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Evaluar Miogénica Respuesta y Vasoactividad En arterias mesentéricas Resistencia Usando Miografía Presión

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DOI:

10.3791/50997

⸱

6 de julio de 2015

 ,  ,  , 
1Section of Gastroenterology and Hepatology, Georgia Regents University, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Vascular Biology Center, Georgia Regents University

En este artículo

Resumen

Miografía de presión se utiliza para evaluar vasoactividad de las pequeñas arterias que se desarrollan constricción sostenida cuando se presuriza. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para evaluar en segmentos aislados de pequeñas arterias mesentéricas de ratas, vasoactividad y el efecto de la presión intraluminal del diámetro vascular.

Resumen

Arterias de resistencia pequeños constreñir y dilatar, respectivamente, en respuesta a un aumento o disminución de la presión intraluminal; este fenómeno se conoce como respuesta miogénica es un regulador clave del flujo sanguíneo local. En condiciones isobáricas arterias de resistencia pequeños desarrollan sostenidas constricción conocido como tono miogénico (MT), que es un importante factor determinante de la resistencia vascular sistémica (SVR). Por lo tanto, los preparativos ex vivo a presión de las arterias de resistencia pequeñas son las principales herramientas para el estudio de la función microvascular en estados-cerca fisiológica. Para lograr esto, un segmento intacto recién aisladas de una arteria resistencia pequeña (diámetro ~ 260 micras) se monta sobre dos cánulas pequeño de vidrio y presurizado. Estas preparaciones arteriales conservan la mayor parte en las características in vivo y evaluación permiso del tono vascular en tiempo real. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para evaluar vasoactividad en presurizadas pequeñas arterias mesentéricas de resistencia de ratas; estas arterias desarrollanvasoconstricción sostenida - aproximadamente 25% del diámetro máximo - cuando presuriza a 70 mmHg. Estas preparaciones arteriales se pueden utilizar para estudiar el efecto de compuestos en investigación sobre la relación entre la presión intra-arterial y vasoactividad y determinar cambios en la función microvascular en modelos animales de diversas enfermedades.

Introducción

Arterias de resistencia pequeños son los principales determinantes de la SVR y desempeñan un papel importante en la patofisiología de muchas enfermedades 1,2. Condiciones como la diabetes 3, embarazo 4, isquemia-reperfusión 5, la obesidad y la hipertensión 6,7 se asocian frecuentemente con la función microvascular alterado. Miografía vascular no sólo puede proporcionar importantes conocimientos sobre los cambios en la función microvascular en diversas enfermedades, sino también ayudar a identificar dianas terapéuticas y evaluar la eficacia de los compuestos vasoactivos. La función vascular se ha estudiado el uso de pequeñas arterias aisladas en condiciones de buques isométricos o isobáricas 8. Descripción detallada de miografía isométrica se proporciona en otro lugar 9. Sin embargo, hay diferencias en los datos obtenidos a partir de isométrica frente a preparaciones isobáricas 10-12. Desde preparaciones arteriales presurizados permiten el estudio de la función microvascular en condiciones casi fisiológicas, lahallazgos obtenidos pueden correlacionarse mejor con el comportamiento in vivo de la cama vascular 8,13.

En 1902 Bayliss descrita por primera vez el efecto de la presión transmural del diámetro vascular 14. Se observó en pequeñas arterias de resistencia de diversos lechos vasculares de los conejos, gatos y perros que una disminución en la presión fue seguido por la vasodilatación y un aumento en la presión fue seguido por la vasoconstricción. Este fenómeno se conoce como respuesta miogénica. Bayliss y posteriores investigadores observaron que, en condiciones isobáricas arterias pequeña resistencia desarrollan constricción sostenida conocida como MT 15,16. Tanto la respuesta miogénica y MT pueden ser evaluados utilizando miografía presión (PM) técnica. PM se utiliza principalmente para determinar vasoactividad de pequeñas arterias, venas y otros vasos. Además de evaluar el efecto de compuestos vasoactivos en diámetro vascular, PM - como su nombre indica - se utiliza para evaluar ch presión intravascular mediadaanges en el diámetro vascular. Durante las últimas décadas los avances en los programas informáticos, que mejoran la microscopía de vídeo y pipeta de vidrio tirando, han hecho PM más fácil de realizar. Sin embargo, la disección de los segmentos intactos viables de pequeños vasos sanguíneos sigue siendo tedioso ya veces difícil. Aquí describimos un protocolo detallado para estudiar la respuesta miogénica en pequeñas arterias mesentéricas de resistencia aislados de ratas.

