El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.
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Artículo de método
Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
La eritropoyesis en los mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación que resulta en la formación de reticulocitos. El mecanismo de la enucleación aún no ha sido aclarada completamente. Un problema común encontrado al estudiar la localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación por microscopía es la dificultad de observar un número suficiente de células sometidas a enucleación. Hemos desarrollado un protocolo de análisis novela utilizando imágenes de multiparamétrico de alta velocidad en la célula de flujo (multi-espectral de imágenes Citometría de Flujo), un método que combina la microscopía de inmunofluorescencia con citometría de flujo, con el fin de identificar de manera eficiente un número significativo de eventos enucleación, que permite obtener mediciones y realizar el análisis estadístico.
En primer lugar, describimos aquí dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos murinos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el thtiempo e de evaluación. A continuación, se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Junto con el tamaño y la tinción DNA/Ter119 que se utilizan para identificar los eritroblastos ortocromáticas, utilizamos los parámetros "relación de aspecto" de una célula en el canal de campo brillante que ayuda en el reconocimiento de las células alargadas y "centroide Delta XY Ter119/Draq5 "que permite la identificación de los procesos celulares en los que el centro de la tinción Ter119 (reticulocitos naciente) está lejos del centro de la tinción DRAQ5 (núcleo de someterse a extrusión), lo que indica una celda sobre enuclear. El subconjunto de la población de eritroblastos ortocromática con alta centroide delta y baja relación de aspecto es altamente enriquecido en células enucleación.
Introducción
La diferenciación terminal dentro del linaje eritroide en mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación, a través del cual el eritroblasto ortocromática expulsa su núcleo membrana revestida (pyrenocyte) 1, lo que genera un reticulocitos 2. El mecanismo exacto de este proceso, que es también la etapa limitante de la velocidad de éxito, a gran escala, la producción de células rojas de la sangre in vitro, aún no se ha aclarado completamente. La localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación se basa en el uso de microscopía de fluorescencia y electrónica de 3-5. Este proceso ted....
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Protocolo
1. A largo plazo in vitro eritropoyesis Cultura (Ex vivo Eritroides Protocolo Cultura Diferenciación Giarratana et al. 8, Modificado y Adaptado por células de ratón)
Se trata de un largo plazo de 3 pasos en el protocolo de la eritropoyesis vitro. En el primer paso (días 0-4) 2 x 10 5 células / ml se colocan en medio de crecimiento suplementado con eritroblastos de factor de células madre (SCF), interleuquina-3 (IL-3), y la eritropoyetina (EPO). En el segundo paso (días 5-6), las células se resuspendieron a 2 x 10 5 células / ml y se co-cultivaron en células de est....
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Resultados
En primer lugar, las células se analizaron sobre la base de su relación de aspecto de campo claro (la relación de la longitud de su menor en comparación con su eje mayor) y su área de campo claro (indicativo de su tamaño). Los eventos con un valor de campo claro de la zona inferior a 20 y superior a 200 son en su mayoría de los desechos celulares y agregados, respectivamente, y se excluyeron del análisis (Figura 2A). Las células individuales (gate "R1") son luego analizadas en función de su va.......
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Discusión
En los últimos años el estudio de la enucleación eritroblastos ha adquirido cada vez mayor impulso, ya que es el paso en cultivos in vitro de la eritropoyesis en que es más difícil de reproducir de manera eficiente con el fin de lograr éxito, la producción a gran escala de células rojas de la sangre ex vivo. Hasta hace poco, el estudio de la enucleación eritroblasto utilizó la microscopía de fluorescencia, principalmente y citometría de flujo métodos. Métodos de microscopía de fluorescencia, a.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores agradecen al flujo Citometría de Investigación de la Fundación de Niños de Cincinnati Research Hospital y Richard Demarco, Sherree amigo, y Scott Mordecai desde el Amnis Corporation (parte de EMD Milllipore) para el apoyo técnico de expertos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08HL088126 y R01HL116352 (TAK) y DK090971 P30 (YZ).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| y alfa; Medio MEM | CellGro | 15-012-CV | |
| Medio IMDM | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 suplemento nutricional | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Tecnologías | 09500 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicilina/estreptomicina | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamina | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurano) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083 mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (tampón de lisis RBC) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetona | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehído | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hidrocortisona | Sigma | H4001 | |
| Factor de células madre (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleucina-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetina Alfa (Eritropoyetina, EPO) | AMGEN | disponible en farmacia | |
| Anticuerpo CD44-FITC | BD Pharmingen | 553133 | |
| anticuerpo CD71-FITC | BD Pharmingen | 553266 | |
| Anticuerpo Ter119-PECy7 | BD Pharmingen | 557853 | |
| Faloidina-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulina-AF488 | anticuerpo Cell Signaling | #3623 | |
| anti-conejo AF488-anticuerpo secundario | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-conejo AF555-anticuerpo secundario | Invitrogen (Vida Tecnologías) | A21428 | |
| AF594-subunidad B de la toxina del cólera | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| anticuerpo pMRLC (Ser19) | Señalización celular | #3671 | |
| γ-anticuerpo de tubulina | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Sulfato ferroso | Sigma | F7002 | |
| Nitrato férrico | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific BP120500 | ||
| tubos de 15 ml | BD Falcon | 352099 | |
| tubos de 50 ml | BD Falcon | 352098 | |
| placas de 6 pocillos | BD Falcon | 353046 | |
| 24- placas de pocillos | BD Falcon | 351147 | |
| Tubos de flujo | BD Falcon | 352008 | |
| Jeringa de tuberculina | BD | 309602 | |
| Jeringa de insulina | BD | 329461 | |
| Aguja de jeringa 25-G 5/8 | BD | 305122 Tubos | |
| de flujo tapados | BD | 352058 | |
| 40-μ filtro de células m | BD Falcon | 352340 | |
| Bisturí (desechable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Citómetro de flujo Canto | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Citómetro de flujo por imágenes | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Software de exploración y análisis de datos de imagen (IDEAS) versión 4.0 y superior. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Contador de células | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| Serie NAPCO 8000WJ Incubadora | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Beckman | Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Centrífuga de banco | Denville | C0801 |
Referencias
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N.
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Reimpresiones y permisos
