos de ratas parecen resistir mejor a nucleofection comparación con los neuroblastos de ratón. Por lo tanto, las crías postnatal temprano (P6-P7) de ratas podrían representar una fuente neuroblast conveniente, considerando también que la organización de rata y ratón RMS son notablemente simiLAR 27 y que el alcance de la rata y el ratón neuroblastos la migración in vitro también es comparable. Se recomienda no guardar los racimos reaggregated de neuroblastos nucleofected en suspensión durante más de 48 horas para evitar los efectos anormales en la morfología celular y la migración (nuestras observaciones no publicadas).

El ensayo 3D se describe aquí se puede utilizar para cuantificar la migración de neuroblastos en un punto de tiempo fijo después de la incrustación en la matriz (por ejemplo. 24 h). Los agregados de diferentes tamaños se pueden utilizar en el análisis, ya que no existe una correlación significativa entre el tamaño de los agregados y la distancia de migración (nuestras observaciones no publicadas). Para visualizar e investigar más a fondo la dinámica de la migración de los neuroblastos, time-lapse se puede utilizar. Se recomienda realizar el análisis de la migración dentro de un intervalo de 24 horas después de la incrustación, ya que la velocidad de neuroblastos parece disminuir drásticamente en los puntos de tiempo más largos (nuestras observaciones no publicadas).

Existen algunas limitaciones a este protocolo. En primer lugar, nucleofection hasta ahora se puede utilizar para principios de neuroblastos de roedores postnatales, mientras que la infección con vectores virales sigue siendo el método de transfección más eficaz para los neuroblastos adultos 28. En segundo lugar, el ensayo in vitro de la migración en no reproduce completamente la compleja arquitectura de los RMS observados in vivo. De hecho, aunque los neuroblastos mantienen la capacidad de migrar de una manera similar a sus contrapartes en vivo, en la configuración experimental descrito aquí que carecen de interacciones con otros componentes de RMS tales como astrocitos y los vasos sanguíneos, que también contribuyen a regular su motilidad 9,29, 30. Este problema puede ser abordado en el futuro mediante la optimización de los sistemas modelo de co-cultivo en tres dimensiones.

En conclusión, la combinación de nucleofection con un ensayo de migración 3D representa una herramienta valiosa para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacenla migración de los neuroblastos. Este procedimiento proporciona un método experimental inicial, rápido y relativamente sencillo para evaluar el papel de los reguladores de candidatos de la migración de los neuroblastos, que se pueden validar aún más por otros enfoques, como la electroporación in vivo postnatal y time-lapse de cultivos de cortes cerebrales 28,31,32 .

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por una subvención del Proyecto Fideicomiso Wellcome concedido a la EP y GL (089236/Z/09/Z). SG fue apoyado por una beca de doctorado de Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación. Agradecemos a Matthieu Vermeren para el tipo de regalo del vector shRNA y Jennifer Shieh de valiosos consejos sobre nucleofection neuroblastos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Penicilina-EstreptomicinaInvitrogen Life Technologies15140-122
2.5% Tripsina-EDTA (10x)Gibco15090-046tienda 200 µ l alícuotas en -20 °
C ADNasa I Vial (D2)WorthingtonLK003170≥ 1.000 unidades por vial; tienda 50 µ l alícuotas en -20 ° C
Dulbecco Medio de águila modificado (DMEM)Gibco11960-044
Suero fetal de ternera (FCS)HycloneSH3007902
Medio neurobasalGibco21103-049
B27 suplementoInvitrogen Life Technologies17504044
L-Glutamina (200 mM)Invitrogen Life Technologies25030-081
Solución de D-(+)-Glucosa (45%)Sigma-AldrichG8769
Matrigel Matriz de Membrana Basal, Factor de Crecimiento Reducido (GFR), Fenol Rojo, 10 ml, Libre de LDEVBD Biosciences356231 prepare 120 µ l alícuotas en 4 ° C, luego almacene a -80 ° C
PFASigma-Aldrich441242
sacarosaBDH102745C
Suero de cabraSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
BSAFisher ChemicalBPE9701-100
Medio de montaje de fluorescencia DakoDakoS3023
Kit de nucleofección de neurona de rataLonzaVPG-1003
Kit de nucleofección de neurona de ratónLonzaVPG-1001
Bisturí microquirúrgicoAngiotech7516
McIlwain picadora de tejidosThe Mickle Laboratory Engineering Company
Nucleofector IILonza

Referencias

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