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Protocolo

Los ejemplos que se muestran aquí son de experimentos aprobados por IACUC en Georgia Regents de la Universidad - Protocolo nº: # 2011-0408

1. Preparación de los reactivos

  1. Prepare la solución de la disección de almacén: Para 500 ml de solución madre de disección (5x), se disuelven 21,18 g de NaCl, 0,875 g de KCl, 0,739 g MgSO4, 1,049 g MOPS y 0,019 g de EDTA en 450 ml de agua Milli-Q. Ajustar el pH a 7.3 a 7.4 utilizando 1 N NaOH. Completar el volumen hasta 500 ml con agua Milli-Q. Solución de Stock se pueden almacenar hasta 7-10 días. Ver Tabla 1 para una lista de productos químicos y sus proveedores. Ver Tabla 2 para la concentración en mM.
  2. Prepare la solución de la disección de trabajo: Preparar la solución de trabajo de disección fresco todos los días. Por 100 ml de solución de trabajo, se disuelven 0,091 g de glucosa, 0,016 g de NaH 2 PO 4 y 0,022 g de piruvato de sodio en 79,8 ml de agua Milli-Q. Añadir 0,2 ml de 1 M de CaCl2 y 20 ml de solución de disección de acciones a llevar volume a 100 ml.
  3. Preparar una solución salina fisiológica (PSS): Para preparar 1000 ml PSS, disuelven 0,365 g de KCl, NaCl 6,545 g, 0,296 g MgSO4, 0,163 g de KH 2 PO 4, 2,072 g de glucosa, 2,184 g de NaHCO 3 y 2,383 g de HEPES en 950 ml de agua Milli-Q. Ajustar el pH a 7.3 a 7.4 utilizando 1 N NaOH. Completar el volumen a 1000 ml con agua Milli-Q. Retire 2 ml de solución y reemplazarla con 2 ml de 1 M de CaCl2. (Fresh PSS tiene que estar preparado al día)
  4. Preparar calcio (Ca2 +) PSS libre: Para 100 ml PSS sin Ca 2+, se disuelven 0,036 g de KCl, NaCl 0,654 g, 0,029 g MgSO4, 0,016 g de KH 2 PO 4, 0,207 g de glucosa, 0,218 g de NaHCO3, 0.238 g HEPES, 0,015 g EGTA y 0,0026 g Sodio nitroprusiato (SNP) en 95 ml de agua Milli-Q. Ajustar el pH a 7.3 a 7.4 utilizando 1 N NaOH. Completar el volumen hasta 100 ml con agua Milli-Q.

2. Preparación de la Copa cánulas

  1. Tire de pipetas de vidriopara generar los 100 a 150 micras cánulas de punta utilizando un extractor de pipeta según las directrices del fabricante.
  2. Bisel las puntas de la cánula de vidrio utilizando un beveller microelectrodos, fuego pulir ellos y doblar las puntas de la cánula de vidrio por ~ 45 ° utilizando una sonda de calor.
  3. Cargue las cánulas en el soporte micropipeta y adjuntar el soporte micropipeta a la cámara de perfusión.

3. Preparación de cámara de perfusión

  1. Cámara de perfusión Enjuague con agua Milli-Q seguido de solución de disección durante 5 minutos cada uno. Cargar la cámara con 2 ml de solución de disección.
  2. Solución de disección de succión a través de la cánula utilizando 10 ml jeringa y llenar cuidadosamente toda la cánula y el tubo conectado sin burbujas. Aplicar succión suavemente para evitar la generación de burbujas.
  3. Preparar dos suturas con un medio nudo cada uso de fórceps romos. Desde suturas de nylon de monofilamento oftálmicas (10-0, 0,2 métrico) se utilizan para preparar los nudos que son sólo1-2 mm de diámetro, puede ser necesaria microscopio de disección.
  4. La visualización al microscopio de disección, utilizar pinzas de disección para cargar ambas cánulas con nudos de sutura parcialmente cerrados un poco lejos de la punta. Más tarde estos nudos se deslizaron con cuidado sobre los extremos arteriales canulados y cerraron por completo.

4. Recolección de la arteria mesentérica Arcade de ratas Sprague-Dawley

  1. Buscar la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional local (IACUC) antes de realizar estos experimentos. Animales de la vivienda en las instalaciones de animales con temperatura controlada y la iluminación y permitir el libre acceso a agua y una comida para roedores comercial.
  2. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Confirmar profunda anestesia por toe-pinch y si Administrar necesaria anestésicos adicionales.
  3. Después de confirmar la anestesia quirúrgica, la eutanasia a los animales por decapitación. Siga las directrices AAALAC para utilizing métodos apropiados para la eutanasia de animales.
  4. Use una tijera de disección y una pinza para realizar una laparotomía línea media de la pelvis al esternón. Esto se hace en dos pasos: primero, haga una incisión en la piel y segundo, haga una incisión de la capa muscular subyacente. Se debe tener cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales.
  5. Cortar el extremo proximal del intestino cerca del píloro y el extremo distal cerca de la unión íleo-cecal. Tie ambos extremos por separado para evitar la fuga de quimo y las heces, evitando así la contaminación de solución de baño extracelular. Incisión en el mesenterio en su base, cerca de la alimentación vasculatura es decir, la arteria mesentérica superior y la transferencia de todo el intestino cama mesentérica intestinal a un vaso de precipitados de 50 ml que contenía solución de disección enfriado con hielo.
  6. Permita tejido recogido de alojarse en el hielo solución de disección fría durante 5 minutos y enjuague con solución disección fresca para deshacerse de la sangre.

5. El aislamiento y la canulación de 4º Solicitar mesentérica arteria

  1. Pin hacia abajo el extremo proximal del intestino en el lado de la mano derecha en un plato Sylgard recubiertos. Extender el intestino restante en un camino en sentido antihorario, el fijar el segmento hacia abajo para difundir el mesenterio y la exposición de los vasos sanguíneos (Figura 1). Nota: Nos aislamos segmentos arteriales a temperatura ambiente. De lo contrario ponemos la arcada mesentérica contiene plato en hielo. Algunos laboratorios, incluidos los que en nuestra institución, utilizan unidades de refrigeración para diseccionar las arterias a 4 ° C.
  2. Bajo el microscopio zoom estéreo diseccionar 3 ° y 4 ° de orden pequeñas arterias mesentéricas (~ 260 m) paralela al intestino delgado utilizando unas tijeras pequeñas. Primero diseccionar toda la grasa de cobertura. Entonces diseccionar la vena y aislar la arteria con punto de bifurcación en forma de V. Tenga cuidado de no perforar el segmento seleccionado. Iniciar la disección de la grasa cerca de una rama para 2º y encontrar la manera de 3º o 4º ordvasos er.
    1. Nota: Las arterias y las venas se pueden distinguir en función de su espesor de pared - pared arterial es más gruesa que la de la vena. Además, cuando contiguo tejido conectivo se tira suavemente perpendicular a los vasos, venas colapso fácilmente mientras que las arterias no. Desde arterias con diámetro de la luz <400 micras son los principales sitios de la resistencia vascular sistémica, para este protocolo que utilizamos 4º arterias mesentéricas fin de rata (diámetro de la luz <300 micras).
  3. Aislar una sección de 4-5 mm de la arteria paralelo al intestino delgado. Visualice todas las 5 ramas de orden ª incrustación en el intestino delgado y se cortan un poco lejos del origen de las ramas y preservar una parte. Estas porciones conservadas de ramas sirven como sitios de la celebración (con unas pinzas de disección) para transferir segmentos arteriales a una cámara de perfusión y, posteriormente guiar su canulación.
  4. A continuación, corte los segmentos arteriales al hacer 2 incisiones distallas ramas de orden 5 th en cada lado de la arteria y transferirla a la cámara de perfusión (véase la Figura 1C y la leyenda).
  5. Canular un extremo de los vasos en una de micropipeta de vidrio (diámetro: 100-150 micras) utilizando pinzas de disección mediante la celebración de las puntas del segmento arterial con unas pinzas de disección. Deslice la sutura parcialmente cerrada previamente cargado en el extremo canulado y asegurarla. Nota: El extremo proximal de la arteria puede ser una cánula en la cánula de vidrio que está conectado al dispositivo de regulación de presión servo-controlado para imitar entorno in situ.
  6. Adjuntar una solución disección cargado 10 ml jeringa para la llave de paso conectado a esta cánula de tal manera que la solución disección en el tubo de conexión de la cánula y se fusiona con llave de paso que en la jeringa. Levantar suavemente la jeringa. La fuerza gravitatoria sobre la solución eliminará la sangre vascular intra desde el extremo abierto del recipiente. Después de retirar la sangre intra-arterial, Cierre la llave de paso.
    Nota: Como alternativa, coloque la llave de paso para el controlador de presión, encenderlo y aumentar suavemente la presión de 5-10 mm Hg para conseguir el mismo resultado.
  7. Ate el extremo distal de los vasos sobre una segunda cánula de vidrio trayendo cuidadosamente la otra cánula tan cerca como sea posible del extremo desatado del segmento arterial. Deslice la sutura parcialmente cerrada previamente cargado en el extremo canulado y asegurarla. Se debe tener cuidado no tirar o tirar de los segmentos arteriales. Asegúrese de que las llaves de paso unidas a ambas cánulas están cerrados.
  8. Traslado cámara de perfusión a la etapa de microscopio invertido equipado con grabación de vídeo en directo.
  9. Conectar la llave de paso de la cánula atada al extremo proximal del segmento arterial a un dispositivo de regulación de presión servo-controlado y asegúrese de que la llave de paso unido a la otra cánula permanece cerrada para mantener la presión intraluminal estable.
  10. A continuación, conecte el tubo de vacío al puerto de succión de unaencontrar la perfusión tubería al puerto de la perfusión de la cámara.
    Nota: el puerto de aguja biselada se utiliza para la aspiración y el puerto aguja roma para la perfusión.
  11. Iniciar la perfusión del recipiente con PSS caliente a través del calentador solución en línea única (37 ° C, equilibrada con mezcla de gas: 5% de CO 2, 5% O 2 y 90% de N para mantener el pH neutro y una oxigenación adecuada 17) en 2 ml / min utilizando una bomba peristáltica. Gire el vacío también. Coloque un termistor en la cámara para controlar la temperatura continuamente.
  12. Como la temperatura del PSS en la cámara se acerca a ~ 37 ° C (generalmente dentro de 5 min), aumentar lentamente la presión intraluminal de 20 a 100 mmHg y comprobar si hay fugas de los vasos. Esto se hace usando el ajuste automático de la presión del regulador de presión. Deseche los vasos con fugas y reemplazar con otro segmento. Los vasos con fugas no será capaz de mantener la presión.
  13. Evaluar el segmento arterial para curvas mientras se mantiene la presión a 100 mmHg.Utilizando el tornillo de la palanca, mueva la cánula para enderezar el segmento arterial. No más de estirar los segmentos arteriales; el objetivo es imitar en la longitud del segmento arterial vivo.
  14. Reducir la presión a 70 mmHg (para imitar la presión en vivo en la arcada mesentérica 18) y permitir que el segmento arterial para estabilizar y desarrollar tono miogénico. Las arterias pueden estar presurizados de forma variable (40-70 mmHg) de acuerdo con la estrategia experimental y lecho vascular. Una revisión publicada anteriormente proporciona una excelente revisión de la variabilidad en MT en segmentos arteriales de diferentes lechos vasculares 8.

6. Medición de diámetro arterial

  1. Ver arterias en objetivo 10x en un microscopio equipado con una cámara de dispositivo de carga acoplada de vídeo monocromo. Mida el diámetro luminal mediante capturadora de video y sistema de detección de bordes en tiempo real. Una lista de los equipos utilizados se proporciona en la Tabla 3.
  2. Monitorear y buque registro diameter continuamente.
  3. Observar para el desarrollo de la MT. Nota: Hemos observado que en las arterias mesentéricas de resistencia de ratas, a los 70 mmHg, desarrollo de MT se caracteriza por ~ 20% de disminución en el diámetro. MT varía según la especie de cama y animales vasculares.
  4. Confirmar la viabilidad vascular mediante la evaluación de las respuestas vasoconstrictoras y vasodilatadoras a 1 M fenilefrina (Phe) y 1 M de acetilcolina (ACh).
  5. Al final de cada experimento, determinar el diámetro pasiva (PD) mediante la incubación de las arterias en Ca 2 + libre de PSS por 20 min.

7. Respuesta Miogénica

  1. Reducir la presión a 20 mm Hg y permitir que el diámetro se estabilice. Aumentar la presión intraluminal en pasos incrementales (20, 40, 60, 80 y 100) y en cada etapa de presión permiten arterias para lograr un diámetro estable (normalmente dentro de 5 min).
  2. Reducir la presión intraluminal a 20 mmHg e incubar el segmento arterial en Ca 2 + libre PSS contiene 0,39 mMSNP mM EGTA y 0,1. Permitir que el diámetro arterial para estabilizar (por lo general 15 min).
  3. Repetir la respuesta de la presión a paso en Ca 2 + libre PSS contiene 0,39 mM EGTA y 0,1 mM SNP.

8. Interpretación de los resultados y cálculo de los datos

  1. Calcular la MT como la diferencia porcentual de diámetro observado para el Ca 2 + que contienen frente a Ca 2 + libre PSS en cada presión según la siguiente cálculo:
    figure-protocol-1
  2. Para arterias sometidos vasomoción el diámetro puede calcularse promediando la fase de meseta durante 1 min. Expresar los datos recogidos como por ciento de relajación máxima (% PD) de acuerdo con la relación:% de Pd = 100 x [Dd / PD]; Delta d es la diferencia entre el diámetro antes y después de la adición de cualquier compuesto en investigación (por ejemplo, Phe); PD es el diámetro pasiva (también eldiámetro máximo).

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Resultados

Representación esquemática de un myograph presión típica configuración se muestra en la Figura 1. Los dos extremos de la embarcación se canulan con una micropipeta de vidrio y se aseguran con suturas en ambos lados. Via tubería y una llave de paso abierto, una cánula está conectado a un regulador de presión servo-controlado; la otra cánula está conectado a una llave de paso cerrada. La cámara se perfundió con son observados por un microscopio invertido conectado a una cámara CCD PSS y diámetro vascular ...

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Discusión

Pasos crítico, solución de problemas y modificaciones

En una preparación típica embarcación isobárica, la arteria se presuriza a 70 mmHg entre dos cánulas de vidrio perfundidos con agua tibia (37 ° C) PSS. Después de 30-45 min, arterias desarrollan MT, caracterizado por disminución espontánea de diámetro que se estabiliza en 20-30 min. Las arterias de resistencia de varios lechos vasculares desarrollan MT variable. Por ejemplo la resistencia de rata arterias mesentéricas desarrollan MT ~ 25% de...

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Divulgaciones

Autores no tienen conflictos financieros.

Agradecimientos

Sandeep Khurana está apoyado por el NIH (K08DKO81479). Vikrant Rachakonda es apoyado por (T32DK067872).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Químico
AcetilcolinaSigma AldrichA6625
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma Aldrich223506
D-(+)-GlucosaSigmaAldrich G5767
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)Sigma AldrichE3889
Etileno diamina ácido tetraacético (EDTA)Sigma AldrichE9884
HEPESSigma AldrichH3784
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma AldrichM7506
MOPSSigma AldrichM5162
FenilefrinaSigma AldrichP6126
Cloruro de potasio (KCl)Sigma AldrichP3911
Fosfato de potasio (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
Bicarbonato de sodio (NaHCO3 )Sigma AldrichS6014
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma AldrichS7653
Hidróxido de sodio (NaOH)Sigma AldrichS5881
Nitroprusiato de sodioSigma Aldrich13451
Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH2PO4)Sigma AldrichS9638
Piruvato de sodioSigma AldrichP8574
Table 1.
2
Solución salina fisiológica (1.000 ml) mM
KCl4.90.365 g
NaCl1126.545 g
MgSO4.7H2O1.20.296 g
KH2PO41.20.163 g
Glucosa11.52.072 g
NaHCO3262.184 g
HEPES102.383 g
CaCl2 22 ml (stock de 1M)
Agua desionizada998 ml
Ca2+ solución salina fisiológica libre (100 ml) mM
KCl4.90.036 g
NaCl112 0,645 g
MgSO4.7H2O1.20.029 g
KH2PO4 1.2 0.016 g
Glucosa11.50.207 g
NaHCO326 0,218 g
HEPES100,238 g
EGTA 0,390,015 g
Nitroprusiato de sodio 0.10.0026 g
Agua desionizada100 ml
solución de disección, culata (500 ml) mM
NaCl14521.18 g
KCl4.70,875 g
MgSO41.20.739 g
MOPS21.049 g
EDTA0.020.019 g
Agua desionizada500 ml
Solución de disección de trabajo (100 ml) mM
solución de disección20 ml
Glucosa1.20.091 g
NaH2PO450.016 g
Piruvato de sodio20.022 g
20.2 ml (stock de 1M)
Agua desionizada79.8 ml
<> < tr> < td>CaCl
Table 2. Composición de las soluciones
Equipment
CCD Monochrome CameraLa fuente de imágenesDMK 21AU04
Calentador de solución en línea simpleWarner Instruments64-0102
TermistorWarner Instruments64-0108
Controlador de temperatura automático dualWarner InstrumentsTC-344B
Extractor de micropipetas Flamígero/MarrónSutter InstrumentsP-97
Interfaz del sistema de fluorescenciaIonOptixmodelo FSI-700
Pinzas y tijeras World Precision Instruments
Ion Wizard-Core y análisisIonOptixIon Wizard 6.0
Tubo de laboratorioSilastic508-005
Rata macho Sprague Dawley HarlanLaboratories
Master flex console driveCole-parmer
Milli-Q Plus Sistema de agua ultrapuraMilliporeZD5211584
Sutura de nailon monofilamento oftálmico Ethicon9007G
Microscopio de fotometría y dimensionamientoMoticAE31
Servocontrolador de presión con bomba peristáltica y transductor de presiónInstrumentación de Living SystemsPS-200
Microscopio estereoscópicoNikon Instruments IncSMZ660
Cámara de recipienteInstrumentación de sistemas vivosCH-1
Plato de disecciónInstrumentación de sistemasvivos DD-90-S
Capilares de vidrio de pared delgadaWorld Precision InstrumentsTW120-6
MicroforgeStoelting51550
Table 3.
experimentales

Referencias

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